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专利名称：丁胺卡那霉素elisa检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种检测丁胺卡那霉素的酶联免疫试剂盒。
背景技术：
氨基糖苷类抗生素(AGs)是由氨基糖与氨基环醇形成的苷，AGs的结构和理化性质相似。由于结构中含有多个氨基和羟基，故呈碱性，极性和水溶性较高。AGs的抗菌作用强，属常用的抗生素。常用的氨基糖苷类药物含有I个1，3或1，4 二氨基环多醇和I或2个氨基糖。根据氨基环多醇的结构，可将AGs划分为两大类链霉胺类和2-脱氧链霉胺类。按其来源，AGs又可分为由链霉菌产生的抗生素，包括链霉素族、卡那霉素族和新霉素族；有小单孢菌产生的抗生素，主要包括庆大霉素族。丁胺卡那霉素(Amikin)又名阿米卡星，是卡那青霉素a的半合成衍生物的硫酸盐。临床主要用于对庆大霉素、卡那霉素耐药的革兰阴性杆菌如大肠杆菌、变形杆菌和绿脓杆菌引起的各种感染。长期或反复大量摄入丁胺卡那霉素可导致前庭神经和听神经损害，肾脏出现轻度损害，严重者可出现肾功能衰竭。卡那霉素属于氨基糖苷类抗生素，被广泛用于治疗猪、牛、鸡等由金黄色葡萄球菌及结核杆菌所致的各种感染。为保证我国出口禽肉的卫生质量和食用安全，促进禽肉出口，国家质量监督检验检疫局2002年第37号文件中规定了禁用药物和允许使用药物。其中，丁胺卡那霉素最大残留限量为肌肉100μ g/kg ;肝300yg/kg。日本肯定列表制度将其列为使用一律标准物质，即最大残留为10 μ g/kg。目前对氨基糖苷类抗生素残留的检测方法主要有高效液相法、微生物法、免疫分析法，此外还有一些其他方法用于氨基糖苷类药物的分析，例如电化学法、薄层色谱法、质谱法等。采用微生物法，不适于快速检测。色谱法需要复杂昂贵的仪器，且样品前处理过程繁琐，不适应现场大量样本的筛查。

实用新型内容本实用新型所要解决的问题是提供一种小巧轻便的丁胺卡那霉素残留检测试剂盒，其操作简便，检测快速、准确、灵敏度高，成本低，稳定性好，需要的技术含量不高，可进行一次连续多个样品中丁胺卡那霉素残留量的测定，减少了检测样本所需要的时间。本实用新型的技术方案是一种丁胺卡那霉素ELISA检测试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、14瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，其特征在于酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被丁胺卡那霉素偶联抗原制成的检测板，14瓶试剂分别6瓶标准品溶液、I瓶高浓度标准品溶液、酶标二抗、抗体工作液、底物液A液、底物液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液，下凹瓶位共15个。盒体是硬纸盒；96孔的聚苯乙烯酶标板，放于真空铝箔袋内；盖板膜是塑料硬膜；标准品溶液和高浓度标准品溶液均用黑色帽的棕色玻璃瓶，酶标二抗用红色帽的白色PE塑料瓶，抗体工作液用绿色帽的白色PE塑料瓶，底物液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，底物液B液用红色帽的黑色PE塑料瓶，终止液用黄色帽的白色PE塑料瓶，浓缩洗涤液用透明帽的半透明PE塑料瓶，浓缩复溶液用蓝色帽的半透明PE塑料瓶，下凹瓶位由塑料泡沫制成。酶标板是由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔，每个反应孔预包被丁胺卡那霉素偶联抗原；盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；标准品溶液6瓶，Iml/瓶，浓度分别为O μ g/L, I μ g/L, 3 μ g/L, 9 μ g/L, 27 μ g/L ,81 μ g/L ;高浓度标准品溶液I瓶，Iml ;酶标二抗I瓶，7ml ;抗体工作液I瓶，7ml ;底物液A液I瓶，7ml ;底物液B液I瓶，7ml ;终止液I瓶，7ml ;浓缩洗涤液I瓶，40ml ;浓缩复溶液I瓶，50ml。每一个试剂盒中的试剂足够进行96次测定(包括标准分析孔)，既可进行一次连续多个样品的检测，也可以将板孔拆开多次检测。将剩下的放回铝箔袋中用自封袋密封，这样可以保证试剂盒检测结果的准确性。检测时，样本中的丁胺卡那霉素将和酶标板微孔条上预包被的丁胺卡那霉素偶联抗原竞争抗丁胺卡那霉素抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物 显色，样本吸光度值与样本中所含丁胺卡那霉素的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中丁胺卡那霉素含量，其操作简便易行。经实验表明本试剂盒检测鸡蛋中丁胺卡那霉素残留，具有很高的灵敏度，样本的最低检测限为5μ g/kg，回收率为90%±15%。相对于采用仪器方法检测丁胺卡那霉素，本试剂盒所需仪器较少，只需要酶标仪、涡旋仪、离心机、匀浆机和微量加样器等，同类实验室一般均有配备，所需成本较低。本实用新型的有益效果是能快速、简便、灵敏、准确地用于丁胺卡那霉素残留量的检测。

