试样观察方法及试样前处理方法
【专利摘要】减少水生生物内外的渗透压差，防止从生物试样内部的脱水，由此，不会破环浸渍于离子液体水溶液中的水生生物的自然的形态，且保持外骨骼及关节部的柔软性。首先向浓度低的离子液体投入水生生物，使离子液体的浓度连续升高，由此在保持水生生物的生物体时的形状的状态下，将水生生物内的水分置换成浓度高的离子液体水溶液。通过利用自然干燥产生的缓慢的离子液体水溶液的浓度上升，由此减少水生生物内外的渗透压差并使水生生物内部的离子液体浓度连续升高。
【专利说明】试样观察方法及试样前处理方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及将观察对象利用包含离子液体的水溶液进行置换并利用扫描电子显 微镜等带电粒子线装置进行观察的方法、及使用设置在带电粒子线装置内的探针来进行观 察对象的操作的方法。
【背景技术】
[0002] 为了对桡足动物、剑形水蚤、水蚤、钩虾、磷虾、糠虾、涟虫、鲎虫等微小甲壳类、大 型甲壳类的无节幼虫、腺介幼虫、蚤状幼虫、微细幼虫、以及轮虫或变形虫等浮游动物、蓝 藻、绿藻、薄鞭毛藻类等浮游植物等的微小水生生物进行调査?研究，显微镜下的形态观察 是必须的。尤其是在微小甲壳类、大型甲壳类的幼虫的分类法中，被称为附肢的微细的腿的 形态观察被认为是重要的。甲壳类的附肢复杂地互相缠绕，因此为了进行详细的观察，需要 对各个附肢进行分离?解剖。以往，虽然甲壳类的附肢的分离?解剖能够在光学显微镜下 实施，但是在光学显微镜下，解剖器具的操作困难，解剖需要熟练的技术。
[0003] 电子显微镜的焦点深度深，适合于生物的立体的形状的观察，在电子显微镜的试 样室内能够操作的探针也存在。然而，当将微小水生生物从水中取出并暴露在大气中时，会 发生干燥、收缩而无法保留原形。尤其是微小甲壳类或大型甲壳类的幼虫，即便在使用乙 醇、戊二醛、福尔马林等进行了固定的情况下，也会产生由干燥、收缩引起的变形。在利用电 子显微镜进行水生生物的观察的情况下，需要从水或密封剂中取出水生生物，进而放入到 真空环境下，因此难以在无试样前处理的情况下进行电子显微镜观察。
[0004] 为了解决该问题，进行了电子显微镜用的试样前处理方法的开发。代表性的例子 是使用能够在低真空气氛中（1.3?270Pa)从零下几十度到室温附近地进行试样温度的控 制的低真空低温台来防止生物体软组织的形态破坏的方法。例如，在非专利文献1中，使用 上述方法，成功地进行了牵牛花叶原基的低温观察。
[0005] 另一方面，作为在电子显微镜下对液体中的微细试样进行观察及控制的方法，开 发了使用离子液体的方法。在专利文献1中记载了利用即使在真空中也不蒸发的离子液体 的特性而能够将生物体试样以保持原形的状态在电子显微镜下进行观察的方法。尤其是记 载了将含有水分的试样浸渍在离子液体中然后在真空下将水分除去的方法、以及将用醇等 溶剂稀释后的离子液体涂敷在试样上然后在真空下将溶剂除去的方法。
[0006] 在该发明之后，使用了离子液体的生物试样的观察方法不断地发展。例如，在非专 利文献2中，报告了如下情况：向进行了基于锇酸的蒸气固定的琼脂培养基所培养出的抗 酸菌的集群滴下离子液体，得到了认为是抗酸菌的集群的原本结构的图像。
[0007] 在专利文献2中，公开了使用特定的离子液体来提高离子液体向生物体试样的渗 透性的内容。作为实施例，示出了裙带菜、菠菜的茎、棉布、毛发、老鼠的骨头、红血球、链球 菌的观察例。而且，记载了将该离子液体溶解于水等极性溶剂而形成液状介质、并将该液状 介质向试样含浸、涂敷、雾状喷射的方法。
[0008] 【在先技术文献】
[0009] 【专利文献】
[0010] 【专利文献1】国际公开第2007/083756号（US2009/0173882)
[0011]【专利文献2】日本特开2011-137807号公报
[0012] 【非专利文献】
[0013] 【非专利文献1】植田和弘、山田满彦、后藤真知夫、松岛久、久保木健三，基于低真 空SEM的低温观察的尝试，日本电子显微镜学会第49回学术讲演会预备稿集，社团法人日 本电子显微镜学会，P274,1993
[0014] 【非专利文献2】横山满、小川绿（小川A e >9 )、市原刚志，基于离子液体的抗酸菌 的SEM观察，医学生物学电子显微镜技术学会第27回学术讲演会及总会纲要?预备稿集， 医学生物学电子显微镜技术学会，P29, 2011
【发明内容】
