专利名称：酶联免疫测定中的四甲基联苯胺贮液的制作方法
技术领域：
本发明涉及酶联免疫测定中的一种底物贮液，特别涉及一种酶联免疫测定中的四甲基联苯胺贮液。
背景技术：
在酶联免疫检测中，目前国内外使用最多的酶底物是邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)。邻苯二胺着色背景深，用时需现配现用，且有致癌性，作为底物使用时会对人体造成�：�。用四甲基联苯胺作为底物时，背景着色低，显色灵敏，且对人体无毒。TMB贮液为TMB的二甲基亚砜(DMSO)溶液。但是TMB贮液在4℃下最多保存1个月，其后就会自动变蓝色。其间如果多次取贮液使用，变蓝的时间会更短。使用变蓝的TMB贮液会影响到测定结果的可靠性。因而通常不使用变蓝的TMB贮液而是重配，由于四甲基联苯胺的价格较高，常造成较大的经济损失。
发明创造内容本发明的目的是提供一种可以延长贮存时间的酶联免疫测定中的四甲基联苯胺(TMB)贮液。
本发明所提供的酶联免疫测定中的四甲基联苯胺(TMB)贮液，是四甲基联苯胺和硫代硫酸钠的二甲基亚砜(DMSO)溶液。
四甲基联苯胺和硫代硫酸钠的摩尔比可为72∶1-360∶1。其中，四甲基联苯胺和硫代硫酸钠的摩尔比优选为120∶1。
上述硫代硫酸钠可为无水硫代硫酸钠(Na2S2O3)或五水硫代硫酸(Na2S2O3.5H2O)。
上述四甲基联苯胺贮液中所述四甲基联苯胺的浓度可为0.00203-0.00377mol/l，所述硫代硫酸钠的浓度可为0.806×10-7mol/l-4.03×10-7mol/l，其中，所述四甲基联苯胺的浓度优选为0.0029mol/l，所述硫代硫酸钠的浓度优选为2.418×10-7mol/l。
本发明的四甲基联苯胺贮液可在4℃贮存6个月，不仅方便了酶联免疫测定的操作，也节约了资金，具有重要的意义。
图1A为间接酶联免疫测定法中的底物溶液1显色的ZR标准曲线图1B为间接酶联免疫测定法中的底物溶液2显色的ZR标准曲线图2A为直接酶联免疫测定法中的底物溶液1显色的ZR标准曲线图2B为直接酶联免疫测定法中的底物溶液2显色的ZR标准曲线具体实施方式
实施例1、用间接酶联免疫法测定细胞分裂素类物质-玉米素核苷(ZR)验证TMB贮液的可靠性试剂和材料(1)抗原及抗体①包被抗原玉米素核苷与卵清白蛋白的联接物(ZR-OVA)。
②ZR抗体 按照常规方法用玉米素核苷与牛血清白蛋白的联接物免疫新西兰大耳白兔制备得到抗玉米素核苷(ZR)的多克隆抗体③酶标抗体 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(购于sigma公司)。
(2)底物溶液①A液过氧化脲1.0g，Na2HPO4·12H2O35.8g，柠檬酸·H2O10.3g，吐温-80100μl，加1000ml蒸馏水，用时现配。
②TMB液a.对照TMB液TMB700mg，DMSO40ml，充分溶解，然后加蒸馏水960ml，柠檬酸·H2O10.3g，用时现配。
b.TMB贮液TMB700mg，DMSO40ml，充分溶解，然后加蒸馏水960ml，柠檬酸·H2O10.3g，再加入3μl 2mg/ml的Na2S2O3.5H2O溶液，混匀，4℃贮存6个月。
③底物溶液各取一定量a、b两种TMB液，再和相同体积的A液混合得到含有对照TMB液的底物溶液1和含有TMB贮液的底物溶液2。
(3)包被缓冲液称取1.5g Na2CO3，2.93g NaHCO3，用蒸馏水定容至1000ml，pH为9.6。
(4)磷酸盐缓冲液(PBS)称取8.0g NaCl，0.2g KH2PO4，2.96g Na2HPO4·12H2O，用蒸馏水定容至1000ml，pH为7.5。
(5)样品稀释液1000ml PBS中加1ml Tween-20，1g明胶(稍加热溶解)。
