专利名称：一种检测铁调素的方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测生物分子的方法和试剂盒，具体地，涉及一种检测铁调素的方法和一种检测铁调素的试剂盒。
背景技术：
铁调素(hepcidin)是一种具有广谱杀菌抑菌作用的抗菌肽，属于防御性蛋白家族。铁调素基因在肝脏翻译时，首先产生一种早期多肽，当其信号肽被酶切去除后，形成铁调素前体(pro-hepcidin),并通过转运进入血液循环,最后由前肽转化酶(propeptideconvertase)剪接得到成熟的铁调素。铁调素与遗传性血色病、贫血、铁代谢失调疾病、慢性肾脏疾病和炎症反应等疾病存在一定的相关性，但由于个体差异等影响因素的存在，上述疾病的诊断结果还需要依赖·于其它影响因素进行判断，因此，对铁调素进行定性和/或定量检测，可以为上述疾病的诊断提供中间信息。建立简单快速的对铁调素进行定性和/或定量检测的方法是十分重要的。但是，具有临床检测意义的铁调素只有25个氨基酸，其免疫原性非常低，对应的抗体很难得到，而目前已有的基于抗体检测方法在检测时大多无法区分铁调素前体(pro-hepcidin)和铁调素(hepcidin)。此外，已有的基于质谱的铁调素检测方法通常为将疑似含有铁调素的样品，例如血清和/或血浆样品，经过色谱分离或纳米芯片富集等质谱样品前处理后用于质谱检测，而后根据质谱检测结果确定样品中是否含有铁调素或者确定样品中铁调素的含量。由于色谱分离或纳米芯片富集等质谱样品前处理后用于质谱进样的样品质量仍然较差，已有的基于质谱的铁调素检测方法灵敏度较低且准确度较差。
发明内容
为了克服已有的基于质谱的铁调素检测方法灵敏度较低且准确度较差的缺陷，本发明提供了一种检测铁调素的方法和一种检测铁调素的试剂盒。本发明的发明人发现，通过一种具有特定表面涂层结构的纳米芯片能特异性地富集铁调素，提高基于质谱的铁调素方法的灵敏度和准确度，由此得到了本发明。本发明提供了一种检测铁调素的方法，其中，所述方法包括如下步骤(I)将样品液体与纳米芯片接触后，去除样品液体，得到接触样品后的纳米芯片；所述样品液体含有铁调素或不含有铁调素；(2)用洗脱液洗脱接触样品液体后的纳米芯片，得到洗脱产物；所述洗脱液能够溶解铁调素；(3)获取步骤(2)得到的洗脱产物的质谱检测结果；(4)根据所述质谱检测结果，确定洗脱产物中是否含有铁调素，或者确定洗脱产物中铁调素的含量；步骤(I)中，所述纳米芯片包括基片和附着在所述基片上的多孔氧化硅涂层，所述多孔氧化硅涂层的平均孔径为3. 65-3. 75nm，所述多孔氧化硅涂层的比表面积为1050-1200m2/g，所述多孔氧化硅涂层具有轴向平行的多个孔道，且所述多个孔道中的7个孔道形成一个孔道组，每个孔道组包括一个中心孔道和与该中心孔道相邻并围绕该中心孔道的6个周边孔道，该6个周边孔道的截面中心连线形成正六边形。本发明的发明人进一步发现，通过将含有乙腈和三氟乙酸的样品稀释液与样品混合，能够进一步提闻铁调素检测方法的灵敏度和准确度。因此，本发明还提供了一种检测铁调素的试剂盒，其中，该试剂盒包括(i)样品稀释液，所述样品稀释液含有三氟乙酸和乙腈；(ii)纳米芯片，所述纳米芯片包括基片和附着在所述基片上的多孔氧化硅涂层，所述多孔氧化硅涂层的平均孔径为3. 65-3. 75nm，所述多孔氧化硅涂层的比表面积为1050-1200m2/g，所述多孔氧化硅涂层具有轴向平行的多个孔道，且所述多个孔道中的7个 孔道形成一个孔道组，每个孔道组包括一个中心孔道和与该中心孔道相邻并围绕该中心孔道的6个周边孔道，该6个周边孔道的截面中心连线形成正六边形。本发明提供的检测铁调素的方法，显著地提高了基于质谱的铁调素检测方法的灵敏度和准确度，特别是提高了复杂样品(如血清)中铁调素检测效果，例如，以检测人铁调素为例，以含有2. 5nM人铁调素的兔血清为样品，本发明提供的检测铁调素的方法能够获得大于3的信噪比和小于15%的变异系数，优于已有的基于质谱的铁调素检测方法，例如，应用多孔氧化硅涂层的平均孔径为3. 9nm，孔呈球形，孔与孔之间互相连通，孔的排列呈三维立体状的纳米芯片进行质谱样品前处理的基于质谱的铁调素检测方法信噪比低至I. 5，变异系数为高达25%。本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式