[0015] 【发明要解决的课题】
[0016] 在专利文献1中，示出了利用离子液体即使在真空中也不蒸发的特性而能够将生 物体试样以保持原形的状态在电子显微镜下进行观察的方法，但是当向耐受渗透压的变化 弱的水生生物直接涂敷离子液体或者向离子液体中投入水生生物时，存在因渗透压差而使 水生生物内的水分丧失，即使在离子液体中水生生物也会干涸的问题。
[0017] 而且，在专利文献1记载的方法中，将利用醇等溶剂稀释后的离子液体向试样涂 敷并将溶剂在真空下除去，因此存在溶剂在真空中发生溯沸的可能性。在水生生物具有的 壳的内部（生物体内）发生溯沸的情况下，壳的内压急剧升高，存在壳破坏而壳的碎片飞散 的可能性。因此，不仅发生试样破坏，而且存在将SEM试样室内污染的可能性。
[0018] 在专利文献2中，虽然记载了将离子液体溶解于水等极性溶剂来形成液状介质、 并将该液状介质向试样含浸、涂敷、雾状喷射的方法，但是关于溶剂的除去方法完全没有公 开。
[0019] 本发明的目的在于提供一种试样观察方法，在使用离子液体水溶液来抑制耐受渗 透压的变化弱的水生生物的形态的变化、损伤的状态下利用电子显微镜等带电粒子线观察 装置进行观察。
[0020] 【用于解决课题的方案】
[0021] 本发明的试样观察方法的特征在于，将所述观察对象浸渍于包含离子液体的溶液 中，在使包含离子液体的溶液的渗透压与观察对象的内部的渗透压相抗衡的状态下，使包 含离子液体的溶液干燥，由此使溶液中的离子液体的浓度上升，向内部含浸有离子液体的 观察对象照射带电粒子线而取得观察对象的图像。
[0022] 【发明效果】
[0023] 根据本发明，能够在使用离子液体水溶液来抑制耐受渗透压的变化弱的水生生物 的形态的变化、损伤的状态下利用电子显微镜等带电粒子线观察装置进行观察。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1是实施例1的电子显微镜的试样室侧视图。
[0025] 图2是表示实施例1的试样观察方法的次序的说明图。
[0026] 图3是实施例1中的向利用水置换后的钩虾滴下离子液体水溶液的状态的说明 图。
[0027] 图4是在实施例1中，在钩虾的内部含浸有离子液体的状态的说明图。
[0028] 图5是表示使前端部变细的纸与钩虾接触，由此将附着在腿的周围等细小的部位 上的离子液体水溶液除去的方法的说明图。
[0029] 图6是实施例1中的钩虾的电子显微镜图像。
[0030] 图7是实施例1中的从背面观察到的钩虾的电子显微镜图像。
[0031] 图8是实施例1中的使电子显微镜用的试样台倾斜45°而拍摄到的钩虾的电子显 微镜图像。
[0032] 图9是表示不使用实施例1的方法而观察钩虾的例子的电子显微镜图像。
[0033] 图10是实施例2中的桡足动物的电子显微镜图像。
[0034] 图11是表示不使用实施例2的方法而观察桡足动物的例子的电子显微镜图像。
[0035] 图12是表示使用设置在电子显微镜的试样室内的探针在电子显微镜观察下对含 浸有离子液体水溶液的水生生物进行解剖的说明图。
【具体实施方式】
[0036] 首先，更详细地说明现有技术的课题。
[0037] 在利用冷冻后的常温真空干燥的现有方法即非专利文献1中，存在关节等的柔软 性丧失而难以移动腿或其他的可动部这样的问题。因此，在利用设置在电子显微镜的试样 室内的探针等尝试进行水生生物的解剖的情况下，干燥的水生生物可能会发生破损。
[0038] 在专利文献1中，示出了利用离子液体即使在真空中也不蒸发的特性而能够将生 物体试样以保持原形的状态在电子显微镜下进行观察的方法，但是当向耐受渗透压的变化 弱的水生生物直接涂敷离子液体或者向离子液体中投入水生生物时，存在因渗透压差而使 水生生物内的水分丧失，即使在离子液体中水生生物也会干涸的问题。而且，虽然记载了将 利用醇等溶剂稀释后的离子液体向试样涂敷的方法，但是由于将溶剂在真空下除去，因此 存在溶剂在真空中发生溯沸的可能性。
[0039] 在非专利文献2中，在基于锇酸的蒸气固定后，向利用琼脂培养基培养的抗酸菌 的集群滴下离子液体，得到了良好的结果。然而，微小甲壳类等水生生物远比抗酸菌等微生 物大型，因此离子液体与生物体内的渗透压差所引起的脱水·破坏效果成为无法忽视的大 问题。而且，锇酸的蒸气的毒性高，也存在安全性的问题。在锇酸的蒸气固定法以外的基 于戊二醛的化学固定中，也难以得到能够与渗透压差产生的破坏强度相抗衡那样的机械强 度。
