亚星游戏官网-www.yaxin868.com

专利名称：基于多功能聚合物和荧光共振能量转移的抗体检测方法
技术领域：
本发明涉及一种生物纳米检测技术，尤其涉及一种抗体检测方法，借助于荧光共 振能量转移过程的信号放大作用，通过构建具有不同功能结构域的聚合物，实现目标抗体 的检测。
背景技术：
随着纳米技术的快速发展，已有多种纳米材料在生物医学领域得以应用。磁性纳 米颗粒就是一种很有应用前景的材料，其已在医学诊断和治疗方面表现出诸多特性。由于 磁性纳米颗粒能受外加磁场作用，使其在检测、纯化、排毒和给药等方面具有广泛应用。
焚光共振會邑量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)是 一个光物理过程，在此过程中能量从处于激发态的一个荧光团转移到另一个荧光团上 (MethodsMo 1. Biol.，2006，335，243-255)。荧光共振能量转移只有在两个荧光团距离接近 且两个荧光团的激发光谱和发射光谱相互重叠的情况下才会发生。分析学家利用这种现象 开发出各种基于荧光共振能量转移的检测方法，其中最为普遍的便是应用于实时聚合酶链 扩增技术当中(Real Time Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)。实时聚合酶链扩增利 用激发和发射光谱相互重叠的两种荧光团(报告基团和淬灭基团)标记于核酸探针的两端 而人为地制造荧光能量共振转移现象，在聚合酶链扩增反应过程中聚合酶剪切探针从而释 放出被淬灭的荧光团，随着扩增反应的进行，释放出来的荧光团越来越多，按靶分子比例增 加的荧光信号就可以对被扩增的靶分子进行定量。实时聚合酶链扩增最大的魅力就在于 其独特的信号放大体系以及达到数个拷贝靶核酸分子的灵敏度(Eur. Food Res. Technol., 2007,226,1438-2377)。尽管实时聚合酶链扩增最初是用于定量分析核酸分子，但这种独特 的信号放大体系使得研究人员将其创造性地设计成超灵敏的抗体检测方法-定量免疫聚 合酶链扩增(quantitative Immuno-PCR, qlPCR)，使其灵敏度较之传统的ELISA试验提高 7 10到1000倍(Nat. Protoc.，2007，2，1918-1930)。但该法的缺点也很明显，主要体现在 检测步骤过多(多达沈个实验步骤)和检测时间较长。
许多研究者已成功利用荧光技术实现了生物医学检测(Anal. Chem.，2006，78， 1104-1106 ；Anal. Chem.，2008，80，7996-8001 ；Nanoscale Res. Lett.，2009，4，1469-1474)， 但是这些技术几乎都依赖于对不同的确定量的荧光信号进行分析或对捕获探针的荧光信 号进行分析，没有对荧光信号进行任何的放大，使得样品中微量物质的检测仍存在较大的难度。发明内容
本发明的目的在于提供一种基于多功能聚合物和荧光共振能量转移的抗体检测 方法，通过构建具有不同功能结构域的聚合物，完成对目标分子的捕捉，并借助于荧光共振 能量转移过程对荧光信号进行放大，进而实现样品中微量抗体的检测。
多功能聚合物至少包括一个抗体结合结构域和一个核酸内切酶结构域。抗体结合结构域能与抗体结合，形成共价键或非共价键。共价键是化学键的一种，两个或多个原子共 同使用它们的外层电子，在理想情况下达到电子饱和的状态，由此组成比较稳定和坚固的 化学结构。通过简单的成酯、成醚或还原反应等化学过程就能使抗体结合结构域与抗体共 价结合，所形成的共价键，如但不仅限于，酰胺键、尿键、酯键、硫醚键、腙键、肟键和二硫键 等。非共价键并不依赖电子间的共享，而是依赖正负电荷间的吸引力，如但不仅限于，氢 键、疏水相互作用、范德华力和离子键等。例如葡萄球菌蛋白A(Pr0tein Α)能与抗体的Fc 片段非共价结合。
抗体结合结构域是由一种或多种单体分子依次相连并能与抗体结合的分子，其可 以通过人工方式制备，如但不仅限于，化学合成，基因工程克隆表达和酶工程将不同分子 片段连接等方式，或非人工方式制备，如从生物体直接分离得到。基因工程重组表达是 一种可选择的，通过人工制备得到抗体结合结构域的方式。即将与不同或相同抗体识别 表位相对应的DNA序列连接于表达载体上(如表达质粒)，再转导或转化入基因工程菌 后，再由发酵或细胞培养等方式进行表达，最后经过分离和纯化步骤得到。组成目标抗原 的基因数量不同，所适用的表达载体亦有不同。不同的表达载体也适用于不同的菌种或菌 株。