图I为本实用新型酶标板的侧面纵剖面图(长为8. 55cm)；图2为本实用新型酶标板的侧面横剖面图(长为12. 8cm)；图3为本实用新型酶标板的俯视图；图4为本实用新型盖板膜平面图；图5 5a、5b、5c、5d为本实用新型试剂瓶纵剖面平面图；图6为本实用新型固定泡沫模具俯视图；图7为本实用新型盒体与固定泡沫模具侧视图。参见附图酶标反应微孔条(2)预包被丁胺卡那霉素偶联抗原(3)固定于酶标板的外框支撑架(I)上，酶标反应微孔条(2)可随要求拆卸；盖板膜(4)用于酶标板置水浴或恒温箱内反应时封盖酶标反应微孔条(2)，盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；透明帽的半透明塑料试剂瓶(5)用于封装40ml浓缩洗涤液；蓝色帽的半透明塑料试剂瓶(5)用于封装50ml浓缩复溶液；白色帽的白色塑料试剂瓶(6)用于封装7ml底物液A液，红色帽的黑色塑料试剂瓶(6)用于封装7ml底物液B液，黄色帽的白色塑料试剂瓶(6)用于封装7ml终止液，红色帽的白色塑料试剂瓶(7 )用于封装7ml酶标二抗，绿色帽的白色塑料试剂瓶(7 )用于封装7ml 丁胺卡那霉素抗体工作液，黑色帽的棕色玻璃瓶(8)用于封装Iml/瓶的标准品溶液及Iml高浓度标准品溶液；盒体为(9)是硬纸盒；泡沫塑料模具(10)有15个瓶位，放置位置依次为40ml浓缩洗涤液瓶位(18)，50ml浓缩复溶液瓶位(11 )，7ml底物液A液瓶位(14)，7ml底物液B液瓶位(13)，7ml终止液瓶位(12)，7ml 丁胺卡那霉素抗体工作液瓶位
(16)，7ml酶标二抗瓶位(15)，6种Iml/瓶各种浓度的标准品溶液及I瓶Iml高浓度标准品溶液瓶位(17)。
具体实施方式
一、样本的前处理I.配液配液I :3%三氯乙酸溶液称取3. OOg三氯乙酸加入去离子水IOOml使其完全溶解。配液2:复溶工作液用去离子水将2 X浓缩复溶液按I: I体积比进行稀释(I份2 X浓缩复溶液+1份去离子水)用于样本的复溶，复溶工作液在4°C环境可保存一个月。配液3 :洗涤工作液用去离子水将20 X浓缩洗涤液按1:19体积比进行稀释(I份20X浓缩洗涤液+19份去离子水)用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4°C环境可保存一个月。2.鸡蛋样本前处理方法先将蛋清和蛋黄充分震荡或涡动，使其混合均匀；称取I. 0g±0. 05g均质物至IOml聚苯乙烯离心管中，分别加入Iml 3%三氯乙酸溶液，Iml三氯甲烷和2 ml乙酸乙酯，用涡旋仪涡动3min ；3000g以上，室温(20_25°C /68-77 °F)离心5min ;移取400 μ I上清液至2ml聚苯乙烯离心管中，再加入600 μ I复溶工作液涡动混匀，取50 μ I用于分析。二、使用试剂盒的操作步骤I、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(20_25°C)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2_8°C。3、洗涤工作液在使用前也需回温。4、编号将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。5、加标准品/样本、酶标二抗和抗体工作液加标准品/样本50 μ I到对应的微孔中，再加酶标二抗50 μ I/孔，最后加抗体工作液50 μ I/孔轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应30min。6、洗板小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250 μ I/孔，充分洗涤4 一 5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)。7、显色加入底物液A液50μ I/孔，再加入底物液B液50μ I/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应15min。8、测定加入终止液50μ I/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处(建议用双波长450/630nm检测，请在5min内读完数据)，测定每孔OD值。三、结果判定结果判定有两种方法，粗略判定可用第I种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与丁胺卡那霉素含量成负相关。I、用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(μ g/L)。例如样本I的吸光度值为O. 351，样本2的吸光度值为O. 801，标准品吸光度值分别是0μ g/L为
2.014 ; I μ g/L 为 I. 518 ;3 μ g/L 为 I. 182 ；9 μ g/L 为 O. 648 ；27 μ g/L 为 O. 287 ；81 μ g/L 为
O.105。则样本I的浓度范围是9 μ g/L -27 μ g/L再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中残留的丁胺卡那霉素浓度范围；样本2的浓度范围是3 μ g/L -9 μ g/L，再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中残留的丁胺卡那霉素浓度范围。2、定量分析(I)百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(O标准)的吸光度值，再乘以100%，即
