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专利名称：一种利用显色反应检测原料乳中三聚氰胺的方法
技术领域：
本发明涉及一种三聚氰胺的检测方法，尤其涉及一种原料乳中三聚氰胺的检测方法，属于分析化学领域。
背景技术：
三聚氰胺(melamine)是一种重要的氮杂环有机化工原料，具有一定的肾毒性。由于三聚氰胺分子中含有大量的氨基氮，含氮量达66%，是蛋白质含氮量的四倍多，同时具有较好的稳定性，在原乳液加工过程中难以分解，并且尚无常规分析手段检测其存在，所以极少数不法分子在原料乳中添加三聚氰胺粉以获得虚假的蛋白质含量，造成原料乳中的三聚氰胺污染残留在原乳液中。三聚氰胺残留量的常规检测方法有两种，一种是色谱分析，如高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱/质谱法(LC/MS)、液相色谱串联质谱法(LC/MSMS)，这种方法对检材和检测人员技能要求较高，样品前处理和提纯过程费时耗力；另一种方法为免疫学方法，如酶联免疫吸附法(ELISA)，这种方法检测时间长，费用较高。目前关于三聚氰胺检测方法的专利申请研究有很多，如专利申请号为200810202732. 3的一种检测三聚氰胺的酶联免疫试剂盒及方法，专利申请号为200910060513.0的一种三聚氰胺胶体金免疫层析检测试纸及制备方法，专利申请号为200910061638. 5的一种快速检测三聚氰胺含量的ELISA试剂盒及其方法，专利申请号为200910085644.4的一种三聚氰胺半抗原与抗原及其制备方法与应用，专利申请号为200910107544.7的一种三聚氰胺快速检测试剂盒及其检测方法，专利号为US20110069308A1的专利提供了 一种三聚氰胺的检测和定量方法。

发明内容
本发明提供了一种利用显色反应检测原料乳中三聚氰胺的方法。所述的检测方法具有条件简单，设备易得，回收率良好，实用性强，结果准确的优点，是一种低成本检测的方法。本发明所述的检测方法包括以下两个步骤使用蛋白沉淀剂、三聚氰胺提取剂对原料乳进行预处理得到三聚氰胺纯化液和纯化液在显色板上使用显色反应定性或者定量测定原乳液中的三聚氰胺含量。所述的使用蛋白沉淀剂、三聚氰胺萃取剂对原料乳进行预处理得到三聚氰胺纯化液的方法为在比色管中加入一定体积的原料乳，再加入一定体积的蛋白沉淀、三聚氰胺提取剂，混合均匀，超声振荡、离心，然后用注射器吸取上层清液，得到萃取液，将萃取液转移至用3mL甲醇和3mL水活化过的阳离子交换树脂固相萃取柱中。依次用3mL的O. lmol/L盐酸和3mL的甲醇洗涤，抽至近干。用洗脱液洗脱，制得纯化液。所述的蛋白沉淀剂、三聚氰胺萃取剂为三氯乙酸或乙腈，三氯乙酸或乙腈均是良好的蛋白沉淀剂和三聚氰胺提取剂。优选乙腈作为蛋白质沉淀剂和三聚氰胺萃取剂，这主要是因为通过三氯乙酸和乙腈的对比发现，乙腈的腐蚀性和气味都较小。原乳液中除了碳水化合物、蛋白质、脂肪等主要组分外，还有一些微量成分，如核苷酸、维生素类、矿物质等，其中有些组分可以被乙腈溶液提取。因此需要对沉淀后的提取液进一步纯化，分离可能的干扰物质。