部分予以详细说明。
图I是制备例I的纳米芯片的多孔氧化硅涂层的扫描电子显微镜照片。图2是制备例3的纳米芯片的多孔氧化硅涂层的扫描电子显微镜照片。图3是质谱检测结果中铁调素的特征峰。图4是铁调素定量检测的标准曲线。
具体实施例方式以下结合附图对本发明的具体实施方式
进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式
仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的术语“溶液”的范围并不限于分散质的粒子直径小于Inm的分散系(真溶液)，而是泛指均一的液态混合物，可以包括胶状分散体(胶体溶液)。在本发明中，在未作相反说明的情况下，气体和液体的体积数值均为标准状态下的数值。本发明提供了一种检测铁调素的方法，其中，所述方法包括如下步骤(I)将样品液体与纳米芯片接触后，去除样品液体，得到接触样品后的纳米芯片；所述样品液体含有铁调素或不含有铁调素；
(2)用洗脱液洗脱接触样品液体后的纳米芯片，得到洗脱产物；所述洗脱液能够溶解铁调素；(3)获取步骤(2)得到的洗脱产物的质谱检测结果；(4)根据所述质谱检测结果，确定洗脱产物中是否含有铁调素，或者确定洗脱产物中铁调素的含量；步骤(I)中，所述纳米芯片包括基片和附着在所述基片上的多孔氧化硅涂层，所述多孔氧化硅涂层的平均孔径为3. 65-3. 75nm，所述多孔氧化硅涂层的比表面积为1050-1200m2/g，所述多孔氧化硅涂层具有轴向平行的多个孔道，且所述多个孔道中的7个孔道形成一个孔道组，每个孔道组包括一个中心孔道和与该中心孔道相邻并围绕该中心孔道的6个周边孔道，该6个周边孔道的截面中心连线形成正六边形。本发明的发明人发现，具有上述结构的多孔氧化硅涂层的所述纳米芯片就能特别适合铁调素的特异性富集，并从而提高基于质谱的铁调素方法的灵敏度和准确度。 在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的术语“平均孔径”是指通过N2吸附/解吸法测量并计算得到的数值。例如，可以使用吸附仪(如Quantachrome)在77K条件下测得N2吸附/脱附等温线，并且按照Barrett-Joyner-Halenda(BJH)方法根据解吸等温线分支计算得到。在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的术语“比表面积”是指通过N2吸附/解吸法测量并计算得到的数值。例如，可以使用吸附仪(如Quantachrome)在77K条件下测得N2吸附/脱附等温线，并且按照Brunauer-Emmett-Teller(BJH)方法根据N2吸附/脱附等温线计算得到。在本发明中，所述多孔氧化硅涂层具有轴向平行的多个孔道，且所述多个孔道中的7个孔道形成一个孔道组，每个孔道组包括一个中心孔道和与该中心孔道相邻并围绕该中心孔道的6个周边孔道，该6个周边孔道的截面中心连线形成正六边形的结构是指在透射电子显微镜照片观察到的纳米芯片的结构，例如图I所示的结构。本发明中，需要说明的是，在所述多孔氧化硅涂层的内部，所述孔道组可以是完整的7个孔道形成一个孔道组；在所述多孔氧化硅涂层的边缘，所述孔道组可以是由2-6个孔道形成一个孔道组。此外，在所述纳米芯片的透射电子显微镜照片中，可见孔道轴平行于基片表面的切面。所述基片可以为生物芯片领域常规的各种基片，例如硅晶片、玻璃片、金属片或陶瓷片。所述基片的大小和厚度没有特别要求，可以为生物芯片领域常规的大小和厚度，例如所述基片的大小可以为直径3_15cm的圆片,所述基片的厚度可以为100-1000 μ m。