(6)洗涤液1000ml PBS加1ml Tween-20。
(7)终止液2mol/L的硫酸(H2SO4)。
(8)酶标板96孔酶标板(购于天津有机玻璃厂)
(9)酶联免疫分光光度计(DG3022A，南京华东电子管厂生产)1、包被将包被抗原(ZR-OVA)按1∶4000的比例用包被缓冲液稀释，混匀，在酶标板每小孔中加100μl。然后将酶标板放入内铺湿纱布的带盖瓷盘内，置于37℃下3h。
2、洗板将包被好的板取出，放在室温下平衡。然后甩掉包被液，把洗涤液均匀加入板上，使每孔都充满洗涤液，放置约0.5min，再甩掉洗涤液。重复4次，将板内残留洗涤液在吸水纸上甩干。
3、竞争(1)加标样首先将ZR标准物用样品稀释液稀释成2000ng/ml，然后再依次稀释成1000ng/ml，500ng/ml，250/ng/ml，125ng/ml，62.5ng/ml，31.25ng/ml，0ng/ml，共8个浓度。将系列溶液加入96孔酶标板中，每个浓度加6个孔，每孔50μl。
(2)加抗体把ZR抗体按1∶500的比例用样品稀释液稀释，混匀后每孔加50μl。然后将酶标板加入湿盒内开始竞争，竞争条件37℃下0.5h。
4、洗板方法同步骤2，洗板4次。
5、加酶标二抗将一定量的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，用样品稀释液稀释(稀释倍数为1∶1000)，混匀后，在酶标板每孔中加100μl，然后将其放入湿盒内，置37℃下，温育0.5h。
6、洗板方法同步骤2，洗五次。
7、显色将现配制TMB液的底物溶液1和底物溶液2分别加入到酶标板中，每孔100μl，常温下显色5分钟。
8、比色当显色5分钟后，每孔加入50μl 2mol/L硫酸终止反应。然后用2000ng/ml浓度孔(即标准曲线最高浓度孔)调零，在酶联免疫分光光度计上依次测定标准物各浓度450nm处的OD值。
9、用于ELISA结果计算的是logit曲线，曲线的横坐标用激素标样各浓度(ng/ml)的自然对数表示，纵坐标用各浓度显色值的logit值表示。Logit值的计算方法如下Logit(B/B0)=lnB/B01-B/B0=lnBB0-B]]>其中B0是0ng/ml孔的显色值，B是其它浓度孔的显色值。
结果如表1，图1A和图1B所示，表明从在其他条件都相同的情况下，含有3μl2mg/ml Na2S2O3.5H2O溶液并在4℃下贮存6个月的底物溶液2与对照底物溶液1的显色效果是一样的，无论显色的速度还是显色深浅都与现配制TMB液的底物溶液1一致，从标准曲线上看更直观的证明了这一结论。
表1、间接酶联免疫测定法测定玉米素核苷(ZR)的标准曲线(logit曲线)及OD值底物溶液1 底物溶液2ZR浓度(ng/ml)OD值 OD值2000 0.00 0.001000 0.05 0.07500 0.19 0.20250 0.28 0.30125 0.48 0.4862.5 0.63 0.6831.250.86 0.900.00 1.36 1.37实施例2、用直接酶联免疫法测定细胞分裂素类物质-玉米素核苷(ZR)验证TMB贮液的可靠性试剂和材料(1)抗原及抗体①蛋白A 金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA，购于sigma公司)②ZR抗体 (同实施例1)③酶标ZR 辣根过氧化物酶标记的玉米素核苷(2)底物溶液 同实施例1(3)包被缓冲液 同实施例1(4)磷酸盐缓冲液(PBS) 同实施例1(5)样品稀释液 同实施例1(6)洗涤液 同实施例1(7)终止液 同实施例1(8)酶标板 同实施例1
(9)酶联免疫分光光度计 同实施例11、包被用包被缓冲液把金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)稀释成20μg/ml，在酶标板每小孔中加100μl，然后将酶标板放入内铺湿纱布的带盖瓷盘内，置4℃下12h。
