专利名称：一种利用压电石英晶体传感器检测微生物的方法及装置的制作方法
技术领域：
本发明属微生物传感器领域，特别涉及一种利用压电石英晶体传感器检测微生物的方法及装置。
背景技术：
传统的微生物测定方法有细胞记数法、比浊法、干重法和菌丝长度测定法等，这些方法存在操作烦琐、测定周期长等缺点，不能满足实际应用中对微生物快速测定的需要。近年来出现了许多利用微生物的热学、光学、电化学和生物化学性质进行测定的方法，如非生物电化学方法、生物电化学方法及细胞成分测定法等。
微生物测定方法在食品检验、临床医学和环境监测等许多领域都具有重要的作用。如今，结核病的死亡率达到历史最高水平，结核病已经成为传染病中的第一号杀手和最大的死亡原因。特别是抗多药性菌株的出现，给结核病的预防带来新的挑战。因此，快速、高效的检测结核杆菌的方法亟待问世。现今常用的一些方法都存在着一些弊端。细菌学培养是诊断结核病最传统的方法，也是时下认为最可靠的分析方法。准确率高是其的一个最大优点，但是该种方法很耗时，满足不了快速诊断的要求。基于酶联免疫吸附分析的生物化学方法也已用于结核杆菌的检测，该方法选择性高、灵敏度高、造价便宜，但其操作繁琐，产生假阳性的可能性大。DNA和RNA探针及结合聚合酶链放大反应的应用，也会造成大量的假阳性结果，且实验装置造价高，很难在发展中国家推广。现在规模较大的医院运用最多的快速检测结核病的大型仪器包括Bactec 460系统和Bactec MGIT 960系统，Bactec 460系统存在放射污染、仪器操作和维护困难、仪器昂贵等缺点。尽管Bactec MGIT 960系统已基本实现了自动化，但所有试剂依赖进口，而仪器本身造价就高，因此其推广受到经济条件的限制，而在结核病发生率高的贫穷国家或发展中国家是可望而不可及的，而且其检测时间相对较长，一般阳性出结果快者要8-10天左右，慢者要一个月左右，阴性也要40天左右。在我们的研究小组里，已设计出基于PQC的质量响应的压电免疫传感器，它简单、易操作，但不够灵敏，且抗体价钱高不易获得；另外一种FDT压电体声波阻抗传感器也被用来检测结核杆菌，响应快，灵敏度高，但是需要控制培养基的电导使其在仪器的灵敏度区间内工作，而往往造成由于营养缺乏而抑制细菌生长或者根本无生长现象。
发明内容
本发明的目的在于提供一种结构简单、造价低、灵敏度高的利用压电石英晶体传感器检测微生物的方法及装置。
为实现上述目的，本发明的一种利用压电石英晶体传感器检测微生物的方法，包括以下步骤1)将待检测的微生物置于培养池中培养；2)将碱溶液注入嵌有一对电极的检测池中；3)将培养池中微生物产生的CO2引入检测池；4)压电石英晶体传感器在线检测检测池的电导变化，并以频率振荡信号形式输出；5)频率计数器测量频率振荡信号的频率，并将频率计数结果送到计算机，经计算机处理后，输出检测结果。
上述步骤2)中所述的碱溶液为Ba(OH)2溶液或者Ca(OH)2溶液。
实现上述方法的微生物检测装置包括检测池、培养池、恒温槽、一对电极、石英晶体振荡器、频率计数器、计算机等，所述检测池为盛有碱溶液的密封池，并置于恒温槽上，检测池内设有培养池，一对电极插入检测池中，电极的另一端与石英晶体振荡器联接，石英晶体振荡器的输出接频率计数器的输入端，频率计数器的输出端与计算机联接。
本发明的优点1)将微生物的培养池与检测池单独设置，这种结构克服了微生物营养要求与检测灵敏要求不一致的矛盾。2)将培养池微生物产生的CO2引入到盛有碱液的检测池中，CO2与碱液反应生成碳酸盐沉淀，过量的CO2又与碳酸盐沉淀反应，使检测池的电导产生明显的变化，压电石英晶体传感器将检测池的电导变化变成压电石英晶体传感器频率的变化，通过对压电石英晶体传感器频率计数即可对微生物进行定性或定量检测，这种检测方法灵敏度高、可靠，并可大大缩短微生物的检测时间，用本发明的方法测定结核杆菌，测定一次仅需82小时左右，大大缩短了结核杆菌的测定时间，可广泛应用于临床结核病的诊断。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。
图1为本发明的结构图。
图2为用本发明检测结核杆菌的典型响应曲线。
图3为不同浓度结核杆菌存在时的实时频移响应曲线。
图4为样品中结核杆菌的浓度的对数与FDT之间的关系曲线。
具体实施例方式
参见图1，本发明的检测装置包括培养池4、检测池2、恒温槽3、石英晶体振荡器7、频率计数器8、计算机9，培养池4与检测池2套在一起置于恒温槽3上。其中1为橡胶塞为检测池2的密封塞，5为细菌，恒温槽3用来控制培养池4和检测池2的温度，一对经钝化处理的不锈钢电极或镀金电极6插入检测池2中，一对电极6的另一端与石英晶体振荡器7联接，石英晶体振荡器7的输出接频率计数器8的输入，频率计数器8的输出接计算机9。其中培养池4、检测池2、恒温槽3、电极6、石英晶体振荡器7组成压电石英晶体传感器。
用本发明装置进行微生物检测时，将微生物置于培养池4内的培养基中培养，由于培养池4处于密闭的检测池2内，微生物代谢的CO2引入盛有Ba(OH)2溶液的检测池2中。CO2与Ba(OH)2反应生成BaCO3和Ba(HCO3)2，从而引起反应前后电导的急剧变化，因而电极6之间的电导也随着变化，石英晶体振荡器7灵敏地响应这一变化，并以频率的形式输出，由频率计数器8进行计数，再送到计算机9中进行处理，从而对微生物进行定量检测分析。