符合上述要求的步骤(I)中纳米芯片，可以按照如下方法进行制备(a)将硅酸溶液与表面活性剂的乙醇溶液混合均匀，得到涂料。 所述硅酸溶液可以由一种混合物混合均匀后得到，所述混合物可以含有正硅酸乙酯、乙醇、水和盐酸，所述混合物中，相对于每克的正硅酸乙酯，乙醇的用量可以为1-1. 15晕升，水的用量可以为O. 4-0. 6晕升，以HCl的量计，盐酸的用量可以为O. 15-0. 25晕摩尔。混合制备所述硅酸溶液的条件可以包括混合的温度可以为60-90°C ;混合的时间可以为1-3小时。
所述表面活性剂的乙醇溶液中，相对于每克的表面活性剂，乙醇的含量可以为3. 5~4. 5 晕升。所述表面活性剂可以为具有PEOm-PPOn-PEOm通式的聚合物，且m可以为100-110的整数，η可以为65-75的整数。其中PEO表示聚环氧乙烷单元，PPO表示聚环氧丙烷单元。符合上述要求的聚合物可以通过商购得到，例如可以购买BASF公司的牌号为Pluronic F127的产品作为所述表面活性剂使用。相对于每毫升的所述硅酸溶液，所述表面活性剂的乙醇溶液的用量可以为
O.8-1. 2毫升。混合制备所述涂料的条件可以包括混合的温度可以为10-35°C，混合的时间可以为1-3小时。(b)在所述基片上涂覆步骤(a)得到的涂料并固化。步骤(b)中，涂覆的方法可以通过旋转涂布来进行。所述旋转涂布的条件可以包 括旋转涂布的转速可以为500-3500rpm，相对于每平方厘米的涂覆面积，所述涂料的用量可以为O. 01-0. 05ml。达到上述旋转涂布的条件可以使用常规的旋转涂布仪来实现。步骤(b)中，固化的条件可以包括固化温度可以为300-550°C，固化的时间可以为3-8小时。步骤(b)中，达到固化温度的方式可以为升温速度O. 5-50C /min的梯度加热方式。步骤(b)中，固化之前可以将涂覆了涂料的基片在70-90°C的温度下保持8-16小时。步骤(b)中，固化之后可以将固化得到的产物自然冷却8-20小时。上述制备方法中，由于选择了特定的表面活性剂、所述表面活性剂与正硅酸乙酯的用量比、所述涂料中该表面活性剂与正硅酸乙酯的浓度和旋转涂布的条件，使得上述方法制备得到的纳米芯片恰好具有如下特征所述多孔氧化硅涂层的平均孔径为3. 65-3. 75nm，所述多孔氧化硅涂层的比表面积为1050_1200m2/g，所述多孔氧化硅涂层具有轴向平行的多个孔道，且所述多个孔道中的7个孔道形成一个孔道组，每个孔道组包括一个中心孔道和与该中心孔道相邻并围绕该中心孔道的6个周边孔道，该6个周边孔道的截面中心连线形成正六边形；并且上述方法制备得到的纳米芯片恰好能用于本发明的技术方案并解决本发明的技术问题。本发明的发明人发现，水浸润性更好的纳米芯片能够更有效地特异性富集铁调素，并从而进一步提高铁调素检测方法的灵敏度和准确度，由此提供了本发明的一种优选实施方式。根据本发明的一种优选实施方式，其中，所述多孔氧化硅涂层的表面的接触角小于15度。在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的术语“接触角”是指在固、液、气三相交界处，自固-液界面经过液体内部到气-液界面之间的夹角。接触角越�。笮栽胶�。在本发明中，使用的术语“接触角”的数值是指按文献(Lelah，Michael D. Themeasurement of contact angles on circular tubing surfaces using the captivebubble technique ；J. Biomed. Mater. Res. ； 19 (9) ;1011_1015 ;1985)中所述的方法，观测液滴或气泡在固体表面上的外形，并在固、液、气三相交点处作切线，用量角器直接量角度得到的数值。此处，所用的液体为水。为了使得所述多孔氧化硅涂层的表面的接触角小于15度，可以将冷却之后的固化产物进行氧等离子体处理。
