专利名称：测量藻类状态转换的方法
技术领域：
本发明涉及藻类光合作用研究领域，具体来说，本发明涉及一种测量藻类状态转换的方法。
背景技术：
绿色植物的光合作用为地球上其他生物提供了生存所需的能量。因此研究植物光合作用的效率问题显得尤为重要。一般地，在绿色植物类囊体膜上存在着两个光合系统，分别称为光系统I和光系统II。目前认为，光系统II能够接收光能裂解水产生氧气，同时将光能转变成电能；而光系统I也能接收光能，但只能激发电子而无法产生氧气。正常条件下，绿色植物两个光系统之间存在着一定的能量分配，而能量分配合理与否直接影响了植物的 生长。因此，研究植物两个光系统之间的能量分配成为了一个备受关注的领域。1969年，Murata首次报道了在红藻门紫球藻细胞中存在着一种后来被称为状态转换的机制(Murata N. ,1969, Biochimica et Biophysica Acta, 172 :242_251)。同年，Bonaventura和Myers也在绿藻门小球藻中发现了类似的现象(Bonaventura C. and MyersJ, 1969, Biochimica et Biophysica Acta, 189 :366-383)。状态转换是绿色植物两个光系统之间能量分配的一种机制，用于抵御外界环境变化对于植物体的影响。一般地，正常条件下，光能更多地由光系统II吸收，而光系统I只吸收较少的部分光能，这种状态称之为状态I。而当外界环境突然变化后，部分光系统II的能量被传递给了光系统I，此时两个光系统之间能量进行了重新分配，这种状态称之为状态2。绿色植物的能量从状态I向状态2的转变是其应对外界环境变化的一种自我保护方式。藻类因其结构简单、遗传背景清晰而成为研究状态转换的模式生物。目前测量状态转换的方法主要由两种77K低温突光法(Yang et al. , 2009, PhotosynthesisResearch，99 :99-106)和最大叶绿素荧光法(Nathalie et al. ,2003, Science, 299 1572-1575)。前者是将经过不同诱导的样品放入液氮(77K)中迅速冷冻，固定细胞的能量状态，然后通过荧光分光光度计测量给定激发波长下光系统II和光系统I的能量峰。通过光系统II和光系统I能量峰高低的变化来判断状体转换的发生和程度。该方法的缺陷在于(1)由于液氮温度极低，在实验过程中极易伤及操作人员，因此该方法具有一定的危险性；(2)通过荧光分光光度计测得的能量峰均为相对值，无法量化状态转换的程度。后者是将样品进行状态转换诱导后，利用调制叶绿素荧光仪(PAM)测量最大荧光(Fm或Fm’)，通过观察Fm和Fm’的高低变化来判断状态转换的发生和程度。其优点是无需冷冻样品，可以在常温下测定。该方法的缺陷在于(I)要获得稳定的Fm或Fm’值才能说明状态转换的发生，而得到稳定的Fm或Fm’需要较长的诱导过程，因此该方法测量时间较长；(2)该方法也无法量化状态转换的程度。因此，急需一种操作安全、可靠且可以量化分析的方法来测量藻类的状态转换。目前，利用德国WALZ公司2011年最新研制的多激发波长调制叶绿素荧光仪Multi-Color-PAM能够精确地测量藻类光系统II的捕光截面积Sigma(II) A。捕光截面积Sigma(II) A能够准确地反映样品光系统II对于光能的吸收效率。如果样品发生状态转换，那势必会影响样品原本的光系统II捕光截面积。因此，如果能够将这种技术用来测量状态转换，就可以量化状态转换的程度，从而定量分析样品的能量分配。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种安全快速的活体测量藻类状态转换的新方法，使得能够在常温下测量状态转换，并可以量化状态转换的程度。为解决上述技术问题，本发明提供一种测量藻类状态转换的方法，包括步骤I)取一定量体积的藻液作为样品，导入多激发波长调制叶绿素荧光仪的样品池中，将初始荧光信号(Ft)设置在0. 2 0. 5之间且稳定；2)按常规方法将所述样品诱导至第一状态；3)打开特定波长的单周转饱和闪光测量快速荧光诱导动力学曲线；4)对所述快速荧光诱导动力学曲线进行拟合，并计算所述第一状态下的第一捕光截面积值；5)按常规方法又将所述样品诱导至第二状态；6)打开特定波长的单周转饱和闪光测量快速荧光诱导动力学曲线；7)对所述快速荧光诱导动力学曲线进行拟合，并计算所述第二状态下的第二捕光截面积值；8)比较所述第一捕光截面积值和所述第二捕光截面积值，若所述第一捕光截面积值大于或小于所述第二捕光截面积值，则认定所述藻类发生了状态转换；若两者无差别，则认定所述藻类未发生状态转换。