一种磷酸替米考星中磷酸根的检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种磷酸替米考星中磷酸根的检测方法，本发明通过对样品处理的优选及供试品、对照品制备方法的试验，建立了磷酸替米考星中磷酸根（PO4-3）的分析方法；通过对样品处理和试剂配制的优化，建立了兽药磷酸替米考星中磷酸根（PO4-3）检测方法；通过方法学验证试验研究表明：准确度试验的平均回收率为：100.6%，相对标准偏差RSD:1.5%；精密度试验的RSD为2.4%；线性关系良好Y=10.696X+0.0297，相关系数γ=0.9996 ； 从而充分说明，本发明所建立的方法准确度高、专属性强、重现性良好，通过对兽药磷酸替米考星中磷酸根（PO4-3）量的控制，确保其安全性，从而更有效的防治牛、山羊、绵羊、奶牛、猪、鸡等动物感染性疾病。
【专利说明】一种磷酸替米考星中磷酸根的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及制药【技术领域】，特别是涉及一种磷酸替米考星中磷酸根（PCV3)的检测 方法。
【背景技术】
[0002] 替米考星为最新型大环内酯类抗生素，主要抗革兰氏阳性菌如金葡萄菌、肺炎球 菌、链球菌等，对部分革兰氏阴性菌如流感嗜血杆菌、巴氏杆菌及家禽支原体的活性比泰乐 菌素强。内附吸收快，组织穿透力强，分布容积广，半衰期可达1?2天，体内维持时间长。 临床主要用于牛、猪、鸡、绵羊、山羊、兔等感染性疾�。乇鹗怯糜谛笄莺粑兰膊。⑷〉� 显著疗效。该药具有抗菌活性强、药代动力学特征优良、用量少、毒性小等特点。临床应用 表明：替米考星是一种安全有效的新型兽药，具有广阔的应用前景。
[0003] 替米考星具有同泰乐菌素相似的广谱抗菌活性，对革兰氏阳性菌和某些革兰氏阴 性菌、霉形体、螺旋体等均有抑制作用，对胸膜肺炎放线杆菌、巴氏杆菌及霉形体具有比泰 乐菌素更强的抗菌活性。Inamoto等报道，替米考星（TMS)、金霉素（CTC)、甲砜霉素（TP)和 泰乐菌素（TS)对日本1980?1989年间从猪肺炎损害部位分离出的61株多杀性巴氏杆菌 和35株胸膜肺炎放线杆菌的抗菌作用，大多数菌株对TMS、CTC、TP敏感。CTC和TP分别在 3. 13 μ g/ml和0.78 μ g/ml时对51株（83.6% )和46株（75.4% )多杀性巴氏杆菌有抑 制作用。TS对几乎所有菌株的抗菌活性较低，MIC彡6. 25 μ g/ml。TMS对23株（37. 7% ) 多杀性巴氏杆菌的MIC彡1. 56 μ g/ml，但在3. 13 μ g/ml时，TP和TMS分别能抑制32株 (91. 4% )和33株（94. 3% )放线杆菌，可见作为同一大环内酯类药物，泰乐菌素对两种细 菌的抗菌活性均不及替米考星。Salmon SA等用从美国、加拿大分离到的515株致病菌对 头孢噻呋、恩诺沙星、红霉素、磺胺二甲嘧啶、壮观霉素、林可霉素、磺胺嘧啶/TMP、氨苄青霉 素和替米考星等9种药物的敏感性进行测定。结果发现，抗菌作用最强的是恩诺沙星和头 孢噻呋，替米考星对巴氏杆菌和胸膜肺炎放线杆菌活性中等。替米考星对鸡霉形体表现出 较强的体外抗菌活性。Jordan等报道了替米考星和泰乐菌素对家禽6株鸡败血霉形体和3 株滑液霉形体的体外MIC值。替米考星对6株鸡败血霉形体的MIC值分别为：< 0. 0125、 0· 0025、0· 0025, > 12. 5、0· 004、0· 1、0· 0125、0· 006 和 0· 025 μ g/ml ;而泰乐菌素的 MIC 值 则分别为：< 〇· 〇125、0· 02、0· 02、3· 2、0· 016、0· 8、0· 0125、0· 025 和 0· 025μ g/ml。Ziv 等应 用替米考星对从奶牛乳房炎分离的112株金黄色葡萄球菌和其它致病菌进行MIC-90测定。 结果替米考星对乳房炎金黄色葡萄球菌和链球菌均很敏感，其中对化脓性链球菌活性最强 (MIC-90为0. 04 μ g/ml)。替米考星在小于3. 12 μ g/ml时能抑制90. 8%的其它革兰氏阳性 乳房炎致病菌。
[0004] 综上所述，磷酸替米考星作为一种较新的大环内酯类抗生素，其较强的抗菌活性 和优越的药物动力学特征，使它在畜禽敏感菌引起的肺炎、巴氏杆菌病以及乳房炎等疾病 的防治方面发挥着重要作用。因此，建立磷酸替米考星的质量控制体系，保证其产品质量就 具有非常实际的意义。