所述氧等离子体处理的条件可以包括相对于70cm2的多孔氧化硅涂层的外表面积，氧气流量为70-90标准毫升/分钟(sccm)，功率为250-350W，时间为5_15分钟。所述氧等离子体处理的条件可以使用等离子体去阻机(Plasma Asher)实现。根据本发明的方法，其中，步骤(I)中，所述接触的条件可以包括接触的温度可以为10-37°C，优选为15-30°C，接触的时间可以为20-60分钟，优选为30-50分钟。本发明的发明人进一步发现，通过将含有乙腈和三氟乙酸的样品稀释液与样品混合，能够进一步提高铁调素检测方法的灵敏度和准确度，由此提供了本发明的另一种优选实施方式。根据本发明的另一种优选实施方式，其中，所述样品液体含有样品和样品稀释液；所述样品稀释液含有水、三氟乙酸和乙腈。其中，相对于I体积所述样品液体，所述样品稀释液的用量使得三氟乙酸的用量可以为O. 00005-0. 00015体积且乙腈的用量可以为O. 03-0. 07体积。
其中，所述样品稀释液中，相对于I体积的水，三氟乙酸的含量可以为
0.001-0. 003体积，乙腈的含量可以为O. 5-1. 5体积。根据本发明的方法，其中，相对于每平方毫米所述多孔氧化硅涂层的外表面积，所述样品液体的用量可以为O. 5-4 μ Lo为了在同一纳米芯片上富集不同的样品，可以使用分隔材料附着在所述纳米芯片的多孔氧化硅涂层上，将所述纳米芯片分隔为多个独立的区。每个所述区和分隔该区的分隔材料形成池。在不同的池中，可以独立地进行步骤(I)至(3)的操作。附着分隔材料的方法没有特别的要求，只要是能方便进行高通量地检测铁调素即可，例如，可以将一张具有多个通孔的硅胶膜粘接在所述纳米芯片的多孔氧化硅涂层上形成多个独立的池，硅胶膜上通孔的大小和硅胶膜的厚度能使得得到的池完全容纳样品液体即可。优选情况下，可以使用硅胶膜在所述纳米芯片的多孔氧化硅涂层上形成直径为
1.5-4. 5mm，深度为O. 5-1. 5mm的池；每池中加入5-20 μ L的样品液体。如本领域技术人员所公知,每池中加入的样品液体的体积应当小于所加入的持的容量，以避免样品液体的溢出。根据本发明的方法，其中，步骤⑴中，所述去除样品液体的方法没有特别的要求，只要能达到去除接触完成后附着在纳米芯片表面的样品液体即可。例如，可以在接触完成后，吸去接触后的样品液体。为了充分清除多孔氧化硅涂层上残留的接触完成后的样品液体，可以用水进行洗涤，洗涤的次数可以为2-5次，每次洗涤可以用与样品液体等体积的水进行。根据本发明的方法，其中，为了进一步提高质谱检测的信噪比，优选情况下，步骤
(I)可以重复进行多次，例如，步骤(I)可以重复进行2-5次。本发明中，为了提高检测的准确度，优选所使用的水为去离子水，例如，20°C下电导率大于等于18. 2MQ/cm的水。根据本发明的方法，其中，所述洗脱液没有特别的要求，只要能溶解铁调素即可，例如所述洗脱液可以含有三氟乙酸、乙腈和水。其中，所述洗脱液中，相对于I体积水，三氟乙酸的含量可以为O. 001-0. 003体积，乙腈的含量可以为O. 5-1. 5体积。其中，相对于每平方毫米所述多孔氧化硅涂层的外表面积，所述洗脱液的用量为0.3_2 u L0其中，洗脱的方法没有特别的要求，例如可以使洗脱液在接触样品后的多孔氧化硅涂层部分上充分浸润，然后收集浸润后的洗脱液即得到洗脱产物。优选情况下，当使用硅胶膜在所述纳米芯片的多孔氧化硅涂层上形成直径为