[0040] 在专利文献2中，示出了裙带菜、菠菜的茎、棉布、毛发、老鼠的骨头、红血球、链球 菌的观察例，但未示出水生生物的观察例。专利文献2所示的生物体组织为多孔质，溶剂迅 速地向试样内部渗透。另一方面，为了非破坏地观察微小甲壳类等具有壳（外骨骼）的水 生生物的形状，当然需要使离子液体透过非破坏的外骨骼而向固体整体渗透，与生物体组 织相比，浸渍或干燥花费时间。而且，水生生物的外骨骼有时不渗离子液体，因此存在必须 将微小甲壳类等水生生物强制性地沉入到离子液体之中的情况。因此，使用离子液体水溶 液来观察水生生物的方法与使离子液体向解剖完的生物组织或游离细胞渗透的方法需要 发明出根本不同的方案。
[0041] 另外，在专利文献2中虽然记载了将离子液体溶解于水等极性溶剂而形成液状介 质、并将该液状介质向试样含浸、涂敷、雾状喷射的方法，但是对于溶剂的除去方法没有公 开。
[0042] 在本发明中，首先向浓度低的离子液体（2?10% )投入水生生物，连续地提高离 子液体的浓度，由此在保持水生生物的生物体时的形状的状态下将水生生物内的水分置换 成浓度高的离子液体水溶液。由此，能够实现如下情况：减少水生生物内外的渗透压差，能 够防止从生物试样内部的脱水，不会破坏浸入到离子液体水溶液中的水生生物的自然的形 态，且保持外骨骼及关节部的柔软性。尤其是通过利用基于自然干燥的缓慢的离子液体水 溶液的浓度上升，从而实现了减少水生生物内外的渗透压差并使水生生物内部的离子液体 浓度平缓地升高。
[0043] 以下，使用附图，对本申请发明的各实施例进行说明。
[0044] 需要说明的是，在以下的实施例中列举扫描电子显微镜（SEM)来进行说明，但本 发明没有限定于此。本发明能够适用于使用了扫描透射电子显微镜（STEM)、离子显微镜或 者带电粒子线的试样观察装置等所进行的观察。
[0045] 另外，以下，作为试样或观察对象，列举水生生物来进行说明，但本发明没有限定 于此。本发明对于耐受渗透压的变化或干燥弱的观察对象特别有效。作为观察对象，可考 虑例如桡足动物、剑形水蚤、水蚤、钩虾、磷虾、糠虾、涟虫、鲎虫等微小甲壳类、大型甲壳类 的无节幼虫、腺介幼虫、蚤状幼虫、微细幼虫、以及轮虫或变形虫等浮游动物、蓝藻、绿藻、薄 鞭毛藻类等浮游植物等的微小水生生物、吸水性树脂、琼脂、明胶、筠篛等耐受渗透压的变 化弱的观察对象、线虫、蚯蚓、蛲虫等那样即使在常压环境下因干燥也会发生变形的观察对 象、昆虫、蜱、蜘蛛等那样虽然在常压下能抵抗干燥但是在真空环境下发生变形的观察对 象。
[0046] 【实施例1】
[0047] 图1示出本实施例的电子显微镜的试样室侧视图。本实施例的电子显微镜是扫描 电子显微镜，虽然未图示，但是具备产生电子线的电子枪、包括使电子线会聚的透镜系统和 使电子线偏转以在试样上进行扫描的偏转器的电子光学系统、对电子光学系统进行控制的 控制部、基于来自检测器的信号而生成资料的图像的图像生成部、显示拍摄到的图像的显 示器等显示部、对扫描电子显微镜的各功能进行操作的鼠标或控制台等操作部、对在内部 具有电子源或电子光学系统的镜筒进行真空排气的真空泵。可以通过该真空泵将试样室排 气成低真空或高真空，也可以通过其它的真空泵对试样室进行排气，通常电子显微镜的试 样室保持为真空状态，因此试样在真空状态下被观察。需要说明的是，上述的控制部、图像 生成部可以通过专用的电路基板而作为硬件构成，也可以通过与电子显微镜连接的计算机 所执行的程序来构成。
[0048] 试样室内部包括电子显微镜的物镜1、从电子显微镜的物镜1向含浸有离子液体 水溶液的试样2照射的电子束3、对来自含浸有离子液体水溶液的试样2的反射电子信号4 进行检测的反射电子检测器5、对来自含浸有离子液体水溶液的试样2的二次电子信号6进 行检测的二次电子检测器7。有时也将通过向试样照射电子束而得到的信号即二次电子、反 射电子等统称为二次粒子。含浸有离子液体水溶液的试样2载放于电子显微镜用的试样台 8之上。试样台的材质通常为铝，但是为了得到将试样台上的多余的离子液体除去的效果， 也可以使用吸水性的材质、例如碳制试样台。
[0049] 在本实施例中，说明以海洋的主要的水生生物即钩虾为试样、并以含浸有离子液 体水溶液的水生生物为观察对象的试样来进行观察的方法。在此的实施例的形态没有限定 为钩虾，也可以适应于以节肢动物、浮游生物、培养细胞为代表的水生生物的观察、耐受渗 透压的变化弱的其他的试样。在本实施例中使用的钩虾是体长3mm以下且在浓度90%以上 的乙醇溶液中保存了 1?4个月的钩虾，但也可以使用刚采集之后的试样。