常用的基因工程表达体系如大肠杆菌(Escherichia coli)、酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)和动物细胞等。本领域普通技术人员根据教科书、实验手册、设备手册(如 GE Healthcare为AKTA系列纯化系统配置的纯化指导手册或光盘)、试剂手册和相应的载 体设计软件(如=DNAMAN和Vector NTI Suite)及其使用说明就能够实现对目标抗体结合 结构域的制备。本领域技术人员所公知，一个具备一般生物学常识的技术人员根据“《分子 克隆实验指南》(第三版)，科学出版社，2002” 一书所记载的各种方法，就能够实现基因工 程领域的分子生物学各项操作和相应的分离纯化。
一种抗体结合结构域，是由一种或多种氨基酸，如但不仅限于，色氨酸、蛋氨酸、 苏氨酸、缬氨酸、赖氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、精氨酸、 甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸、谷氨酸、天(门)冬氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺，通过酰胺 键依次相连而形成的蛋白质或多肽，其能够与抗体结合。以蛋白质或多肽为表现形式的抗 体结合结构域可以通过噬菌体展示(Phage Display)或组合化学等高通量筛选技术获得， 并对结构域进行优化，还可以借助计算机软件(如=AcceIrys公司开发的各类系列软件)， 对与特定抗体结合的抗体结合结构域序列进行预测与优化。
核酸内切酶结构域是具有核酸酶特性，能对核酸底物进行酶切的物质，能使核酸 底物分成两段独立的核酸片段。核酸内切酶结构域为自然界中已存在的天然核酸内切酶的 氨基酸全序列或其同源序列或部分序列或其同源序列。部分序列是取自于天然核酸内切酶 的一段连续的氨基酸序列或其同源序列，也可以是将取自于天然核酸内切酶不同部分的几 段氨基酸序列互相连接形成的序列或其同源序列。将各个片段互相连接的方式包括但不 仅限于，各类聚合酶链扩增(Polymerase Chain Reaction, PCR)技术，分子克隆技术，以及 表达和纯化技术等，本领域技术人员通过单独或综合运用这些技术能够实现各个片段互相 连接。本发明核酸内切酶结构域优先从天然限制性核酸内切酶的全序列当中进行选择。本 发明优先从Mbo I限制性内切酶(D13968，Genbank)序列中确定核酸内切酶结构域。本发 明进一步优先选择的核酸内切酶结构域如SEQ ID No. 1所示。
通常情况下，需要一种连接子将多个不同功能的结构域互相连接起来形成多功能聚合物。连接子与不同功能的结构域之间形成共价键，如但不仅限于，酰胺键、尿键、酯键、 硫醚键、腙键、肟键和二硫键，各个结构域与连接子之间的共价键可以相同或不同。
连接子是由若干重复结构单位(structural unit)或单体(monomer)通过共价 键连接而成的分子，如但不仅限于，聚乙二醇(Adv. Drug deliv. Rev. ,28,275-299 ；Adv. Drug deliv. Rev.，54，453-609 ；Adv. Drug deliv. Rev.，60，1-88)、聚氨基酸、聚核苷酸、聚 乳酸、聚赖氨酸(Rev Mol Biotechnol.，2002，90，195-2 )、聚亚胺(Clin. Chem.，1994，40， 1845-1849 J. Immuno. Method.，1996，196，17-32)和10个以上单糖通过糖苷键形成的多聚 糖(polysaccharide)，如但不仅限于，淀粉及其水解产物、纤维素、甲壳素或葡聚糖。连接 子的分子形状为直线型(linear)、分枝型(branch/multi-arm)或分叉型(dendrimer)。一 种连接子，是由2-100个氨基酸形成的多肽或蛋白质，通常选择长度为4-40个氨基酸的多 肽，优先选择长度为4-30个氨基酸的多肽。组成这些多肽和蛋白质的氨基酸指既具有共价 连接氨基又共价连接羧基的不对称中心碳原子的有机分子。文献ftOtein Eng. ,2001,14, 529-532中提供并详细描述了多种用于多肽或蛋白连接的连接子，本领域普通技术人员可 以据此选择适合的连接子。本发明优先选择的连接子为由25个氨基酸组成的多肽，如SEQ ID No. 2 所示。