所述的阳离子交换树脂固相萃取柱为亲水-亲脂混合型强阳离子交换固相萃取柱，强阳离子交换固相萃取柱的阳离子功能团一般为苯磺酸基，属于强阳离子交换功能团，在任何PH条件下都呈带负电荷的阴离子，因此只要控制样品溶液的pH使三聚氰胺呈阳离子状态，就能被苯磺酸基通过离子交换方式吸附，因此选择强阳离子交换固相萃取柱即可，优选提取生物碱专用强阳离子 交换树脂，特别是西安电力树脂厂生产的C008或C004生物碱提取专用树脂。所述的洗脱液使用甲醇-5%氨水溶液，也被称作5%氨水甲醇溶液。所述的显色板的制备硅胶板在105°C下活化30min，用毛细管点样，干燥后将硅胶板放入氯气环境中一定时间，将显色剂喷雾到硅胶板上显色。所述的使用显色反应定量或者定性测定原乳液中的三聚氰胺含量的原理为三聚氰胺可以和氯气反应生成氯代三聚氰胺，氯代三聚氰胺与碘化钾反应可以生成碘，碘能使淀粉显示棕色。所述的使用显色反应定量测定原乳液中的三聚氰胺含量的方法为用薄层色谱扫描仪扫描各点的积分光密度，根据积分光密度(IOD)与三聚氰胺的质量关系对三聚氰胺进行定量检测。所述的使用显色反应定量测定原乳液中的三聚氰胺含量的方法还可以为用平板扫描仪扫描硅胶板，得到扫描图片。用图像处理软件处理图片，统计各点的积分光密度，根据积分光密度(IOD)与三聚氰胺的质量关系对三聚氰胺进行定量检测。其进一步特征在于蛋白沉淀剂、三聚氰胺萃取剂的用量所述的蛋白质沉淀剂和三聚氰胺萃取剂为乙腈。本专利申请进行了蛋白沉淀剂、三聚氰胺萃取剂的用量对于萃取效果的研究，在三聚氰胺含量为100mg/L的IOmL原乳液样品中分别加入IOmL, 15mL, 20mL, 25mL乙腈,超声5min, 4000r/min离心5min,然后用注射器抽取上层萃取液，用乙腈定容至20mL，调pH值为5。测定萃取液的紫外吸收光谱如

图1所示。结果发现乙腈加入量在15mL 25mL之间时,250nm附近三聚氰胺萃取效果基本一致,但是270nm附近的杂质萃取率逐渐增加。因此所述所述的蛋白质沉淀剂和三聚氰胺萃取剂即乙腈的加入量为15mL 25mL/10mL原乳液，特别优选的，乙腈的加入量为15mL/10mL原乳液，即乙腈和原乳液样品的体积比为1.5 I。待纯化液制备方法的选择高效液相色谱法和液相色谱-质谱法都是采用离心上清液滤纸过滤制得待净化液。待净化液经过固相萃取柱，过O. 2μπι有机相微孔滤膜后，供HPLC或LC-MS。气相色谱-质谱联用法采用离心上清液过固相萃取柱后用O. 2 μ m有机相微孔滤膜过滤。实验中使用微孔滤膜的主要目的是保护色谱柱，另外实验发现使用注射器抽取离心上清液可以得到澄清溶液，增加微孔滤膜过滤对溶液澄清程度无明显影响。本专利申请从成本和时间角度考虑，采用注射器抽取离心上清液，实验发现4000r/min离心5min就可以得到澄清溶液。固相萃取柱的条件每次取纯化液3ml加到已经用甲醇和水活化的阳离子交换固相萃取柱(西安电力树脂厂生产的C008生物碱提取专用树脂4ml)中，测定吸附后溶液的紫外可见吸收光谱，参比为60%乙腈水溶液。实验发现当滤液达到30ml时曲线无明显变化，表明树脂没有达到始漏量，即交换当量符合要求。每次取3ml洗脱液加到阳离子交换固相萃取柱中洗脱三聚氰胺，用甲醇做参比测定吸收光谱，直到曲线平稳为止，得到如图2的紫外光谱图。由图2可以发现，当洗脱液用量达到9ml时吸收曲线基本平稳，表明三聚氰胺已经基本被洗脱。显色体系的选择洗脱后的三聚氰胺使用显色反应检测。本专利申请选择三聚氰胺与氯气的氧化产物和KI的显色反应作为显色反应体系。显色反应的原理如下