1.5-4. 5mm，深度为O. 5-1. 5mm的池，每池中加入5_20 μ L的样品液体时，洗脱每池所加入的所述洗脱液的量可以为3-7 μ L。本发明提供的铁调素检测方法，相比包括基于色谱的质谱样品前处理步骤的铁调素检测方法，还具有简单易行的优点。根据本发明提供的方法，获取洗脱产物的质谱检测结果的方法可以为使用生物质谱检测肽段的常规方法，已为本领域技术人员公知，例如，可以为《蛋白质化学与蛋白质组学》(科学出版社2004年出版)中所述的方法。·本发明的发明人还发现，通过将含有乙腈和三氟乙酸的样品稀释液与样品混合，能够进一步提高基于质谱的铁调素方法的灵敏度和准确度。因此，本发明还提供了一种检测铁调素的试剂盒，其中，该试剂盒包括(i)样品稀释液，所述样品稀释液含有水、三氟乙酸和乙腈；(ii)纳米芯片，所述纳米芯片包括基片和附着在所述基片上的多孔氧化硅涂层，所述多孔氧化硅涂层的平均孔径为3. 65-3. 75nm，所述多孔氧化硅涂层的比表面积为1050-1200m2/g，所述多孔氧化硅涂层的孔道轴向平行且每个孔道与6个孔道相邻。根据本发明提供的试剂盒，其中，所述样品稀释液中，相对于I体积的水，三氟乙酸的含量可以为O. 001-0. 003体积，乙腈的含量可以为O. 5-1. 5体积。根据本发明提供的试剂盒，其中，所述纳米芯片如本发明提供的检测铁调素的方法中所述。以下，通过实施例进一步详细说明本发明，但本发明的范围不限于实施例中，本领域技术人员可以根据实施例合理地预见本发明的范围。制备例I本制备例用于说明本发明所用的纳米芯片的制备方法。将14克的正硅酸乙酯(TEOS)(购自Sigma-Aldrich公司)与15毫升的乙醇、6. 5毫升的去离子水和O. 5毫升6mol/L盐酸混合,在75°C下以IOOrpm的搅拌速度搅拌2小时，形成透明液态混合物，即得到硅酸溶液。将2. 4克的表面活性剂(购自BASF公司，牌号Pluronic F127，结构式为peo106-ppo70-peo106)加入10毫升的乙醇中，在室温下搅拌溶解，得到表面活性剂的乙醇溶液。将11毫升表面活性剂的乙醇溶液与10毫升硅酸盐溶胶混合，在室温下以IOOrpm的搅拌速度搅拌2小时后得到涂料。将I. 5mL的涂料加到直径IOcm且厚度525 μ m的硅晶片(购自美国Silicon QuestInternational公司)上,室温下,在转速为1500rpm的旋转涂布条件下,旋转涂布40s,然后在80°C条件下维持12小时，再以1°C /min的升温速度升温至425°C，在425°C下保持5小时，然后自然冷却12小时，得到纳米芯片。使用QuantachiOme吸附仪在77K条件下测定N2吸附/脱附等温线，并且按照Barrett-Joyner-Halenda (BJH)方法根据解吸等温线分支计算得到本制备例得到的纳米芯片的多孔氧化娃涂层的平均孔径为3. 7nm ;按照Brunauer-Emmett-Teller(BJH)方法根据N2吸附/脱附等温线计算得到本制备例得到的纳米芯片的多孔氧化硅涂层的比表面积为1131m2/g。使用透射电子显微镜，在加速电压200kV的条件下，观察本制备例得到的纳米芯片的多孔氧化硅涂层结构，结果如图I所示，可见，多孔氧化硅涂层具有轴向平行的多个孔道，且所述多个孔道中的7个孔道形成一个孔道组，每个孔道组包括一个中心孔道和与该中心孔道相邻并围绕该中心孔道的6个周边孔道，该6个周边孔道的截面中心连线形成正六边形。此外，在纳米芯片的透射电子显微镜照片中，可见孔的轴平行于基片表面或基片表面的切面。按文献(Lelah, Michael D. The measurement of contact angles on circulartubing surfaces using the captive bubble technique ；J. Biomed. Mater. Res. ； 19(9)；1011-1015 ；1985)中所述的方法，观测液滴或气泡在固体表面上的外形，并在固、液、气三相交点处作切线，用量角器直接量角度得到本制备例得到的纳米芯片的多孔氧化硅涂层的接触角大于30度,此处,所用的液体为水。 制备例2本制备例用于说明本发明所用的多孔氧化硅涂层的接触角小于15度的纳米芯片的制备方法。本制备例通过与制备例I相同的方法制备纳米芯片，不同的是，固化以后产物用等离子体去阻机(Plasma Asher),在80标准毫升/分钟(sccm)的氧气流量,功率为300W的条件下进行10分钟的氧等离子体处理，得到本制备例的纳米芯片。