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专利名称：一种体外检测稻瘟病菌效应蛋白在水稻根组织内转运的方法
技术领域：
本发明涉及一种体外检测稻瘟病菌效应蛋白在水稻根组织内转运的方法，具体涉及一种利用稻瘟病菌效应蛋白基因的原核表达产物处理水稻根组织，体外检测效应蛋白在无稻瘟病菌存在下自主转运进入水稻组织的方法，属于植物保护和生物技术领域。
背景技术：
病原菌效应蛋白具有使植物致病和 诱导植物防御反应的双重作用。病原细菌是通过III型分泌系统转运效应子，其转运机制研究得较为清楚。但对于丝状真菌来说，尽管诸如吸器等专化的侵染结构参与了效应蛋白的转运，但其效应蛋白是如何被转运进入寄主细胞仍然未知。通过对卵菌具有无毒活性的细胞质效应蛋白的鉴定，对其效应蛋白转运机制有了一定的认识。来源于卵菌(H. parasitica, P. infestans和P. sojae)的效应蛋白都具有一个保守的基序即RXLR(X代表任意一个氨基酸)，该基序位于信号肽的下游并且参与效应蛋白在寄主细胞内的转运。许多研究表明，RXLR基序在卵菌效应蛋白转运进入寄主细胞中起作用。第一，RXLR基序在序列上和转运位置与疟原虫将效应蛋白转运进入寄主红细胞所需的(HT)/Pexel基序是一致的。疟原虫将包含致病疫霉菌效应蛋白AVR3a的RXLR基序和PH001D5在内的一段30个氨基酸并且融合了绿色荧光蛋白序列转运进入寄主红细胞中，其结果表明RXLR和HT/Pexel在功能上可交替。第二，RXLR基序并不是致病疫霉效应蛋白AVR3a直接在寄主细胞中表达所必需的，也就是说该基序是效应蛋白转运必需而不是表达所必需的[12]。第三，通过分析疟原虫效应蛋白ATRl和ATR13的C端序列，发现序列具有很高的多态性，说明这两个效应蛋白是与寄主抗性蛋白共同进化的。综上所述，可以认为卵菌RXLR效应蛋白是有两个功能域的模式蛋白。N-端功能域包含有信号肽和RXLR基序，C-端具有在寄主细胞中起作用的功能。卵菌RXLR效应蛋白与细菌III型效应蛋白相比，它们的功能域可能是在不同选择压力下形成的。Dou等人的研究表明，RXLR介导的效应蛋白转运即使在病原菌不存在的情况下，效应蛋白也能进入寄主细胞，这一结果揭示了 RXLR效应蛋白转运仅取决于RXLR蛋白和识别RXLR蛋白的寄主蛋白。那么包括稻瘟病菌在内的真菌效应蛋白的转运机制如何，是否同卵菌效应蛋白一样存在与RXLR基序相类似的共有基序？绿色突光蛋白(green fluorescence protein, GFP)作为基因标记已经完全应用于微观定位和数量性状的测定，利用原核表达技术构建效应蛋白基因与GFP基因融合的原核表达载体，通过化学方法诱导融合蛋白表达，利用融合蛋白处理水稻根尖，共聚焦显微镜观察效应蛋白在水稻根组织内的转运。目前，还没有对稻瘟病菌效应蛋白与卵菌一样能在无病原菌存在下自主转运进入水稻细胞参与致病或引起寄主HR反应的报道。现在还没有一种直接体外检测稻瘟病菌效应蛋白基因的原核表达产物能无病原菌存在下自主转运进入水稻根组织内，以快速鉴定稻瘟病菌效应蛋白基因能否同卵菌效应蛋白一样自主转运进寄主细胞内的方法报道。

发明内容
本发明的目的是克服现有技术之不足，而提供一种快速、简便、准确的用稻瘟病菌效应蛋白基因与GFP基因融合的原核表达产物处理水稻根组织观察稻瘟病菌效应蛋白在无病原菌存在下自主转运进入水稻根组织。本发明的技术方案是保持现有原核表达产物表达纯化及GFP融合蛋白观察方法不变，包括原核表达技术、蛋白纯化技术、所用共聚焦显微镜的激发光和发射光波长范围均与常规相同，用稻瘟病菌效应蛋白基因与GFP融合的原核表达产物，按照5. Omg/ml浓度处理抗病水稻品种丽江新团黑谷根尖0. 5cm, 12h-72h后，共聚焦显微镜直接观察GFP融合蛋白在水稻根组织内的转 运。本发明的有益效果在于I、方法简便、准确、快速。2、利用纯化的效应蛋白基因的原核表达产物处理水稻根组织，通过荧光显微镜观察效应蛋白在无病原菌(即体外)存在下自主转运进入水稻根组织内，能直接定性地和定量地获得效应蛋白在水稻根组织内的转运情况。3、稻瘟病菌效应蛋白基因的原核表达产物直接处理水稻根组织，共聚焦显微镜观察其在根组织内的转运可为进一步开展效应蛋白基因功能研究提供强有力的证据。


图I稻瘟病菌效应蛋白在水稻根组织内的转运。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。实施例一5. Omg/ml的GFP融合蛋白处理水稻根尖0. 5cm处12h,灭菌水漂洗4h,共聚焦显微镜直接观察GFP融合蛋白在水稻根组织内的转运。具体方法为将稻瘟病菌效应蛋白基因表达产物(利用IPTG化学诱导的方法获得表达产物采用过程不再赘述)于4°C离心机离心收集菌体，用新鲜配制的缓冲液(20mM Tris-HCl,pH7. 4 ；200mM NaCl ；lmM EDTA ；10mM ^ -巯基乙醇)悬浮菌体。在冰水浴上进行超生破碎细胞后离心收集上清。将该原核表达产物，利用GST纯化柱(购买自安玛西亚公司)纯化，将纯化后的表达产物按照5. Omg/ml (含25mM MES)的浓度处理感病水稻品种丽江新团黑谷的根尖0. 5cm处12h，灭菌水漂洗4h后共聚焦显微镜观察效应蛋白基因在水稻根组织内的转运(见图1，稻瘟病菌效应蛋白在水稻根组织内的转运)。对照是将该GFP基因的原核表达产物纯化后按照5. Omg/ml的浓度处理感病水稻品种丽江新团黑谷根组织12h，苯胺蓝直接染色进行胼胝质观察。结果见表I。表I效应蛋白基因的原核表达产物处理水稻根尖0. 5cm后在根组织内的转运
权利要求
1.一种体外检测稻瘟病菌效应蛋白在水稻根组织内转运的方法，其特征在于，用稻瘟病菌效应蛋白基因与GFP融合的原核表达产物，按照5. Omg/ml浓度处理抗病水稻品种丽江新团黑谷根尖0. 5cm, 12h-72h后，共聚焦显微镜直接观察GFP融合蛋白在水稻根组织内的转运。
全文摘要
本发明公开了一种体外检测稻瘟病菌效应蛋白在水稻根组织内转运的方法，用稻瘟病菌效应蛋白基因与GFP融合的原核表达产物，按照5.0mg/ml浓度处理抗病水稻品种丽江新团黑谷根尖0.5cm，12h-72h后，共聚焦显微镜直接观察GFP融合蛋白在水稻根组织内的转运。方法简便、准确、快速。
文档编号G01N21/63GK102749308SQ20121019143
公开日2012年10月24日 申请日期2012年6月11日 优先权日2012年6月11日
发明者刘林, 施竹凤, 朱有勇, 李成云, 杨静 申请人:云南农业大学