为加快培养池内CO2的逸出，提高灵敏度，可在培养基中加入少量的NaHCO3溶液。
通过测定不同浓度的微生物的频率-时间曲线，可得到微生物浓度与频率检测时间(FDT)的关系，从而进行定量分析。定性分析判断的依据是频率响应曲线上出现拐点，则视为有菌。检测池中Ba(OH)2吸收CO2，电导变化大，有特征性，引起明显的电响应信号，较其它方法灵敏、可靠。
用本发明的方法测定结核杆菌，测定一次仅需82小时左右，可广泛应用于临床结核病的诊断。
图2为用本发明检测结核杆菌的典型响应曲线杆菌。记数前，先放置12小时，消除培养基中溶有的CO2的影响。由于实验操作是在室温进行，而培养却在37℃。由此，随着温度的变化，一部分CO2逸出，被Ba(OH)2吸收。随着结核杆菌的生长，反应继续进行。Ba(OH)2先转化成BaCO3后又变成Ba(HCO3)2，电导也相应发生变化，先降低后升高。利用所构建的传感器，结核杆菌生长过程中引起的电导变化，就可以在线地被检测到，并以频移-时间响应曲线表现出来。因此，根据频移响应曲线，做频移与FDT的关系图，就可以定量地判断样品中存在的结核杆菌。
图2中，开始时频率有些小小的漂移，约180Hz左右，属于噪音。隔一段时间以后，B点频率开始明显下降，这一点所对应的时间称为FDT，频率连续下降约十几个小时，然后达到一个平台。在AB段，没有明显的电信号变化，这是由于结核杆菌保存在冰箱中，它们的生理活性受到抑制，而其恢复需要一段时间，同时适应新的营养环境也需要时间，释放出的CO2的量是微乎其微的，因而溶液性质没有多大变化。在BC阶段，频率变化较快，称之为激活阶段。结核杆菌处于对数生长期，不断吸收培养基中的营养成分，生长良好，释放出大量的CO2，CO2与BaCO3发生反应而转化成Ba(HCO3)2，溶液的电导迅速增加，相应地频率也下降较快。而CD阶段处于相对静止状态，由于在代谢过程中不断排泄一些有毒物质，如游离脂肪酸、过氧化物等，另外培养基的缓冲能力弱，溶液的pH值由开始时7.2变为5.0左右。由于这些不利因素，结核杆菌的生理活性再次受到抑制，从而很难再吸收营养物质和排泄代谢产物。由于无CO2的释放，反应终止，溶液的电导维持恒值，而出现平台。
图3为不同浓度的结核杆菌的频移-时间响应曲线。1-0；2-3×102cells/ml；3-104cells/ml；4-105cells/ml；5-106cells/ml；6-107cells/ml。结核杆菌的浓度在3×102cells/ml至107cells/ml间变化。从图中可以看出，结核杆菌的浓度不同，其FDT不同，浓度越大，其FDT越小。因而根据FDT值，我们能得到结核杆菌的浓度。图4阐明了样品中结核杆菌的浓度的对数与FDT之间存在较好的线性关系。回归曲线可用方程(1)表示。
LogC＝7.42742-3.8853×10-5FDT (1)在方程(1)中，C为样品中存在的结核杆菌的初始浓度，FDT为频率开始快速下降时所对应的检测时间，相关系数为0.9763(n＝5)。在3×102cells/ml至107cells/ml范围内，一旦获得FDT值，样品中结核杆菌的初始浓度可根据方程(1)计算得到。因此，该方程可以作为结核杆菌进行定量分析的基础。
微生物在生长过程中会释放出CO2。通过测定代谢过程中释放出的CO2而对微生物进行定量检测及对其培养过程进行检测的串联电极压电石英晶体传感器。
权利要求
1.一种利用压电石英晶体传感器检测微生物的方法，包括以下步骤1)将待检测的微生物置于培养池中培养；2)将碱溶液注入嵌有一对电极的检测池中；3)将培养池中微生物产生的CO2引入检测池；4)压电石英晶体传感器在线检测检测池的电导变化，并以频率振荡信号形式输出；5)频率计数器测量频率振荡信号的频率，并将频率计数结果送到计算机，经计算机处理后，输出检测结果。
2.根据权利要求1所述的一种利用压电石英晶体传感器检测微生物的方法，其特征在于所述的碱溶液为Ba(OH)2或者Ca(OH)2溶液。
3.根据权利要求1所述的一种利用压电石英晶体传感器检测微生物的方法，其特征在于所述的培养池中加入少量的NaHCO3溶液。
4.一种利用压电石英晶体传感器检测微生物的装置，包括检测池、培养池、恒温槽、一对电极、石英晶体振荡器、频率计数器、计算机，所述检测池为盛有碱溶液的密封池，并置于恒温槽上，检测池内设有培养池，一对电极插入检测池中，电极的另一端与石英晶体振荡器联接，石英晶体振荡器的输出接频率计数器的输入端，频率计数器的输出端与计算机联接。
5.根据权利要求4所述的一种利用串联压电石英晶体传感器的微生物检测装置，其特征在于所述的电极为不锈钢电极或镀金电极。
全文摘要
本发明公开了一种利用压电石英晶体传感器检测微生物的方法及装置。该方法及装置将微生物的代谢产物CO
文档编号G01N27/416GK1584579SQ20041002323
公开日2005年2月23日 申请日期2004年5月24日 优先权日2004年5月24日
发明者何凤姣, 刘素芹 申请人:湖南大学
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