荧光共振能量转移核酸底物为双链DNA，含有一条荧光共振能量转移过程所需要 的核酸探针链。探针的5’端和3’端分别结合有荧光共振能量转移过程所需要的报告基 团(如FAM)和淬灭基团(如EclipSe)。荧光共振能量转移核酸底物还含有一段与所 选用的核酸内切酶结构域相对应的酶切位点，使得多功能聚合物对核酸底物进行酶切后， 报告基团产生荧光信号。例如多功能聚合物的蛋白核酸内切酶结构域选择SEQID No 1 所示的序列，荧光共振能量转移核酸探针链优先选择SEQ ID No 6所示的序列，淬灭基团 Eclipse (最大吸收峰为522nm)结合于核酸探针链3’端，报告基团FAM(最大发射波长为 520nm)结合于核酸探针链5’端。
本发明提供的基于多功能聚合物和荧光共振能量转移的抗体检测方法，先将第一 抗原固定于磁性纳米颗粒形成磁性抗原颗粒，然后与含有目标抗体的待测样品共混，使第 一抗原与目标抗体结合，之后向待测样品中加入多功能聚合物，使多功能聚合物中的抗体 结合结构域与目标抗体结合，形成形式为磁性抗原颗粒-目标抗体-多功能聚合物的复合 物，最后加入荧光共振能量转移核酸底物，使多功能聚合物中的核酸内切酶结构域对荧光 共振能量转移核酸底物进行酶切，使得待测样品中产生可检测的荧光信号。随着底物的增 加，其荧光信号也不断增强，待测抗体的检测信号的也被随之放大。
本发明提供的基于多功能聚合物和荧光共振能量转移的抗体检测方法，其核酸内 切酶结构域优选适用SEQ ID No. 1所示的序列或其同源序列。
本发明提供的基于多功能聚合物和荧光共振能量转移的抗体检测方法，其抗体结 合结构域优选适用SEQ ID No. 3所示的序列或其同源序列。
本发明提供的基于多功能聚合物和荧光共振能量转移的抗体检测方法，优选适用 SEQ ID No. 2所示的序列或其同源序列作为连接子。
本发明提供的基于多功能聚合物和荧光共振能量转移的抗体检测方法，多功能聚 合物优选适用SEQ ID No. 4所示的序列或其同源序列。与SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列 相应的核酸序列如SEQ ID No. 5所示。
另一种本发明提供的基于多功能聚合物和荧光共振能量转移的抗体检测方法，先 将第一抗原固定于磁性纳米颗粒形成磁性抗原颗粒，然后与含有目标抗体的待测样品共 混，使第一抗原与目标抗体结合，之后向待测样品中加入如SEQ ID No.4所示的多功能聚合 物，使多功能聚合物中的抗体结合结构域(SEQ ID No. 3)与目标抗体结合，形成形式为磁性 抗原颗粒-目标抗体-多功能聚合物的复合物，最后加入含有SEQ ID No. 6的荧光共振能 量转移核酸底物，使多功能聚合物中的核酸内切酶结构域对荧光共振能量转移核酸底物进 行酶切，使得待测样品中产生可检测的荧光信号。
本发明技术方案实现的有益效果
本发明提供的基于多功能聚合物和荧光共振能量转移的抗体检测方法，设计并得 到了同时具有抗体结合结构域和核酸内切酶结构域的多功能聚合物。当结合有荧光共振能 量转移的报告基团和淬灭基团的核酸底物被核酸内切酶结构域酶切后，报告基团即产生荧 光信号。随着核酸底物的不断向待测样品中加入，其荧光信号也不断增强，待测抗体的检测 信号的也被随之放大。
与ELISA “夹心法”检测相比，本发明提供的检测方法所用的检测总时间低于2. 5 小时，而所能实现的检测限度为0. lng/ml，显著提高了微量样品的检测能力和检测的准确性。
本发明所涉及的术语与其一般概念相同。
所述的“抗原”是能在机体中引起特异性免疫应答的物质。抗原进入机体后，可刺 激机体产生抗体和引起细胞免疫。在免疫测定中，抗原是指能与抗体结合的物质。抗原的 反应性取决于抗原决定簇(antigenic determinant)，亦称表位(印itope)。一个抗原分子 可带有不同的决定簇。此外，还可以通过基因工程或化学连接的方式对表位进行拼接。
所述的“抗体”是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(immimoglobulin，Ig)。Ig 分五类，即IgG, IgA, IgM, IgD和IgE0与免疫测定有关的Ig主要为IgG和IgM0
所述的“同源序列”是与天然序列之间具有40%以上同源性的序列，优先选择具有 70%以上同源性的序列，更优先选择具有90%以上同源性的序列，更优先选择具有95%以 上同源性的序列。“同源性”是反应两个或多个蛋白/多肽序列或两个或多个核苷酸序列之 间的关系，通过比较这些序列而确定。通常，同源性指所比较的序列长度上两个多核苷酸或 两个蛋白/多肽序列，它们的核苷酸与核苷酸或者氨基酸与氨基酸之间的对应是完全一 样的。