[0050] 图2是表示通过本发明的实施方式得到钩虾的电子显微镜图像的次序的说明图。 首先将保存在乙醇溶液中的钩虾放入水中，利用水来置换乙醇。此时，在乙醇溶液中为半透 明的钩虾的体色在利用水置换之后变化为不透明、白色。在本实施例中将钩虾浸渍于水中 的时间为80分钟，但只要能确认到体色的变化即可，可以是更短的时间。接着从水中将钩 虾捞起，载放于电子显微镜用的试样台上，利用滤纸等吸引多余的水分。以上的步骤在使用 刚采集之后的钩虾时等试样的内部预先含有水的情况下可以省略。
[0051] 在吸收了多余的水分之后，在试样干燥之前迅速地利用吸移管等滴下少量的离子 液体水溶液。图3是表示此状态的说明图。在图3中，将内部用水置换后的钩虾10载放在 试样台8上。从其上方通过吸移管11滴下离子液体水溶液9。在刚滴下之后，由于钩虾10 的内部由水含浸着，因此钩虾的体色仍然为不透明或白色。
[0052] 在钩虾的情况下，最佳的离子液体水溶液的浓度为2?5%，但是该浓度根据生物 的种类的不同或原料、组成、渗透压的不同而有所不同。其中，从抑制渗透压的变化所引起 的试样的破坏或收缩的观点出发，离子液体水溶液中的离子液体的浓度优选为10%以下。 在本实施例中使用了 20ml的离子液体水溶液，但只要能将水生生物浸渍在离子液体水溶 液中即可，可以比20ml多，也可以比20ml少。离子液体优选具有亲水性的性质，在本实施例 中使用了具有C 8H15N2BF4的化学式的离子液体。而且，虽然示出了使用水作为离子液体溶液 的溶剂的例子，但也可以是其他的溶剂。作为溶剂，除了水之外，还可考虑例如乙醇、甲醇、 丙酮、己烷、乙醚、含有甲醛的福尔马林。
[0053] 在向钩虾滴下了离子液体水溶液之后，实施2小时以上的风干。需要说明的是，以 下所说的风干是指通过在大气压下放置一定时间由此自然地使溶剂蒸发（自然干燥）的方 法。而且，也可以有意地吹风而加快干燥，还可以放置在调整了湿度的干燥器内或进行过热 来加快干燥。如此，以下所说的风干及自然干燥也包含控制了温度或湿度的状态。当控制 温度或湿度时，能够控制溶剂干燥的速度。
[0054] S卩，只要是在使离子液体水溶液的渗透压与观察对象的内部的渗透压相抗衡的状 态下使离子液体水溶液干燥，由此使溶液中的离子液体的浓度上升那样的溶剂除去方法即 可。根据本实施例的干燥方法，溶液中的离子液体的浓度连续且平缓地上升。而且，在本实 施例的方法中，使试样浸渍于离子液体水溶液的同时使溶剂蒸发，因此能够保持使离子液 体水溶液的渗透压与观察对象的内部的渗透压相抗衡的状态。
[0055] 利用自然干燥，从作为初始溶液的低浓度（约2?10% )的离子液体起使浓度平 缓地上升，由此能够防止渗透压差引起的试样破坏，且能够将浓度提高至即使在真空中也 不会发生干燥破坏的浓度。
[0056] 另外，也可以准备浓度不同的多个离子液体溶液，依次提高浸渍试样的溶液的浓 度而进行置换，但是利用自然干燥的话简便得多。
[0057] 图4是图示了从图3的状态起经过了 4小时的状态的说明图。离子液体水溶液通 过风干而量逐渐减少，最终也使钩虾的一部分露出。为了保持与通过风干而浓缩的离子液 体水溶液12的渗透压平衡的状态，钩虾13的内部成为浓度更高的状态。随着离子液体水 溶液向钩虾的体内渗透，钩虾的体色从白色变化为透明。由此能够判断出在钩虾的体内含 浸有离子液体。而且，在上述的基于体色变化的方法中预先测定了在标准的试样的内部含 浸离子液体的时间，是否在实际观察所使用的试样中含浸有离子液体可以根据浸渍时间来 进行判断。需要说明的是，离子液体是否含浸于观察对象的判断并不局限于此，也可以根据 例如观察对象的重量来进行判断。
[0058] 在滴下离子液体水溶液并开始风干起大致2?3小时的期间，离子液体水溶液的 量持续减少，但是这以后离子液体水溶液的量不再变化，风干完成。但是，风干时间受到气 候条件及离子液体水溶液的滴下量的影响。此时，由于离子液体水溶液与钩虾内部的渗透 压相等，因此不会引起试样的破坏，即使放置一昼夜以上也能维持形态。
