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专利名称：单细胞藻粒度分析微流控芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用库尔特原理设计制作的粒度分析仪器，更具体地说是一种用于海洋单细胞藻粒度分析的微流控芯片。
背景技术：
微全分析系统(Micro-total analysis system，μ-TAS)概念的提出在分析科学领域产生了重大影响，引导化学分析设备向着微型化、集成化与便携化的趋势发展。它利用微加工工艺在芯片上制作微阀、微管道、微反应器、微流量传感器、微检测器等功能单元构成微型化学系统。微流控芯片系统具有高效、低耗、微型化和集成化的特点，适于各类现场分析和实时测定。1995年Mathies和Woolley首次采用微电泳芯片进行了DNA测序研究，在有效分离长度3.5cm的通道上，10min内测序约150个碱基，准确率97％。1998年Ramsey等在微流控芯片上集成了细胞消解、PCR扩增和电泳分离等功能的微芯片基因分析系统。
库尔特粒度分析仪的原理(Coulter Principle)悬浮在电解液中的细胞或颗粒，随电解液通过小孔管时，因取代了相同体积的电解液，在恒电流设计的电路中导致小孔管内外两电极间电阻发生瞬时变化，而产生了电位脉冲，脉冲信号的大小和次数与颗粒的大小和数目成正比。库尔特原理属于对颗粒个体三维的测量，因此，不但能准确测量细胞或颗粒的粒径分布，更能作细胞或粒子绝对数目和浓度的测量，其所测粒径更接近真实。库尔特计数仪在单细胞藻、培养细胞、血球等领域得到广泛应用(Ray，2001；Arakawa et al，1997)。
但目前的库尔特计数仪价格昂贵，体积较大，不适用于现场分析，微流控芯片的出现为库尔特技术的现场应用提供了可能。

发明内容
本发明的目的是提供一种微型、便携且适于现场分析的对海洋单细胞藻进行计数和粒径分布测定的微流控芯片。
本发明是以标准光刻技术为基础，以玻璃为微流控芯片材料，在芯片上构建微通道和微储液池，使样品的进样、检测集成在芯片上来完成。微流控芯片包括结构对称的基片和盖片，在基片和盖片上构建有包括液流系统和与样品通道垂直相交的双“T”型检测通道。液流系统采用ψ型结构，中间通道为样品通道，两侧支通道称为鞘流通道，鞘流通道的作用是样品中的藻细胞以单行排列，样品通道与鞘流通道尺寸一致，鞘流通道为1/4圆弧状，样品通道与鞘流通道端点切线方向相一致，这样，鞘流与样品流同向汇合，避免液流汇合产生涡流扰动，保证了液流系统的稳定性；样品通道与鞘流通道的末端分别构建有储液池，样品通道的另一端还有一废液池；在芯片上构建与进样通道垂直相交的双“T”型检测通道，检测通道设计成半哑铃形，相交部分细而短(横截面尺寸与样品通道一致)，外侧宽度大，检测通道的电阻主要是来自细通道的贡献，因而细胞通过而产生的电阻变化才会明显，从而提高检测灵敏度。在检测通道两侧安置电极，使用恒电流检测系统，细胞通过检测通道与样品通道的共用区域时，会取代与其相等体积的电解液，导致两电极之间电阻呈现暂时性改变，电位差发生相应改变产生脉冲信号，由脉冲的次数和强度来计算细胞数目和粒径。
本发明将库尔特液流系统和电极集成，体现了微流控芯片系统的微型化和集成化的特点，适于各类现场分析和实时测定。广泛应用于单细胞藻、培养细胞、血球等领域。
本发明的微流控芯片的设计和制作方法如下所述A.将根据微流控芯片结构设计的芯片图形制成掩膜，图形区为透明区，可透射光，非图形区为黑色区，吸光而不能透射光。
B.将掩膜覆盖在63mm×63mm×1.5mm的匀胶铬板(铬型LRC；铬厚T145nm胶类正性感光胶；胶厚570nm)上，在紫外线照射下曝光，感光胶发生光化学反应。
