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一种免疫磁珠及其在检测玉米赤霉烯酮中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种免疫磁珠及其在检测玉米赤霉烯酮中的应用，本发明免疫磁珠上偶联有玉米赤霉烯酮单克隆抗体。本发明免疫磁珠在检测玉米赤霉烯酮中具体的应用方法为：将免疫磁珠与待测样品溶液、PBS缓冲液混匀，室温振荡反应，使抗体与抗原充分结合；再加入酶标单抗，室温振荡反应，使酶标单抗与抗原充分结合；沉淀免疫磁珠，去除液体，将免疫磁珠洗涤干净加入AMPPD溶液混匀，检测发光强度，根据发光强度判断样品中玉米赤霉烯酮的含量。本发明免疫磁珠检测玉米赤霉烯酮灵敏高、特异高、线性宽、检测时间短。
【专利说明】一种免疫磁珠及其在检测玉米赤霉烯酮中的应用

【技术领域】
[0001]本发明涉及一种免疫磁珠及其在检测玉米赤霉烯酮中的应用。

【背景技术】
[0002]玉米赤霉烯酮(Zearalenone, ZEN),又称F2毒素，是由禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)等镰刀菌产生的一种雌激素类真菌毒素。其化学式为6 (10-羟基-6氧基-十一碳烯基)β -雷羧酸内酯，分子量为318，化学结构式如I所示。它广泛存在于霉变的玉米、高粱、小麦、燕麦、大麦等谷物作物以及奶制品中。玉米赤霉烯酮可引起动物和人的雌激素过多综合症，还具有生殖发育毒性、免疫毒性、基因毒性和可疑致癌性等。饲料和食品生产中所用的谷物是ZEN产生的最好基质，其次为豆类及其制品，因此，ZEN给畜牧业带来很大的经济损失。
[0003]目前关于玉米赤霉烯酮的检测存在以下缺点:1、价格昂贵，专业的技术人员进行检测；2、检测方法的线性窄、检测时间长；3、成本高、灵敏度低、操作繁琐；因此研究一种高灵敏、高特异、线性宽、检测时间短的玉米赤烯酮检测方法已迫在眉睫。


【发明内容】

[0004]本发明的目的在于提供一种免疫磁珠。
[0005]本发明的另一目的在于提供该免疫磁珠在检测玉米赤霉烯酮中的具体应用方法。
[0006]本发明所采取的技术方案是:
一种免疫磁珠，该免疫磁珠上偶联有玉米赤霉烯酮单克隆抗体。
[0007]上述免疫磁珠在检测玉米赤霉烯酮中的应用，其具体的应用方法包括以下步骤:
1)将免疫磁珠与待测样品溶液、PBS缓冲液混匀，室温振荡反应，使免疫磁珠上的抗体与玉米赤霉烯酮抗原充分结合；
2)将上述反应液中加入碱性磷酸酶标记的玉米赤霉烯酮单克隆抗体，室温振荡反应，使酶标单抗与抗原充分结合；
3)将2)中的反应体系置于磁性分离器上，使免疫磁珠沉淀，去除液体，将免疫磁珠洗涤干净，除净残液，加入ΑΜΡΗ)溶液混匀，室温放置进行发光反应，检测发光强度，根据发光强度判断样品中玉米赤霉烯酮的含量。
[0008]进一步的，上述步骤I)中免疫磁珠与样品溶液、PBS缓冲液体积比为30:30:200。
[0009]进一步的,上述步骤I)中所述振荡反应的时间为30min。
[0010]进一步的，上述步骤2)中所述碱性磷酸酶标记的玉米赤霉烯酮单克隆抗体与免疫磁珠的体积比为1:1。
[0011]进一步的，上述步骤2)中所述室温振荡反应时间为20min。
[0012]进一步的,上述步骤3)中所述发光反应时间为30min。
[0013]本发明的有益效果是:
I)本发明直接利用AMPro新型发光试剂，对玉米赤霉烯酮进行检测，建立了一种新的化学发光磁酶免疫分析方法。
[0014]2)利用本发明免疫磁珠检测玉米赤霉烯酮，灵敏高、特异高、线性宽、检测时间短。

【专利附图】

【附图说明】
[0015]图1为不同免疫磁珠用量的检测效果；
图2为不同的免疫磁珠与抗原反应时间的检测效果；
图3为不同ALP-玉米赤霉烯酮单克隆抗体用量的检测效果；
图4为不同的ALP-玉米赤霉烯酮单克隆抗体与抗原反应时间的检测效果；
图5为不同发光反应时间的检测效果；
图6为本发明免疫磁珠检测玉米赤霉烯酮的标准曲线。