[0059] 在风干完成之后，利用滤纸等纸或者薄纱等的擦拭构件14来吸引多余的离子液 体水溶液。如图5所示，使前端部变细的擦拭构件14与钩虾接触，由此能够除去附着在腿 的周围等细小的部位上的离子液体水溶液。此时，预先向滤纸或擦拭纸（Kimwipes(注册商 标）等）等纸、或者薄纱等渗入水或亲水性的溶液，由此能够吸附附着在腿与腿之间等细小 的部位上的离子液体水溶液。这是因为，在试样表面因干燥而粘性增加的离子液体水溶液 通过与滤纸或擦拭纸等纸、或者薄纱等中含有的水或亲水性的溶液接触，而粘性下降，容易 由纸或擦拭纸等纸、或者薄纱等吸收。在难以除去离子液体水溶液的情况下，也可以利用浓 度低的离子液体水溶液或水进行清洗。而且，若将钩虾移换到吸水性的材质例如碳制试样 台上，则除去多余的离子液体水溶液的效果会进一步提高。
[0060] 在将多余的离子液体除去之后，利用电子显微镜实施观察。观察所使用的电子显 微镜优选为扫描电子显微镜（SEM)。图6是使用本实施例的方法并利用电子显微镜拍摄钩 虾所得的图像15。示出了能够不使耐受渗透压的变化弱的钩虾的形态发生变化、损伤而通 过电子显微镜进行拍摄的情况。
[0061] 由于钩虾表面的离子液体水溶液也能除去，因此在图6中，触毛16等细小的结构 也没有被离子液体水溶液覆盖而能进行观察。置换成离子液体水溶液的钩奸在真空环境下 放置之后也能确保柔软性，因此在第一次电子显微镜观察后，可以将钩虾翻转而进行背面 的观察，或者进而可以在移动腿等的关节之后再次通过电子显微镜进行观察。图7是这样 进行第一次电子显微镜观察后，进行翻转，而再次通过电子显微镜观察到的钩虾的图像17。 与图6为同一检体且图6中观察的相反侧为图7。但是，关于图7中的腿18,由于从图6的 状态移动了腿的关节，因此腿的方向发生变化。
[0062] 如图7所示，用离子液体水溶液置换后的钩虾虽然能够从电子显微镜用的试样台 容易地取下，但是通过极少量的离子液体水溶液而吸附于试样台，因此即便使电子显微镜 用的试样台倾斜钓虾也不会滑落，能够稳定地进行观察。图8是实际上使试样台倾斜45° 来观察用离子液体水溶液置换后的钩虾的电子显微镜图像19。
[0063] 作为参考，在图9中示出未使用本实施例的方法而观察钩虾的例子。左图是不使 用离子液体而观察钩虾得到的电子显微镜图像20,右图是将左图的中央四画框内的腿放大 得到的电子显微图像21。图9所示的例子除了使用离子液体这点以外，在与本实施例相同 的条件下进行了观察。明确可知在不使用本实施例而通过电子显微镜来观察常温的钩虾 时，试样会发生干燥、干涸。尤其是从符号21所示的图像可知，就腿而言，干燥所引起的变 形、破坏显著。
[0064] 需要说明的是，以上说明的试样制作方法可以通过试样制作装置自动地或按照使 用者的指示?操作来进行。这样的试样制作装置也被称作前处理装置。在通过试样制作装 置来进行本实施例的方法的情况下，该装置至少具备：使观察对象浸渍于包含离子液体的 溶液的浸渍机构；在使包含离子液体的溶液的渗透压与观察对象的内部的渗透压相抗衡的 状态下，使包含离子液体的溶液干燥，由此使溶液中的离子液体的浓度上升的干燥机构。在 此，浸渍机构可以是例如微型吸移管那样少量提取包含离子液体的溶液并向观察对象滴下 的机构。而且，干燥机构可以是在大气压下预先放入有观察对象的试样室，也可以是能够控 制温度或湿度的干燥器等。而且，在干燥所需的时间预先确定的情况下，可以通过试样制作 装置具备的定时器来管理干燥时间。
[0065] 而且，试样制作装置可以具备能够对由干燥机构干燥中的所述观察对象进行观察 的光学显微镜，由此来确认干燥引起的离子液体的减少程度、是否因离子液体而使观察对 象发生了收缩或变形。而且，如上述那样，在根据观察对象的颜色的变化来判断是否含浸有 离子液体的情况下有效。
[0066] 而且，在上述的实施例中，利用滤纸等纸或者薄纱等的擦拭构件14吸引了干燥后 残留的包含离子液体的溶液，但也可以在试样制作装置上安装同样的擦拭构件来形成将由 干燥机构干燥后残留的包含离子液体的溶液除去的机构。
[0067] 另外，可以使试样制作装置具备根据观察对象的重量变化来检测所述包含离子液 体的溶液的干燥的进展状况的机构，由此利用于离子液体是否含浸于观察对象的判断。 [0068]【实施例2】
[0069] 在本实施例中，说明以海洋的主要的水生生物即桡足动物（剑形水蚤类）为试样 来观察含浸有离子液体水溶液的水生生物的方法、及使用含浸有离子液体水溶液的水生生 物来制成光学显微镜用标本的方法。需要说明的是，以下，对于与实施例1同样的部分，省 略说明。在本实施例中使用的桡足动物是体长2mm以下且在浓度90 %以上的乙醇溶液中保 存了 1个月的桡足动物，但也可以使用刚采集之后的试样。