权利要求
1.一种利用显色反应检测原料乳中三聚氰胺的方法，其特征在于所述的方法包括以下两个步骤使用蛋白沉淀剂、三聚氰胺提取剂对原料乳进行预处理得到三聚氰胺纯化液； 纯化液在显色板上使用显色反应定性或者定量测定牛奶中的三聚氰胺含量。
2.根据权利要求1所述的利用显色反应检测原料乳中三聚氰胺的方法，其特征在于所述的使用蛋白沉淀剂、三聚氰胺萃取剂对原料乳进行预处理得到三聚氰胺纯化液的方法为在比色管中加入一定体积的原料乳，再加入一定体积的蛋白沉淀、三聚氰胺提取剂，混合均匀，超声振荡、离心，然后吸取上层清液，得到萃取液，将萃取液转移至用3mL甲醇和 3mL水活化过的阳离子交换树脂固相萃取柱中。依次用3mL的O. lmol/L盐酸和3mL的甲醇洗涤，抽至近干，用洗脱液洗脱，制得纯化液。
3.根据权利要求1所述的利用显色反应检测原料乳中三聚氰胺的方法，其特征在于所述的蛋白沉淀剂、三聚氰胺萃取剂为乙腈，乙腈的加入量为15mL 25mL/10mL原料乳。
4.根据权利要求1所述的利用显色反应检测原料乳中三聚氰胺的方法，其特征在于所述的显色反应的方法是先将硅胶板在105°C下活化30min，用毛细管点样，干燥后将硅胶板放入氯气环境中一定时间，将显色剂喷雾到硅胶板上显色。
5.根据权利要求1所述的利用显色反应检测原料乳中三聚氰胺的方法，其特征在于所述的使用显色反应定量测定牛奶中的三聚氰胺含量的方法为用薄层色谱扫描仪扫描各点的积分光密度，根据积分光密度与三聚氰胺的质量关系对三聚氰胺进行定量检测。
6.根据权利要求1所述的利用显色反应检测原料乳中三聚氰胺的方法，其特征在于所述的使用显色反应定量测定牛奶中的三聚氰胺含量的方法为用平板扫描仪扫描硅胶板， 得到扫描图片。用图像处理软件处理图片，统计各点的积分光密度，根据积分光密度与三聚氰胺的质量关系对三聚氰胺进行定量检测。
7.根据权利要求2所述的使用蛋白沉淀剂、三聚氰胺萃取剂对原料乳进行预处理得到三聚氰胺纯化液的方法，其特征在于采用注射器抽取离心上清液。
8.根据权利要求2所述的使用蛋白沉淀剂、三聚氰胺萃取剂对原料乳进行预处理得到三聚氰胺纯化液的方法，其特征在于所述的超声时间为5min。
9.根据权利要求2所述的使用蛋白沉淀剂、三聚氰胺萃取剂对原料乳进行预处理得到三聚氰胺纯化液的方法，其特征在于所述的离心条件为4000r/min离心5min。
10.根据权利要求2所述的阳离子交换树脂固相萃取柱，其特征在于所述的阳离子交换树脂固相萃取柱为亲水-亲脂混合型强阳离子交换固相萃取柱，优选提取生物碱专用强阳离子交换树脂，特别是西安电力树脂厂生产的C008或C004生物碱提取专用树脂。
全文摘要
本发明涉及一种利用显色反应检测原料乳中三聚氰胺的方法，包括以下两个步骤使用蛋白沉淀剂、三聚氰胺提取剂对原料乳进行预处理得到三聚氰胺纯化液和纯化液在显色板上使用显色反应定性或者定量测定原乳液中的三聚氰胺含量。本发明所述的检测方法具有条件简单，设备易得，回收率良好，实用性强，结果准确的优点，是一种低成本检测的方法。
文档编号G01N21/78GK102998305SQ20111029028
公开日2013年3月27日 申请日期2011年9月19日 优先权日2011年9月19日
发明者孙锡泉, 王宗花, 孔令乐, 张立新, 梁玉超 申请人:青岛大学