按照与制备例I相同的方法，测得本制备例制得的纳米芯片的多孔氧化硅涂层的平均孔径为3. 7nm,比表面积为1125m2/g，多孔氧化硅涂层的孔道呈现轴向平行且每个孔道与6个孔道相邻的结构，且多孔氧化硅涂层的接触角小于15度。制备例3本制备例用于说明不适于本发明所用的纳米芯片的制备方法。本制备例通过与制备例I相同的方法制备纳米芯片，不同的是，将I. 5克的表面活性剂(购自BASF公司，牌号Pluronic F127，结构式为ΡΕ0106-ΡΡ070-ΡΕ0106)加入10毫升的乙醇中，在室温下搅拌溶解，得到表面活性剂的乙醇溶液。按照与制备例I相同的方法，测得本制备例制得的纳米芯片的多孔氧化硅涂层的平均孔径为3. 9nm,比表面积为640m2/g，透射电子显微镜照片如图2所示，孔呈球形，不存在孔道状结构，孔与孔之间互相连通，孔的排列呈三维立体状，且多孔氧化硅涂层的接触角大于30度。制备例4本制备例用于说明不适于本发明所用的纳米芯片的制备方法。本制备例通过与制备例I相同的方法制备纳米芯片，不同的是，将I. 2克的表面活性剂(购自BASF公司，牌号Pluronic L121，结构式为ΡΕ05-ΡΡ070-ΡΕ05)加入10毫升的乙醇中，在室温下搅拌溶解，得到表面活性剂的乙醇溶液。按照与制备例I相同的方法，测得本制备例制得的纳米芯片的多孔氧化硅涂层的平均孔径为6nm，比表面积为587m2/g，透射电子显微镜照片显示孔的排列呈不规则状，且多孔氧化硅涂层的接触角大于30度。实施例I本实施例用于说明本发明的检测铁调素的方法和试剂盒。已知兔铁调素与人铁调素分 子量差别较大，且MALDI-T0F质谱分析结果表明兔血清在2788Da处和2465Da处均无干扰。因此，使用兔血清(购自GIBICO公司)作为稀释血清。使用合成的人铁调素作为标准品(购自Sigma-Aldrich公司，平均分子量为2789. 4Da)。使用促肾上腺皮质激素片段18-39作为参比物(ACTH18-39，购自Sigma-Aldrich公司，单一同位素分子量为2464. 2Da)，用于铁调素的定量。将50mL的乙腈(色谱纯，购自Sigma-Aldrich公司)和O. ImL的三氟乙酸(色谱纯，购自Sigma-Aldrich公司)混合,加水直至体积为IOOmL,得到本实施例的样品稀释液。将本实施例的样品稀释液与制备例2得到的纳米芯片的组合作为本实施例的试剂盒。将50mL的乙腈(色谱纯,购自Sigma-Aldrich公司)和O. ImL的三氟乙酸(色谱纯,购自Sigma-Aldrich公司)混合,加水直至体积为IOOmL,得到洗脱液。将25pmol的标准品溶于IOmL的兔血清，得到浓度为2. 5nmol/L的标准品兔血清样品。将900μ L的标准品兔血清样品与100μ L的样品稀释液混匀，得到样品液体。将一块透明的硅胶膜(厚度I. 2mm，硬度40，一面具有3Μ粘结层，购自McMaster-Carr公司)上切出直径3. 5mm的孔并粘结在制备例2得到的纳米芯片的多孔氧化娃涂层上形成直径为3. 5mm,深度为I. 2mm的池,取10 μ L样品液体滴加在一个池中，为避免样品液体挥发，在湿盒中孵育的条件下，室温下放置40分钟后吸去池中的液体，用去离子水洗涤池3次(每次使用10 μ L去离子水)。然后，每池加入5 μ L洗脱液至充分浸润，然后收集浸润后的洗脱液，得到洗脱样品。洗脱样品按照《蛋白质化学与蛋白质组学》(科学出版社2004年出版)中所述的方法用基质辅助激光解析-时间飞行质谱(MALDI-T0F-MS)测定(使用如上所述的参比物)，获得质谱检测结果。具体地，获取获得质谱检测结果的方法为取I μ L洗脱样品或空白洗脱液滴加在MSP96质谱靶的采集区上，至样品自然干燥，然后再滴加I μ L的浓度为4g/L的α -氰_4_羟基苯丙烯酸(HCCA,购自Burker Daltonics,德国)基质在样品上,至样品自然干燥。