[0070] 首先将保存在乙醇溶液中的桡足动物放入水中，利用水来置换乙醇。此时，在乙醇 溶液中为半透明的桡足动物的体色在利用水置换之后变化为不透明、白色。在本实施例中 将桡足动物浸渍于水的时间为80分钟，但是只要能确认到体色的变化即可，也可以为更短 的时间。接着，从水中将桡足动物捞起，载放于电子显微镜用的试样台，利用滤纸等吸引多 余的水分。以上的步骤在使用刚采集之后的钩虾时等试样的内部预先含有水的情况下可以 省略。
[0071] 在吸收了多余的水分之后，在试样干燥之前迅速地利用吸移管等滴下少量的离子 液体水溶液，其方法与图3相同。在桡足动物的情况下，最佳的离子液体水溶液的浓度为 10%，但是该浓度根据生物的种类的不同或原料、组成、渗透压的不同而有所不同。在本实 施例中使用了 20ml的离子液体水溶液，但只要能将水生生物浸渍在离子液体水溶液中即 可，可以比20ml多，也可以比20ml少。离子液体优选具有亲水性的性质，在本实施例中使 用了具有c8h15n2bf4的化学式的离子液体。而且，虽然示出了使用水作为离子液体溶液的溶 齐?的例子，但也可以是其他的溶齐?。作为溶剂，除了水之外，还可考虑例如乙醇、甲醇、丙酮、 己烷、乙醚、含有甲醛的福尔马林。
[0072] 在向桡足动物滴下离子液体水溶液之后，实施2小时以上的风干。风干与实施例1 同样，广泛地表示在使离子液体水溶液的渗透压与观察对象的内部的渗透压相抗衡的状态 下使离子液体水溶液干燥、由此连续地使所述溶液中的离子液体的浓度上升的溶剂除去方 法。离子液体水溶液通过风干而量逐渐减少，最终也使桡足动物的一部分露出。随着离子液 体水溶液向桡足动物的体内渗透，桡足动物的体色从白色变化为透明。由此能够判断出在 钩虾的体内含浸有离子液体。而且，在上述的基于体色变化的方法中预先测定了在标准的 试样的内部含浸离子液体的时间，是否在实际观察所使用的试样中含浸有离子液体可以根 据浸渍时间来进行判断。在滴下离子液体水溶液并开始风干起大致2?3小时的期间，离子 液体水溶液的量持续减少，但是这以后离子液体水溶液的量不再变化，风干完成。但是，风 干时间受到气候条件及离子液体水溶液的滴下量的影响。此时，由于离子液体水溶液与桡 足动物内部的渗透压相等，因此不会引起试样的破坏，即使放置一昼夜以上也能维持形态。
[0073] 在风干完成之后，利用滤纸或擦拭纸等纸或者薄纱等的擦拭构件来吸引多余的离 子液体水溶液。其方法与图5相同。此时，预先向滤纸或Kimwipes等纸、或者薄纱等渗入水 或亲水性的溶液，由此能够吸附附着在腿与腿之间等细小的部位上的离子液体水溶液。这 是因为，因试样表面的干燥而粘性增加的离子液体水溶液通过与滤纸或擦拭纸等纸、或者 薄纱等中含有的水或亲水性的溶液接触，而粘性下降，容易由纸或擦拭纸等纸、或者薄纱等 吸收。在难以除去离子液体水溶液的情况下，也可以利用浓度低的离子液体水溶液或水进 行清洗。而且，若将桡足动物移换到吸水性的材质例如碳制试样台上，则除去多余的离子液 体水溶液的效果会进一步提高。
[0074] 在将多余的离子液体除去之后，利用电子显微镜实施观察。观察所使用的电子显 微镜优选为扫描电子显微镜（SEM)。SEM的基本结构如实施例1中说明的那样。图10是使 用本实施例的方法并利用电子显微镜拍摄桡足动物所得的图像，示出了能够不使耐受渗透 压的变化弱的桡足动物的形态发生变化、损伤而通过电子显微镜进行拍摄的情况。图10的 电子显微镜图像22是使试样台倾斜45°而拍摄到的图像，根据该说明图还明确可知能够 进行倾斜观察。
[0075] 作为参考，图11中示出不使用本实施例的方法对桡足动物进行了观察的例子。图 11所示的例子除了使用离子液体这点以外，在与本实施例相同的条件下进行了观察。根据 图11的电子显微镜图像23可知，桡足动物极其不耐受干燥，在常温、常压下显著变形。不 使用本实施例对常温下干燥的桡足动物进行观察是不可能的。
[0076] 通常桡足动物的观察在光学显微镜下进行。根据本实施例那样的观察试样制成方 法，借助极少量的离子液体水溶液而吸附于试样台，因此无需将试样利用碳胶带、碳糊剂等 粘接剂固定于试样台。因此，在电子显微镜观察及解剖后，从电子显微镜用的专用试样台 取下试样，利用水或其他的密封剂将作为试样的水生生物密封，从而能够制成光学显微镜 用标本。在利用电子显微镜观察了桡足动物之后，将电子显微镜观察后的由离子液体水溶 液置换了的桡足动物利用水或加拿大香脂等密封剂密封，由此能够在光学显微镜下进行观 察。