C.曝光后的铬板在显影液中显影，以除去被曝光的正性感光胶，掩膜上的图形被复制到光胶层上。
D.室温下用铬膜刻蚀液(硫酸铈∶高氯酸∶水＝50克∶15毫升∶300毫升)腐蚀裸露的铬膜，高纯水冲洗干净后，烘干。光胶层上的图形被转移到了基片上，同时保证非图形区的光胶层和铬膜不被破坏。
E.湿法刻蚀微通道。以0.5M HF/0.5M NH4F为刻蚀剂刻蚀微通道，速率约为10μm/h，得横截面为梯形的凹微通道。再依次用丙酮和铬膜刻蚀液除去残存的光胶层和铬膜，用高纯水冲洗干净即得干净透明的基片。
F.在基片的储液池位置用微型台钻处打孔，作为芯片出入口。
G.截取与基片同样尺寸的匀胶铬板，依次用丙酮、铬膜刻蚀液浸泡2分钟，以除去光胶层和铬膜，高纯水冲洗干净即得盖片。
H.将基片与盖片依次在丙酮、H2O-H2O2-NH4OH(5∶1∶1)溶液、H2SO4∶H2O2(4∶1)溶液和高纯水中超声清洗5-10分钟，氮气吹干，然后在超净环境中将两者对齐密封。高温下键合，升温程序为以40℃/min从室温升至550℃，时间30分钟；以20℃/min从550℃升至610℃，时间30分钟；以20℃/min从610℃升至635℃，时间30分钟；以10℃/min从635℃升至650℃，时间6小时；然后自然冷却到室温。
本发明在利用库尔特基本原理设计制作的微流控芯片上构建了实现库尔特技术所需的液流系统和检测通道，实现了库尔特粒度分析系统的微型化、集成化和简单化；制造成本低，易于实现标准化和规模化生产。


图1是本发明的微流控芯片的结构示意图。
其中，1-样品入口；2，3-鞘流入口；4，5-电极池；6-废液池；7-样品通道；8，9-鞘流通道；10-通道交汇点；11-双T型检测通道。
图2是单细胞藻粒度分析芯片系统的结构示意图。
其中，12，13-微型泵；14-恒电流系统；15，16-鞘流；17-样品。
具体实施例方式
下面结合附图并通过具体实施例来进一步说明本发明。
实施例1微流控芯片的结构如图1所示，微流控芯片结构分两部分液流系统和检测系统。液流系统采用ψ型结构，中间通道为样品通道7，两侧支通道为鞘流通道8和9，鞘流通道的作用是使样品中的藻细胞呈单行排列，样品通道7与鞘流通道8和9尺寸一致，鞘流通道为1/4圆弧状，鞘流通道8和9在交汇点10的切线方向与样品通道7方向相一致，这样，鞘流与样品流同向汇合，避免液流汇合产生涡流扰动，保证了液流系统的稳定性；在芯片上构建与样品通道垂直相交的双“T”型检测通道11，检测通道设计成半哑铃形，与样品通道7相连部分细而短，外侧宽度大，检测通道11与样品通道7的共用通道长度设计为150-200μm，这样，检测通道的电阻主要是来自细通道的贡献，因而细胞通过而产生的电阻变化才会明显。在检测通道两端的电极池4和5处安置电极，使用恒电流检测系统，细胞通过检测通道与样品通道的共用区域时，会取代与其相等体积的电解液，导致两电极之间电阻呈现暂时性改变，电位差发生相应改变产生脉冲信号，由脉冲的次数和强度来计算细胞数目和粒径。
实施例2微流控芯片的制作1.玻璃基片的制作掩膜胶片上微通道的尺寸设计流体通道，30μm；检测通道，30μm，300μm，宽部长5mm，窄部长0.2mm；共用通道长0.35mm。将掩膜胶片置于63mm×63mm×1.5mm的匀胶铬板上，紫外线曝光180秒(波长365nm)，显影液中显影100秒后，100℃下烘干半小时。在室温下用铬膜刻蚀液(硫酸铈∶高氯酸∶水＝50克∶15毫升∶300毫升)腐蚀铬膜，然后用高纯水冲洗干净，烘干。通过数码显微镜摄像，测得铬板上的通道尺寸为样品通道，40μm；检测通道，40μm，310μm。用0.5M HF/0.5M NH4F刻蚀剂腐蚀裸露的硼硅玻璃，速率约为10μm/h，刻蚀7小时后，再依次用丙酮、铬膜刻蚀液除去残余光胶层和铬膜，即得基片。用微型台钻打孔，钻头为1mm的金刚钻头，孔的直径即为储液池直径1mm。显微镜下测定微通道尺寸样品通道，上底宽180μm，下底宽50μm，深度70μm；检测通道，宽部上底宽450μm，下底宽320μm，深度70μm；共用通道长约200μm2.盖片的制作与基片制作方法相同，构造相同，但不打孔。