测试时，使用MALDI-TOF-MS (Mirof lex，购自Bruker Daltonics)，选用反射模式，先用多肽标准品(peptide calibration standard,购自 Bruker Daltonics,德国)校准,使得单同位素峰偏差小于IOppm ;然后在激光能量相对强度为40%的条件下进行数据采集，每个样品结晶采集10个点，每个点采集100次；激光脉冲频率为75Hz，质荷比采集范围为1000-4000m/z。测试后使用弹性分析(FlexAnalysis)软件处理采集得到的数据，采用快照(snap)方法处理所述数据中的质谱图，计算每个样品测得的铁调素的峰面积(单同位素峰位于2788. Im/z 一组质谱峰，如图3所示)，求得每个洗脱样品或空白洗脱液采集10个点的平均峰面积值作为该洗脱样品或空白洗脱液的信号值。质谱检测结果中，在人铁调素的特征峰处(单同位素峰位于2788. lm/z的一组质谱峰，如图3所示)，以空白洗脱液的信号值为噪音值，将洗脱样品的信号值除以噪音值，得到信噪比。以6次重复测量洗脱样品的信号值的标准差除以其平均值得到变异系数(CV % )。本实施例中，信噪比为10，变异系数为5%。根据参比物进行定量，铁调素浓度的测量值为2. 44nmol/L。实施例2本实施例用于说明本发明的检测铁调素的方法。本实施例按照如实施例I相同的方法进行人铁调素的检测，不同的是，所使用的样品稀释液为去离子水。本实施例中，信噪比为7，变异系数为10%。根据参比物进行定量，铁调素浓度的测量值为2. 41nmol/L。实施例3本实施例用于说明本发明的检测铁调素的方法。
本实施例按照如实施例I相同的方法进行人铁调素的检测，不同的是，所使用的纳米芯片为制备例I制得的纳米芯片。本实施例中，信噪比为5，变异系数为12%。根据参比物进行定量，铁调素浓度的测量值为2. 38nmol/L。对比例I本对比例按照如实施例3相同的方法进行人铁调素的检测，不同的是，所使用的纳米芯片为制备例3制得的纳米芯片。本对比例中，信噪比为I. 5，变异系数为25%。根据参比物进行定量，铁调素浓度的测量值为2. 02nmol/L。对比例2本对比例按照如实施例3相同的方法进行人铁调素的检测，不同的是，所使用的纳米芯片为制备例4制得的纳米芯片。本对比例中，信噪比为I. 2，变异系数为35%。根据参比物进行定量，铁调素浓度的测量值为2. 12nmol/L。通过实施例2与实施例I的对比可以看出，优选使用含有三氟乙酸和乙腈的样品稀释液，可以使得灵敏度和准确度更高。通过实施例3与实施例I的对比可以看出，优选使用多孔氧化硅涂层的表面的接触角小于15度的纳米芯片，也可以使得灵敏度和准确度更闻。实施例4分别将10pmol、50pmol、100pmol、200pmol、500pmol、800pmol 和 IOOOpmol 的与实施例I相同的标准品溶于IOmL的与实施例I相同的兔血清，得到浓度为lnm0l/L、5nm0l/L、10nmol/L、10nmol/L、20nmol/L、50nmol/L、80nmol/L 和 100nmol/L 的标准品兔血清样品。
按照与实施例I相同的方法对上述标准品兔血清样品分别进行检测。基于实施例I的检测结果和实施例4的检测结果，根据参比物(内标分子)进行定量，得到如图4所示的标准曲线。该标准曲线的相关决定系数(R2)值为0.9982，显示出高可信的线性相关性。
权利要求
1.一种检测铁调素的方法，其中，所述方法包括如下步骤 (1)将样品液体与纳米芯片接触后，去除样品液体，得到接触样品后的纳米芯片；所述样品液体含有铁调素或不含有铁调素； (2)用洗脱液洗脱接触样品液体后的纳米芯片，得到洗脱产物；所述洗脱液能够溶解铁调素； (3)获取步骤(2)得到的洗脱产物的质谱检测结果； (4)根据所述质谱检测结果，确定洗脱产物中是否含有铁调素，或者确定洗脱产物中铁调素的含量； 步骤(I)中，所述纳米芯片包括基片和附着在所述基片上的多孔氧化硅涂层，所述多孔氧化硅涂层的平均孔径为3. 65-3. 75nm，所述多孔氧化硅涂层的比表面积为1050-1200m2/g，所述多孔氧化硅涂层具有轴向平行的多个孔道，且所述多个孔道中的7个孔道形成一个孔道组，每个孔道组包括一个中心孔道和与该中心孔道相邻并围绕该中心孔道的6个周边孔道，该6个周边孔道的截面中心连线形成正六边形。