[0077] 就利用以往的冷冻干燥法等进行了处理的桡足动物而言，在桡足动物内部产生空 洞，难以使水或加拿大香脂侵入至该空洞，存在产生气泡的问题。若是本实施例的方法那样 水生生物的内部由离子液体水溶液充满的状态，则在桡足动物内部不会产生空洞，即使制 成光学显微镜用标本，在水生生物内部产生气泡的可能性也少。
[0078] 需要说明的是，本实施例的试样制作方法也可以通过实施例1记载的试样制作装 置来执行。而且，试样制作装置可以具备对含浸有离子液体的观察对象滴下密封剂而如上 述那样制作光学显微镜用标本的光学显微镜用试样制成机构。
[0079]【实施例3】
[0080] 在微小甲壳类、大型甲壳类的幼虫的分类法中，被称为附肢的微细的腿的形态观 察被认为是重要的。甲壳类的附肢由于复杂地互相缠绕，因此为了进行详细的观察，需要对 各个附肢进行分离?解剖。以往，甲壳类的附肢的分离?解剖在光学显微镜下实施，但是在 光学显微镜下解剖器具的操作困难，解剖需要熟练的技术。在本实施例中，为了解决该问题 点，说明在电子显微镜下对甲壳类进行解剖的方法。需要说明的是，以下，对于与实施例1 同样的部分，省略说明。
[0081] 图12是表示使用设置在电子显微镜的试样室内的探针在电子显微镜观察下对因 含浸有离子液体水溶液而得到了柔软性的水生生物进行解剖的情况的说明图。在图12中， 因含浸有离子液体水溶液而得到了柔软性的水生生物24是进行了实施例1或实施例2所 示的处理的试样。设置在电子显微镜的试样室内的探针25优选能够边进行电子显微镜观 察边进行操作。通过在基于电子线的图像取得中进行试样的操作，由此能得到试样的动态 图像，能够视觉性地识别试样的动态状态。
[0082] 在水生生物24的方向不适合于实施解剖的情况下，使用探针25使水生生物24以 滚动的方式旋转。水生生物滚动时的状态与图7同样。在图12的说明图中，电子显微镜用 的试样台8根据需要可以倾斜。
[0083] 在调好水生生物24的方向之后，使用探针25来移动附肢的关节或者进行附肢的 切离等解剖。此时若在电子显微镜试样室内设置2根以上的探针，则其操作变得容易。因 此，电子显微镜试样室内的探针的根数优选为2根以上。用设置在电子显微镜的试样室内 的探针解剖后的水生生物的腿26由探针25切离。
[0084] 如本实施例那样将水生生物中的水或其他的溶液置换成离子液体水溶液并利用 电子显微镜进行观察的方法具有如下效果：即使在电子显微镜内的高真空环境下，也不会 丧失关节等的柔软性，能够移动腿或其他的可动部。因此，具有在电子显微镜观察后或电子 显微镜观察中，能够使用设置在电子显微镜试样室内的探针等一边移动水生生物的腿或其 他的可动部一边进行观察这样的效果。而且，也能够进行作为试样的水生生物的解剖。 [0085] 解剖后的水生生物的腿由离子液体水溶液置换，因此具有导电性。因此，能够减少 与充电（charge up)现象相伴的碎片的飞散、及碎片的飞散造成的电子显微镜室内的污染。 而且，用离子液体水溶液置换后的水生生物保持着柔软性，因此能够在不破坏试样的情况 下进行弯曲附肢等的操作。
[0086] 解剖后的试样直接在电子显微镜下进行观察，但是根据需要，也可以利用其他的 分析设备、例如光学显微镜进行再观察。这种情况下，可以如实施例2说明的方法那样利用 密封剂来制成光学显微镜用标本。在利用生物显微镜进行观察的情况下，也可以在光学显 微镜用的玻璃载片或玻璃盖片上进行上述的处理。通常玻璃为绝缘物，会发生充电现象，但 是也可以通过向玻璃表面较薄地涂敷离子液体来附加导电性。
[0087] 需要说明的是，本发明没有限定为上述的实施例，可以包含各种变形例。例如，上 述的实施例是为了容易理解本发明而详细说明的实施例，没有限定为必须具备所说明的全 部结构。而且，可以将某实施例的结构的一部分置换成其他的实施例的结构，而且，也可以 向某实施例的结构中加入其他的实施例的结构。而且，对于各实施例的结构的一部分，可以 进行其他的结构的追加、删除、置换。
[0088] 【符号说明】
[0089] 1 物镜
[0090] 2 试样
[0091] 3电子束
[0092] 4反射电子信号
[0093] 5反射电子检测器
[0094] 6二次电子信号
[0095] 7二次电子检测器
[0096] 8试样台
[0097] 9离子液体水溶液
[0098] 10用水置换后的钩虾
[0099] 11吸移管
[0100] 12浓缩后的离子液体水溶液
[0101] 13 钩虾