3.将基片与盖片依次在丙酮、H2O-H2O2-NH4OH(5∶1∶1)溶液、H2SO4∶H2O2(4∶1)溶液和高纯水中超声清洗5-10分钟，用氮气吹干，然后在超净环境中将两者对齐密封，高温下键合。升温程序为以40℃/min从室温升至550℃，时间30分钟；以20℃/min从550℃升至610℃，时间30分钟；以20℃/min从610℃升至635℃，时间30分钟；以10℃/min从635℃升至650℃，时间6小时。然后自然冷却到室温。经显微镜下观测，键合后通道无变形，且达到完全密封。键合后的芯片通道横截面呈椭圆形，样品通道和检测通道窄部长轴长约为180μm，窄轴长约为140μm，检测通道宽部长轴长约450μm，短轴长约140μm；共用通道长约200μm实施例3微流控芯片分析检测系统如图2所示，在样品通道7的进口1接进样泵13，两侧鞘流通道8和9在其入口2和3处接鞘流15，16，在检测通道11两端4，5安置电极并接在一恒电流计上，构成整个微流控芯片分析检测系统。样品和鞘流液通过泵12和13输送，鞘流液以相同的流速流动，鞘流液与样品汇合后以层流的形式向前流动，通过调节鞘流和样品流速，使样品中细胞呈单行排列，并向前移动通过检测区(检测通道和样品通道的共用区域)，在检测区域细胞取代了等体积的电解液，导致两电极之间电阻呈现暂时性的改变，由于检测系统是恒电流设计，故电位差也暂时性的改变产生脉冲信号，根据脉冲信号的次数和强度可以对细胞的数目和粒径进行统计分析。
权利要求
1.一种单细胞藻粒度分析微流控芯片，其特征在于它包括结构对称的基片和盖片，在基片和盖片上构建有包括中间样品通道和两侧道鞘流通道的ψ型结构的液流系统和与样品通道垂直相交的双T型检测通道。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于所述的鞘流通道为1/4圆弧状，样品通道与鞘流通道通端点切线方向相一致。
3.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于所述的检测通道设计成半哑铃形，与样品通道相连部分细而短，外侧宽度大。
4.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于它是以玻璃为材料制作的。
全文摘要
本发明公开了一种单细胞藻粒度分析微流控芯片，它包括结构对称的基片和盖片，在基片和盖片上构建有包括中间样品通道和两侧道鞘流通道的ψ型结构的液流系统和与样品通道垂直相交的双T型检测通道；在检测通道两侧安置电极，使用恒电流检测系统。在细胞通过检测通道与样品通道的共用区域时，会取代与其相等体积的电解液，导致两电极之间电阻呈现暂时性改变，电位差发生相应改变产生脉冲信号，由脉冲的次数和强度来计算细胞数目和粒径。本发明将库尔特液流系统和电极集成，体现了微流控芯片系统的微型化和集成化的特点，适于各类现场分析和实时测定。广泛应用于单细胞藻、培养细胞、血球等领域。
文档编号G01N15/10GK1712927SQ20051004385
公开日2005年12月28日 申请日期2005年6月19日 优先权日2005年6月19日
发明者王修林, 苏荣国, 韩秀荣 申请人:中国海洋大学