B
百分吸光度值(％) = - X100%
B0B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值B0-0μδ/ 标准溶液的平均吸光度值(2)标准曲线的绘制与计算以标准品百分吸光率为纵坐标，以丁胺卡那霉素标准品浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中丁胺卡那霉素实际含量。四、注意事项I、室温低于20°C或试剂及样本没有回到室温(20-25°C )会导致所有标准的OD值偏低。2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。3、每加一种试剂前需将其摇匀。4、反应终止液为2mol/L硫酸,避免接触皮肤。5、不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试齐U，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。6、储存条件保存试剂盒于2_8°C，不要冷冻，将不用的酶标板微孔板放进自封袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。7、试剂变质的迹象发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。O标准的吸光度(450/630nm)值小于O. 5 (A450nm<0. 5 )时,表不试剂可能变质。8、在加入底物液A液和底物液B液后，一般显色10_15min即可。若颜色较浅,可延长反应时间到20min (或更长),但不得超过25min。反之,则减短反应时间。
权利要求1.一种丁胺卡那霉素ELISA检测试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、14瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，其特征在于酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被丁胺卡那霉素偶联抗原制成的检测板，14瓶试剂分别6瓶标准品溶液、I瓶高浓度标准品溶液、酶标二抗、抗体工作液、底物液A液、底物液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液，下凹瓶位共15个。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于盒体是硬纸盒；96孔的聚苯乙烯酶标板，放于真空铝箔袋内；盖板膜是塑料硬膜；标准品溶液和高浓度标准品溶液均用黑色帽的棕色玻璃瓶，酶标二抗用红色帽的白色PE塑料瓶，抗体工作液用绿色帽的白色PE塑料瓶，底物液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，底物液B液用红色帽的黑色PE塑料瓶，终止液用黄色帽的白色PE塑料瓶，浓缩洗涤液用透明帽的半透明PE塑料瓶，浓缩复溶液用蓝色帽的半透明PE塑料瓶，下凹瓶位由塑料泡沫制成。
3.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于酶标板是由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔，每个反应孔预包被丁胺卡那霉素偶联抗原；盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；标准品溶液6瓶， Iml/瓶，浓度分别为 O μ g/L, I μ g/L, 3 μ g/L,9y g/L,27 μ g/L ,81 μ g/L ;高浓度标准品溶液I瓶，Iml ;酶标二抗I瓶，7ml ;抗体工作液I瓶，7ml ;底物液A液I瓶，7ml ;底物液B液I瓶，7ml ;终止液I瓶，7ml ;浓缩洗涤液I瓶，40ml ;浓缩复溶液I瓶，50ml。
专利摘要本实用新型涉及一种检测丁胺卡那霉素的酶联免疫试剂盒。该试剂盒组成包括96孔酶标板、酶标二抗、丁胺卡那霉素抗体工作液、6个浓度的标准品溶液、高浓度标准品、底物液A液、底物液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液。采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的丁胺卡那霉素将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗丁胺卡那霉素抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中丁胺卡那霉素的含量。与仪器分析技术相比具有使用方便、高灵敏度等特点，可在丁胺卡那霉素的残留检测中发挥重要作用。
文档编号G01N33/545GK202794176SQ201220298550
公开日2013年3月13日 申请日期2012年6月19日 优先权日2012年6月19日
发明者万宇平, 何方洋, 罗晓琴, 罗贵昆, 杨秀贤, 扶胜, 郝士元, 菅艳红 申请人:北京勤邦生物技术有限公司