2、洗板将包被好的板取出，放在室温下平衡。然后甩掉包被液，把洗涤液均匀加入板上，使每孔充满洗涤液，放置约0.5min，再甩掉洗涤液。重复4次，将板内残留洗涤液在吸水纸上甩干。
3、加抗体把ZR抗体按1∶1000的比例用样品稀释液稀释，混匀后每孔加100μl。然后将酶标板加入湿盒内，置4℃下12h。
4、洗板方法同步骤2，洗板4次。
5、竞争(1)加标样首先将ZR标准物用样品稀释液稀释成2000ng/ml，然后再依次稀释成100ng/ml，10ng/ml，1/ng/ml，0.2ng/ml，0ng/ml共8个浓度。将系列溶液加入96孔酶标板中，每个浓度加6个孔，每孔50μl。
(2)加辣根过氧化物酶标记的玉米素核苷(ZR-HRP)将ZR-HRP按1∶50的比例用样品稀释液稀释，然后加入到酶标板中，每孔50μl。然后将酶标板加入湿盒内开始竞争，竞争条件37℃下0.5h。
6、洗板方法同步骤2，洗板4次。
7、显色将现配制的底物溶液1和底物溶液2分别加入到酶标板中，每孔100μl，在常温下显色10分钟。
8、比色当显色10分钟后，每孔加入50μl 2mol/L硫酸终止反应。然后用2000ng/ml浓度孔(即标准曲线最高浓度孔)调零，在酶联免疫分光光度计上依次测定标准物各浓度450nm处的OD值。
结果如表2，图2A和图2B所示，表明从在其他条件都相同的情况下，含有3μl2mg/ml Na2S2O3.5H2O溶液并在4℃下贮存6个月的底物溶液2与对照底物溶液1的显色效果是一样的，无论显色的速度还是显色深浅都与现配制TMB液的底物溶液1一致，从标准曲线上看更直观的证明了这一结论。
表2、直接酶联免疫测定法测定玉米素核苷(ZR)的标准曲线(logit曲线)及OD值底物溶液1底物溶液2ZR浓度(ng/ml) OD值 OD值2000 0.00 0.00100 0.07 0.07100.32 0.301 0.70 0.750.2 0.80 1.000 1.01 1.0权利要求
1.一种酶联免疫测定中的四甲基联苯胺贮液，是四甲基联苯胺和硫代硫酸钠的二甲基亚砜(DMSO)溶液。
2.根据权利要求1所述的四甲基联苯胺贮液，其特征在于所述四甲基联苯胺和硫代硫酸钠的摩尔比为72∶1-360∶1。
3.根据权利要求2所述的四甲基联苯胺贮液，其特征在于所述四甲基联苯胺和硫代硫酸钠的摩尔比为120∶1。
4.根据权利要求1、2或3所述的四甲基联苯胺贮液，其特征在于所述硫代硫酸钠为无水硫代硫酸钠或五水硫代硫酸钠。
5.根据权利要求1、2或3所述的四甲基联苯胺贮液，其特征在于所述四甲基联苯胺的浓度为0.00203-0.00377mol/l，所述硫代硫酸钠的浓度为0.806×10-7mol/l-4.03×10-7mol/l。
6.根据权利要求5所述的四甲基联苯胺贮液，其特征在于所述四甲基联苯胺的浓度为0.0029mol/l，所述硫代硫酸钠的浓度为2.418×10-7mol/l。
全文摘要
本发明公开了一种酶联免疫测定中的四甲基联苯胺贮液。本发明所提供的酶联免疫测定中的四甲基联苯胺贮液是四甲基联苯胺和硫代硫酸钠的二甲基亚砜(DMSO)溶液。本发明的四甲基联苯胺贮液可在4℃贮存6个月，不仅方便了酶联免疫测定的操作，也节约了资金，具有重要的意义。
文档编号G01N33/532GK1558238SQ200410000689
公开日2004年12月29日 申请日期2004年1月16日 优先权日2004年1月16日
发明者王保民, 赵静, 李召虎, 何钟佩, 段留生, 田晓莉, 李刚, 殷俐娜, 俞彩霞 申请人:中国农业大学
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