【具体实施方式】
[0016]下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0017]实施例1免疫磁珠的制备方法
I)磁珠的醛基化:将10.0mg带有氨基修饰的磁珠用戊二醛活化，使磁珠醛基化。
[0018]2)单抗活化磁珠:取上述醒基化的磁珠与0.50 mg玉米赤霉烯酮单克隆抗体,50mLVBS缓冲液混合，室温振荡2?4h，再将磁珠用PBS洗涤干净，重悬于1%牛血清白蛋白溶液(W/V)进行封闭，4°C保存，即可。
[0019]上述抗体与磁珠反应后,溶液中还剩0.1lmg玉米赤霉烯酮单克隆抗体，由此可知磁珠结合玉米赤霉烯酮单克隆抗体的能力为0.39 mg/mg。
[0020]实施例2本发明免疫磁珠在检测玉米赤霉烯酮中的应用
1)在取30μ L实施例1中制备的免疫磁珠和30 μ L待测样品、200 μ L PBS缓冲液混匀，室温振汤30min ；
2)将上述反应液中加入15μ L ALP (碱性磷酸酶)标记的玉米赤霉烯酮单克隆抗体，室温震动20min ；
3)将反应后的免疫磁珠置于磁性分离器上沉淀2min，将去除液体，用洗涤液将免疫磁珠洗涤干净，将残液拍干，加10 μ L AMPPD溶液混匀室温放置30min进行发光反应，检测发光强度，根据发光强度判断样品是否含有玉米赤霉烯酮。
[0021]实施例3免疫磁珠的最佳用量
参照实施例2所述的方法对玉米赤霉烯酮标准样品液(玉米赤霉烯酮浓度为lmg/L)进行检测，免疫磁珠的用量分别设为0、5、10、15、30、40、60μ L，其他参数条件均与实施例2 —致。检测结果显示(如图1所示)，当免疫磁珠的用量为15?40 μ L，相对发光强度较高，尤其是当免疫磁珠的用量为30 μ L时，检测效果最佳，故免疫磁珠的最佳用量为30 μ L。
[0022]实施例4免疫磁珠与抗原的最佳反应时间
参照实施例2所述的方法对玉米赤霉烯酮标准样品液(玉米赤霉烯酮浓度为lmg/L)进行检测，免疫磁珠与抗原的反应时间分别设为2、5、10、20、30、60min，其他参数条件均与实施例2 —致。检测结果显示(如图2所示)，当反应时间为20?60min时，相对发光强度较高，尤其是当免疫磁珠与抗原的反应30min时，检测效果最佳，故免疫磁珠与抗原的最佳反应时间为30min。
[0023]实施例5 ALP-玉米赤霉烯酮单克隆抗体的最佳用量
参照实施例2所述的方法对玉米赤霉烯酮标准样品液(玉米赤霉烯酮浓度为lmg/L)进行检测，ALP-玉米赤霉烯酮单克隆抗体的用量分别设为0、5、10、15、20、30、40yL，其他参数条件均与实施例2 —致。检测结果显示(如图3所示)，当ALP-玉米赤霉烯酮单克隆抗体的用量为15?40 μ L，相对发光强度较高，尤其是用量为30?40 μ L时，检测效果最佳，但15?30 μ L单抗的检测效果与30?40 μ L的效果相差较小，故综合检测效果和成本问题，选用15 μ L作为ALP-玉米赤霉烯酮单克隆抗体的最佳用量。
[0024]实施例6 ALP-玉米赤霉烯酮单克隆抗体与抗原的最佳反应时间
参照实施例2所述的方法对玉米赤霉烯酮标准样品液(玉米赤霉烯酮浓度为lmg/L)进行检测，ALP-玉米赤霉烯酮单克隆抗体与抗原的反应时间分别设为2、5、10、20、30、60min，其他参数条件均与实施例2 —致。检测结果显示(如图4所示)，当反应时间为20?60min时，相对发光强度较高，尤其是当ALP-玉米赤霉烯酮单克隆抗体与抗原的反应20min和60min时，检测效果最佳，但考虑到时间成本，故ALP-玉米赤霉烯酮单克隆抗体与抗原的最佳反应时间为20min。
[0025]实施例7最佳发光反应时间
参照实施例2所述的方法对玉米赤霉烯酮标准样品液(玉米赤霉烯酮浓度为lmg/L)进行检测，发光反应时间分别设为0、l、3、5、10、20、30、40、50、60、65min，其他参数条件均与实施例2 —致。检测结果显示(如图5所示)，当反应时间为30?65min时，相对发光强度最佳，但考虑到时间成本，故选用30min作为最佳发光反应时间。
[0026]实施例8本发明检测方法的灵敏度
将玉米赤霉烯酮标准品稀释为 0.lng/kg、0.5ng/kg、lng/kg、1.5ng/kg、2ng/kg、3ng/kg、4ng/kg、5ng/kg共8个不同浓度,参照实施例2的方法检测发光强度,制作标准曲线。
[0027]标准曲线如图6所示，标准曲线方程为Y=0.0037X+4.3X 103，R2=0.982，线性范围为0.20ng/kg?4ng/kg ;故本发明免疫磁珠检测玉米赤霉烯酮的检测限(灵敏度)达
0.20ng/kg。
【权利要求】
1.一种免疫磁珠，其特征在于:该免疫磁珠上偶联有玉米赤霉烯酮单克隆抗体。
2.权利要求1所述免疫磁珠在检测玉米赤霉烯酮中的应用。
3.根据权利要求1所述的所述的应用，其特征在于:具体的应用方法包括以下步骤: 1)将权利要求1所述的免疫磁珠与待测样品溶液、PBS缓冲液混匀，室温振荡反应，使免疫磁珠上的抗体与玉米赤霉烯酮抗原充分结合； 2)将上述反应液中加入碱性磷酸酶标记的玉米赤霉烯酮单克隆抗体，室温振荡反应，使酶标单抗与抗原充分结合； 3)将2)中的反应体系置于磁性分离器上，使免疫磁珠沉淀，去除液体，将免疫磁珠洗涤干净，除净残液，加入AMPPD溶液混匀，室温放置进行发光反应，检测发光强度，根据发光强度判断样品中玉米赤霉烯酮的含量。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于:步骤I)中免疫磁珠与样品溶液、PBS缓冲液体积比为30:30:200o
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于:步骤I)中所述振荡反应的时间为30min。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于:步骤2)中所述碱性磷酸酶标记的玉米赤霉烯酮单克隆抗体与免疫磁珠的体积比为1:1。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于:步骤2)中所述室温振荡反应时间为20mino
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于:步骤3)中所述发光反应时间为30min。
【文档编号】G01N33/577GK104198711SQ201410422038
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月25日 优先权日:2014年8月25日
【发明者】罗胜军 申请人:广东省农业科学院动物卫生研究所