2.根据权利要求I所述的方法，其中，所述多孔氧化硅涂层的表面的接触角小于15度。
3.根据权利要求I所述的方法，其中，步骤(I)中，所述接触的条件包括接触的温度为10-37°C，接触的时间为20-60分钟。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，所述样品液体含有样品和样品稀释液；所述样品稀释液含有水、三氟乙酸和乙腈。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，相对于I体积所述样品液体，所述样品稀释液的用量使得三氟乙酸的用量为0. 00005-0. 00015体积且乙腈的用量为0. 03-0. 07体积； 所述样品稀释液中，相对于I体积的水，三氟乙酸的含量为0. 001-0. 003体积，乙腈的含量为0. 5-1. 5体积。
6.根据权利要求1-3和5中任意一项所述的方法，其中，相对于每平方毫米所述多孔氧化硅涂层的外表面积，所述样品液体的用量为0. 5-4 u L0
7.根据权利要求1-3和5中任意一项所述的方法，其中，所述洗脱液含有三氟乙酸、乙腈和水；所述洗脱液中，相对于I体积水，三氟乙酸的含量为0. 001-0. 003体积，乙腈的含量为0. 5-1. 5体积；相对于每平方毫米所述多孔氧化硅涂层的外表面积，所述洗脱液的用量为 0. 3-2u L0
8.—种检测铁调素的试剂盒，其中，该试剂盒包括 (i)样品稀释液，所述样品稀释液含有三氟乙酸和乙腈； (ii)纳米芯片，所述纳米芯片包括基片和附着在所述基片上的多孔氧化硅涂层，所述多孔氧化硅涂层的平均孔径为3. 65-3. 75nm，所述多孔氧化硅涂层的比表面积为1050-1200m2/g，所述多孔氧化硅涂层具有轴向平行的多个孔道，且所述多个孔道中的7个孔道形成一个孔道组，每个孔道组包括一个中心孔道和与该中心孔道相邻并围绕该中心孔道的6个周边孔道，该6个周边孔道的截面中心连线形成正六边形。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其中，所述多孔氧化硅涂层的表面的接触角小于15度。
10.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其中，所述样品稀释液中，相对于I体积的水，三氟乙酸的含量为0. 001-0. 003体积，乙腈的含量为0. 5-1. 5体积。
全文摘要
本发明提供了一种检测铁调素的方法，该方法包括如下步骤(1)将样品液体与纳米芯片接触后，去除样品液体，得到接触样品后的纳米芯片；所述样品液体含有铁调素或不含有铁调素；(2)用洗脱液洗脱接触样品后的纳米芯片，得到洗脱产物；所述洗脱液能够溶解铁调素；(3)获取步骤(2)得到的洗脱产物的质谱检测结果；(4)根据所述质谱检测结果确定洗脱产物中是否含有铁调素或者确定洗脱产物中铁调素的含量。本发明还提供了一种检测铁调素的试剂盒，该试剂盒包括(i)样品稀释液，所述样品稀释液含有水、三氟乙酸和乙腈；(ii)纳米芯片。本发明提供的检测铁调素的方法，显著地提高了基于质谱的铁调素检测方法的灵敏度和准确度。
文档编号G01N27/62GK102809599SQ20111014966
公开日2012年12月5日 申请日期2011年6月3日 优先权日2011年6月3日
发明者聂广军, T·胡, 范佳, 赵宇亮, M·弗拉里 申请人:国家纳米科学中心
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