[0102] 14擦拭构件
[0103] 15用离子液体水溶液置换后的钩虾的电子显微镜图像
[0104] 16钩虾的触毛
[0105] 17在第一次电子显微镜观察后，进行翻转，而再次通过电子显微镜观察到的钩虾 的电子显微镜图像
[0106] 18在第一次电子显微镜观察后移动了关节的腿
[0107] 19使电子显微镜试样台倾斜45°而观察到的用离子液体水溶液置换后的钩虾的 电子显微镜图像
[0108] 20不使用离子液体而观察钩虾得到的电子显微镜图像
[0109] 21将因干燥而变形的钩虾的腿放大得到的电子显微镜图像
[0110] 22用离子液体水溶液置换后的桡足动物的电子显微镜图像
[0111] 23不使用离子液体而观察桡足动物得到的电子显微镜图像
[0112] 24水生生物
[0113] 25 探针
[0114] 26水生生物的腿
【权利要求】
1. 一种试样观察方法，其检测向观察对象照射带电粒子线而得到的信号来取得所述观 察对象的图像， 所述试样观察方法的特征在于，包括： 将所述观察对象浸渍于包含离子液体的溶液中的浸渍步骤； 在使所述包含离子液体的溶液的渗透压与所述观察对象的内部的渗透压相抗衡的状 态下，使所述包含离子液体的溶液干燥，由此使所述溶液中的离子液体的浓度上升的干燥 步骤； 向内部含浸有所述包含离子液体的溶液的观察对象照射所述带电粒子线来取得所述 观察对象的图像的观察步骤。
2. 根据权利要求1所述的试样观察方法，其特征在于， 在所述浸渍步骤之前包括使所述观察对象含浸水的步骤， 根据所述观察对象的颜色的变化来判断所述干燥步骤的结束。
3. 根据权利要求1所述的试样观察方法，其特征在于， 所述离子液体为亲水性。
4. 根据权利要求3所述的试样观察方法，其特征在于， 在所述干燥步骤之后包括使用渗入有水或亲水性的溶液的构件将所述包含离子液体 的溶液除去的步骤。
5. 根据权利要求1所述的试样观察方法，其特征在于， 所述浸渍步骤中使用的所述包含离子液体的溶液中的离子液体的浓度为10%以下。
6. 根据权利要求1所述的试样观察方法，其特征在于，包括： 利用密封剂对含浸有所述包含离子液体的溶液的观察对象进行密封而制成光学显微 镜用的标本的步骤； 利用光学显微镜对所述光学显微镜用的标本进行观察的步骤。
7. 根据权利要求1所述的试样观察方法，其特征在于， 包括使用探针对含浸有所述包含离子液体的溶液的观察对象进行解体或解剖的步骤。
8. -种试样前处理方法，其利用通过检测向试样照射带电粒子线而得到的信号来取得 所述试样的图像的装置进行观察， 所述试样前处理方法的特征在于，包括： 将所述试样浸渍于包含离子液体的溶液中的浸渍步骤； 在使所述包含离子液体的溶液的渗透压与所述试样的内部的渗透压相抗衡的状态下， 使所述包含离子液体的溶液干燥，由此使所述溶液中的离子液体的浓度上升的干燥步骤。
9. 一种试样制作装置，其对观察对象进行前处理，使所述观察对象成为适合于试样观 察装置的观察的状态，该试样观察装置检测向所述观察对象照射带电粒子线而得到的信号 来取得所述观察对象的图像， 所述试样制作装置的特征在于，具备： 使所述观察对象浸渍于包含离子液体的溶液中的浸渍机构； 在使所述包含离子液体的溶液的渗透压与所述观察对象的内部的渗透压相抗衡的状 态下，使所述包含离子液体的溶液干燥，由此使所述溶液中的离子液体的浓度上升的干燥 机构。
10. 根据权利要求9所述的试样制作装置，其特征在于， 具备能够对由所述干燥机构干燥中的所述观察对象进行观察的光学显微镜。
11. 根据权利要求9所述的试样制作装置，其特征在于， 具备将由所述干燥机构干燥后残留的包含离子液体的溶液除去的机构。
12. 根据权利要求9所述的试样制作装置，其特征在于， 具备根据所述观察对象的重量变化来检测所述包含离子液体的溶液的干燥的进展状 况的机构。
13. 根据权利要求9所述的试样制作装置，其特征在于， 所述浸渍机构是向所述观察对象滴下所述包含离子液体的溶液的微型吸移管。
【文档编号】G01N1/30GK104094096SQ201380007954
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2013年2月20日 优先权日:2012年3月9日
【发明者】盐野正道, 西村雅子, 许斐麻美 申请人:株式会社日立高新技术
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