可选地，所述第一状态为状态I或者状态2，所述第二状态相应地为状态2或者状态I。可选地，诱导至所述状态I的方法包括对所述样品照射红光、蓝光或者绿光5min，诱导至所述状态2的方法包括对所述样品暗置5min。可选地，所述藻液样品的体积为I 3mL。可选地，所述特定波长的单周转饱和闪光为所述样品的最佳吸收波长。可选地，所述藻类包括蓝藻、绿藻和红藻。与现有技术相比，本发明具有以下优点本发明在常温下测量活体藻液，无需用液氮冷冻样品，对样品无损伤且操作过程安全。本发明通过精确测量出的光系统II捕光截面积(单位为nm2)可以量化状态转换的程度。本发明对于样品的叶绿素浓度灵敏度极高，适用于很稀的藻液，因此可以用于测量自然水样中样品的状态转换。
本发明的上述的以及其他的特征、性质和优势将通过下面结合附图和实施例的描述而变得更加明显，其中
图I为本发明一个实施例的测量藻类状态转换的方法的流程示意图；图2为本发明一个实施例的用捕光截面积法测量蓝藻门集胞藻6803状态转换的结果图；图3为现有技术中的用77K低温荧光法测量蓝藻门集胞藻6803状态转换的结果图；图4为现有技术中的用最大叶绿素荧光法测量蓝藻门集胞藻6803状态转换的结果图；图5为本发明一个实施例的用捕光截面积法测量绿藻门莱茵衣藻状态转换的原始曲线图；图6为本发明一个实施例的用捕光截面积法测量绿藻门莱茵衣藻状态转换的结果图。
具体实施例方式下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，在以下的描述中阐述了更多的细节以便于充分理解本发明，但是本发明显然能够以多种不同于此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下根据实际应用情况作类似推广、演绎，因此不应以此具体实施例的内容限制本发明的保护范围。图I为本发明一个实施例的测量藻类状态转换的方法的流程示意图。需要注意的是，这些以及后续其他的附图均仅作为示例，不应该以此作为对本发明实际要求的保护范围构成限制。如图I所示，该测量藻类状态转换的方法可以测量包括蓝藻、绿藻和/或红藻等藻类，具体包括执行步骤S101，取一定量体积的(例如I 3mL)藻液作为样品，导入多激发波长调制叶绿素荧光仪Multi-Color-PAM的样品池中，将初始荧光信号(Ft)设置在0. 2 0. 5之间且稳定；执行步骤S102，按常规方法将样品诱导至第一状态(状态I或者状态2);如果先将样品诱导至状态1，则可以采用对样品照射红光、蓝光或者绿光5min ;如果先将样品诱导至状态2，则可以采用对样品暗置5min ；执行步骤S103，打开特定波长的单周转饱和闪光(样品的最佳吸收波长)测量快速荧光诱导动力学曲线；执行步骤S104，对快速荧光诱导动力学曲线进行拟合，并计算第一状态下的第一捕光截面积Sigma(II) A值；执行步骤S105，按常规方法又将样品诱导至第二状态(状态2或者状态I);类似地，此步骤如果需要将样品诱导至状态2，则可以采用对样品暗置5min ;如果需要将样品诱 导至状态1，则可以采用对样品照射红光、蓝光或者绿光5min ；执行步骤S106，打开特定波长的单周转饱和闪光(样品的最佳吸收波长)测量快速荧光诱导动力学曲线；执行步骤S107，对快速荧光诱导动力学曲线进行拟合，并计算第二状态下的第二捕光截面积Sigma(II) A值；
执行步骤S108，比较第一捕光截面积Sigma(II) A值和第二捕光截面积Sigma (II)a值，若第一捕光截面积Sigma(II) A值大于或小于第二捕光截面积Sigma(II) A值,则认定藻类发生了状态转换；若两者无差别，则认定藻类未发生状态转换。本发明的基本原理是捕光截面积Sigma(II) A值代表了光系统II吸收的光能的有效区域面积，其值的大小可以反映光系统II获得光能的多少，如果此值变大，说明此时光系统II吸收光能增加；反之则减少。藻类状态转换是光能重新分配的过程，当藻类处于状态I时，基本由光系统II吸收能量，此时会得到一个相对较大的Sigma(II) A值；而当藻类处于状态2时，原本由光系统II吸收的部分光能被分配给了光系统I，因此Sigma(II) A值会减少。而本发明正是通过比较不同状态下Sigma(II) A值来判断是否发生状态转换，如 果两个Sigma(II) A值发生了变化(状态I至状态2，Sigma (II)a值变�。环粗浯�)，则说明发生了状态转换；如果两个Sigma(II) A值没有变化则说明未发生状态转换。因此，本发明的方法可以简称为"捕光截面积法"。实施例I现以测量蓝藻门集胞藻6803 (Synechocystis sp. PCC 6803)的状态转换为实施例，分别用本发明方法(图2)、77K低温荧光法(图3)和最大叶绿素荧光法(图4)测量其状态转换。首先利用本发明方法(捕光截面积法)测量集胞藻6803的状态转换，具体实施方式