对于本领域技术人员而言，两个或多个序列同源性的比较方法已为他们所熟知， 例如BLAST和FASTA程序。本发明中，所述的40 %、50 %、60 %、70 %、80 %和90 %均为同 源性百分比。
本发明“同源序列”是在天然序列基础上采用“保守性”取代方式进行。保守性氨 基酸取代可包括一组内的同义氨基酸取代，同组氨基酸内的氨基酸具有足够相似的生理生 化特性，该组成员之间的取代将保留该分子的生物功能(kience，1974，185，862-4)。在上 述序列中也可进行氨基酸的插入或/和缺失而不改变其功能，特别是如果这种插入或缺失 只涉及少数氨基酸时，如30个以下，最好为10个以下，而且不除去或取代对功能性构型起 关键作用的氨基酸，如半胱氨酸残基。这类缺失或/和插入所产生的蛋白质和突变蛋白属 于本发明范围。
优先选择的，本发明同义氨基酸对SEQ ID No 1、SEQ ID No 3和SEQ ID No 4进行保守性取代的方式。
权利要求
1.一种基于多功能聚合物和荧光共振能量转移的抗体检测方法，先将第一抗原固定于 磁性纳米颗粒形成磁性抗原颗粒，然后与含有目标抗体的待测样品共混，使第一抗原与目 标抗体结合，之后向待测样品中加入多功能聚合物，使所述的多功能聚合物与目标抗体结 合，形成形式为磁性抗原颗粒-目标抗体-多功能聚合物的复合物，最后加入荧光共振能量 转移核酸底物，使得待测样品中产生可被检测的荧光信号。
2.根据权利要求1所述的基于多功能聚合物和荧光共振能量转移的抗体检测方法，其 特征在于所述的多功能聚合物至少包括一个抗体结合结构域和一个核酸内切酶结构域。
3.根据权利要求2所述的基于多功能聚合物和荧光共振能量转移的抗体检测方法，其 特征在于所述的抗体结合结构域是SEQ ID No. 3所示的序列或其同源序列。
4.根据权利要求2所述的基于多功能聚合物和荧光共振能量转移的抗体检测方法，其 特征在于所述的核酸内切酶结构域对所述的荧光共振能量转移核酸底物进行酶切。
5.根据权利要求2所述的基于多功能聚合物和荧光共振能量转移的抗体检测方法，其 特征在于所述的核酸内切酶结构域是SEQ ID No. 1所示的序列或其同源序列。
6.根据权利要求2所述的基于多功能聚合物和荧光共振能量转移的抗体检测方法，其 特征在于所述的多功能聚合物至少包括一个连接子，所述的抗体结合结构域和所述的核酸 内切酶结构域分别与连接子连接。
7.根据权利要求2所述的基于多功能聚合物和荧光共振能量转移的抗体检测方法，其 特征在于所述的连接子是SEQ ID No. 2所示的序列或其同源序列。
8.根据权利要求1所述的基于多功能聚合物和荧光共振能量转移的抗体检测方法，其 特征在于所述的多功能聚合物是SEQ ID No. 4所示的序列或其同源序列。
9.根据权利要求1所述的基于多功能聚合物和荧光共振能量转移的抗体检测方法，其 特征在于所述的荧光共振能量转移核酸底物含有SEQ ID No 6所示的荧光共振能量转移核 酸探针链。
10.一种基于多功能聚合物和荧光共振能量转移的抗体检测方法，先将第一抗原固定 于磁性纳米颗粒形成磁性抗原颗粒，然后与含有目标抗体的待测样品共混，使第一抗原与 目标抗体结合，之后向待测样品中加入多功能聚合物，使所述的多功能聚合物与目标抗体 结合，形成形式为磁性抗原颗粒-目标抗体-多功能聚合物的复合物，最后加入荧光共振能 量转移核酸底物，使得待测样品中产生可被检测的荧光信号；所述的多功能聚合物是SEQ ID No. 4所示的序列或其同源序列；所述的荧光共振能量转移核酸底物含有SEQ ID No 6所示的荧光共振能量转移核酸探 针链。
全文摘要
一种基于多功能聚合物和荧光共振能量转移的抗体检测方法，先将第一抗原固定于磁性纳米颗粒形成磁性抗原颗粒，然后与含有目标抗体的待测样品共混，使第一抗原与目标抗体结合，之后向待测样品中加入多功能聚合物，使所述的多功能聚合物与目标抗体结合，形成形式为磁性抗原颗粒-目标抗体-多功能聚合物的复合物，最后加入荧光共振能量转移核酸底物，使得待测样品中产生可被检测的荧光信号。与ELISA“夹心法”检测相比，本发明提供的检测方法所用的检测总时间低于2.5小时，而所能实现的检测限度为0.1ng/ml，显著提高了微量样品的检测能力和检测的准确性。
文档编号G01N21/64GK102033057SQ20101054799
公开日2011年4月27日 申请日期2010年11月17日 优先权日2010年11月17日
发明者崔大祥, 杨浩, 胡恒瑶 申请人:上海交通大学, 苏州康立达纳米生物工程有限公司