如下(I)取一定量体积的集胞藻6803藻液，放入多激发波长调制叶绿素荧光仪Multi-Color-PAM(德国WALZ)的样品池中，调节仪器设置使得初始Ft在0. 2-0. 5之间且稳定;(2)黑暗5min诱导至状态2 ；(3)打开特定波长的单周转饱和闪光测量快速荧光诱导动力学曲线；(4)利用仪器软件对快速荧光诱导动力学曲线进行拟合，并计算状态2下的捕光截面积Sigma(II) A值,蓝藻的最佳吸收光区为红光区,故选择拟合Sigma(II) 625nm ；(5)对集胞藻照射蓝光5min,诱导至状态I ;(6)重复步骤(3)和步骤(4)，获得状态I下的捕光截面积Sigma(II) 625nm值；(7)比较步骤⑷和步骤(6)测量的Sigma(II) 625nil^，若Sigma (I I) 625nm增大，说明发生了状态转换，若无差别说明未发生状态转换；(8)重复上述实验三次，结果如图2所示。从图2可以看出，经蓝光诱导至状态I的集胞藻6803捕光截面积Sigma(II) 625nm值显著高于经过暗诱导至状态2的值(**表示差异极显著)。这表示经过蓝光诱导后，集胞藻6803发生了明显的状态转换。为了验证本发明的可信度，在此分别利用目前普遍采用的77K低温荧光法和最大叶绿素荧光法对集胞藻6803进行状态转换测量。首先用77K低温荧光法测量集胞藻6803的状态转换，步骤如下(I)取适量藻液于三角瓶，将其置于暗环境中处理5min，诱导至状态2 ；(2)取ImL状态2的藻液，迅速用液氮(77K)冷却，置于荧光分光光度计F-4500 (日本日立)的液氣样品池中；
(3)选择580nm激发光对样品进行扫描，得到状态2下的低温荧光光谱；(4)再将暗处理过的样品置于蓝光下，照射5min，从状态2诱导至状态I ;(5)测量状态I下的低温荧光光谱，同步骤(2)和步骤(3)；(6)将两条曲线作图进行比较分析，其中695nm荧光峰代表光系统II获得能量，725nm荧光峰代表光系统I获得能量。作图时对齐其中一个荧光峰(如对齐695nm荧光峰)，如另一个荧光峰下降或升高则说明发生了状态转换，如另一个荧光峰无变化则说明未发生状态转换。图3为用77K低温荧光法测量集胞藻6803状态转换的结果图，可以看出，当对齐光系统II荧光峰(695nm)后，状态2的光系统I荧光峰(725nm)高于状态1，这说明在状态2时，光系统I获得了比状态I更多的能量，这一结果与状态转换机制完全吻合，因此可 以判断经过诱导，样品发生了状态转换。进一步用最大叶绿素荧光法对集胞藻6803进行状态转换测量，步骤如下(I)取2mL集胞藻6803藻液加入调制叶绿素荧光测量系统Dual-PAM-IOO (德国WALZ)的样品池；(2)暗适应5min诱导状态2 ；(3)继续保持黑暗条件，并每隔20s打一个饱和脉冲记录Fm值，直至Fm值稳定；(4)Fm值稳定后打开蓝光，从状态2诱导至状态1，同时继续每隔20s打一个饱和脉冲，记录Fm’值,直至Fm’值稳定；(5)待Fm’值稳定后，关闭蓝光保持黑暗，从状态I诱导至状态2，继续每隔20s打一个饱和脉冲，记录Fm值,直至稳定；(6)比较Fm’值与Fm值的大�。绶⑸浠蛩得饔凶刺环⑸缥捶⑸浠蛭拮刺环⑸Ｍ�4为用最大叶绿素荧光法测量集胞藻6803状态转换的结果，可以看出，经过蓝光诱导后的Fm’显著高于经过暗诱导后的Fm，说明发生了状态转换。综上所述，利用本发明方法得出的结果与利用77K低温荧光法和最大叶绿素荧光法得出的结果一致，说明本发明方法可以用于测量状态转换。实施例2现以测量绿藻门莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的状态转换为实施例，用本发明方法测量其状态转换。
具体实施方式
如下(I)取一定量体积的莱茵衣藻藻液，放入多激发波长调制叶绿素荧光仪Multi-Color-PAM的样品池中，调节仪器设置使得初始Ft在0. 2-0. 5之间且稳定；(2)黑暗5min诱导至状态2 ；(3)打开特定波长的单周转饱和闪光测量快速荧光诱导动力学曲线；(4)利用仪器软件对快速荧光诱导动力学曲线进行拟合，并计算状态2下的捕光截面积Sigma(II) A值,绿藻的最佳吸收光区为蓝光区,故选择拟合Sigma(II)44cinm ；(5)对莱茵衣藻照射绿光5min,诱导至状态I ;(6)重复步骤(3)和步骤(4)，获得状态I下的捕光截面积Sigma(II)44tol值；(7)比较步骤⑷和步骤(6)测量的Sigma(II)44tol^，若Sigma (I D44tlnm增大，说明发生了状态转换，若无差别说明未发生状态转换；
(8)重复上述实验三次，结果如图5和图6所示。图5为用捕光截面积法测量绿藻门莱茵衣藻状态转换的原始曲线图，即快速荧光诱导动力学曲线图。图6为根据图5的结果得出的状态I和状态2下Sigma(II)44cinm值柱状图。可以看出，经过绿光诱导至状态I的莱茵衣藻捕光截面积Sigma(II)44cinm值显著高于经过暗诱导至状态2的值(**表示差异极显著)。这表示经过绿光诱导后，莱茵衣藻发生了明显的状态转换。由此，说明本发明方法可以用于测量状态转换。本发明在常温下测量活体藻液，无需用液氮冷冻样品，对样品无损伤且操作过程安全。本发明通过精确测量出的光系统II捕光截面积(单位为nm2)可以量化状态转换的程度。本发明对于样品的叶绿素浓度灵敏度极高，适用于很稀的藻液，因此可以用于测量自然水样中样品的状态转换。本发明虽然以较佳实施例公开如上，但其并不是用来限定本发明，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做出可能的变动和修改。因此，凡是未脱离 本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何修改、等同变化及修饰，均落入本发明权利要求所界定的保护范围之内。
权利要求
1.一种测量藻类状态转换的方法，包括步骤 1)取一定量体积的藻液作为样品，导入多激发波长调制叶绿素荧光仪的样品池中，将初始突光信号设置在O. 2 O. 5之间且稳定； 2)按常规方法将所述样品诱导至第一状态； 3)打开特定波长的单周转饱和闪光测量快速荧光诱导动力学曲线； 4)对所述快速荧光诱导动力学曲线进行拟合，并计算所述第一状态下的第一捕光截面积值； 5)按常规方法又将所述样品诱导至第二状态； 6)打开特定波长的单周转饱和闪光测量快速荧光诱导动力学曲线； 7)对所述快速荧光诱导动力学曲线进行拟合，并计算所述第二状态下的第二捕光截面积值； 8)比较所述第一捕光截面积值和所述第二捕光截面积值，若所述第一捕光截面积值大于或小于所述第二捕光截面积值，则认定所述藻类发生了状态转换；若两者无差別，则认定所述藻类未发生状态转换。
2.根据权利要求I所述的测量藻类状态转换的方法，其特征在于，所述第一状态为状态I或者状态2，所述第二状态相应地为状态2或者状态I。
3.根据权利要求2所述的测量藻类状态转换的方法，其特征在于，诱导至所述状态I的方法包括对所述样品照射红光、蓝光或者绿光5min，诱导至所述状态2的方法包括对所述样品暗置5min。
4.根据权利要求I所述的测量藻类状态转换的方法，其特征在于，所述藻液样品的体积为I 3mL。
5.根据权利要求I所述的测量藻类状态转换的方法，其特征在于，所述特定波长的单周转饱和闪光为所述样品的最佳吸收波长。
6.根据权利要求I所述的测量藻类状态转换的方法，其特征在于，所述藻类包括藍藻、緑藻和红藻。
全文摘要
本发明提供一种测量藻类状态转换的方法，包括步骤将一定量体积的藻液作为样品，导入多激发波长调制叶绿素荧光仪的样品池中，将初始荧光信号设置在0.2～0.5之间且稳定；将样品诱导至第一状态；打开特定波长的单周转饱和闪光测量快速荧光诱导动力学曲线；对快速荧光诱导动力学曲线进行拟合，并计算当前状态下的捕光截面积值；将样品诱导至第二状态；重复上述测量并拟合快速荧光诱导动力学曲线，获取当前状态下的捕光截面积值；比较两个捕光截面积值，认定藻类是否发生了状态转换。本发明可以安全、快速地活体测量藻类状态转换，能够在常温下进行，并可以量化状态转换的程度。
文档编号G01N21/64GK102680448SQ201210177918
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月31日 优先权日2012年5月31日
发明者吕中贤, 韩志国, 顾群 申请人:上海泽泉科技有限公司
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