[0005] 磷酸替米考星的合成过程中，成盐结晶步骤会带入大量的游离磷酸，这些磷酸的 遗留不仅降低产品的稳定性，同时会对药品的安全性带来影响。因此，确立磷酸替米考星中 磷酸根的检测指标，对于确保磷酸替米考星的安全性具有非常重要的意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的就在于提供一种磷酸替米考星中磷酸根（PCV3)的检测方法。
[0007] 本发明采用下述技术方案实现：
[0008] -种磷酸替米考星中磷酸根的检测方法，其特征在于采用显色法将供试品溶液在 紫外分光光度计上于650nm处测吸光度，查标准曲线计算，其中
[0009] 供样品溶液的制备：精密称取样品2g，于250ml容量瓶中，加纯化水稀释至刻度， 充分摇匀，精密吸取试验溶液5ml于100ml的容量瓶中，加10%三氯乙酸溶液10ml，用水稀 释至刻度，后精密吸取滤液2ml于50ml容量瓶中，加纯化水5ml，钥酸铵溶液、米吐尔溶液各 2ml，于沸水浴中加热35min，放冷，用水稀释至刻度，摇匀即可。
[0010] 所述标准曲线采用如下方法制备：配制浓度依次为〇· 613μ g/ml、0. 9198μ g/ml、 L 2264 μ g/ml、L 5330 μ g/ml、L 8396 μ g/ml、2. 1462 μ g/ml、2. 4528 μ g/ml、2. 7594 μ g/ml 的PCV3溶液，以空白为参比，用紫外分光光度计于650nm处测吸光度，以已知P(V3浓度为纵 坐标，以测得的吸光度为横坐标，绘制标准曲线，相关系数R > 〇. 999。
[0011] 所述钥酸铵溶液的制备方法为：精密称取钥酸铵溶液5g，加水50ml，微热使溶解 后，倒入加有75ml浓硫酸和50ml水的冷混液的棕色试剂瓶中，于冰箱中保存。
[0012] 所述米吐尔溶液的制备方法为：精密称取对甲基对甲氨基酚硫酸盐0. 2g，和亚硫 酸钠 lg，加水l〇ml溶解与44g亚硫酸氢钠溶于190ml水所成的溶液，混合均匀过滤，盛入棕 色瓶中，冰箱保存。
[0013] 试验过程发现：采用GB/T5009. 87-2003《食品中磷的测定》进行样品处理，步 骤繁琐，消化时间长，并且由于磷酸替米考星具有良好的水溶性导致显色不稳定，为此，本 发明通过对样品处理的优选及供试品、对照品制备方法的试验，建立了磷酸替米考星中 磷酸根（P〇 4_3)的分析方法；通过对样品处理和试剂配制的优化，建立了兽药磷酸替米考 星中磷酸根（P〇 4_3)检测方法；通过方法学验证试验研究表明：准确度试验的平均回收率 为：100. 6%，相对标准偏差RSD: 1.5 % ;精密度试验的RSD为2.4% ;线性关系良好Y = 10. 696X+0. 0297,相关系数γ = 0. 9996 ;从而充分说明，本发明所建立的方法准确度高、专 属性强、重现性良好，通过对兽药磷酸替米考星中磷酸根（P〇4_ 3)量的控制，确保其安全性， 从而更有效的防治牛、山羊、绵羊、奶牛、猪、鸡等动物感染性疾病。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1为磷酸根（PCV3)标准曲线图。
【具体实施方式】
[0015] 采用显色法将供试品溶液在紫外分光光度计上于650nm处测吸光度，查标准曲线 计算所得。
[0016] 样品名称：磷酸替米考星，（来源：宁夏泰瑞制药股份有限公司）。
[0017] 仪器：水浴锅
[0018] 标准曲线的绘制：配制浓度依次为0· 613μ g/ml、0. 9198μ g/ml、l. 2264μ g/ml、 1· 5330μ g/ml、l. 8396μ g/ml、2. 1462μ g/ml、2. 4528μ g/ml、2. 7594μ g/ml 的 P(V3 溶液， 以空白为参比。用紫外分光光度计于650nm处测吸光度，以已知PCV3浓度为纵坐标，以测 得的吸光度为横坐标，绘制标准曲线（相关系数R > 〇. 999)。
[0019] 钥酸铵溶液（A液）的制备：精密称取钥酸铵溶液5g，加水50ml，微热使溶解后，倒 入加有75ml浓硫酸和50ml水的冷混液的棕色试剂瓶中，于冰箱中保存（保存期2周）。
[0020] 米吐尔溶液（B液）的制备：精密称取米吐尔（硫酸对甲氨基酚）0.2g，和亚硫酸 钠 lg，加水l〇ml溶解与44g亚硫酸氢钠溶于190ml水所成的溶液,混合均匀过滤，盛入棕色 瓶中，冰箱保存（保存期为2周）。
[0021] 10%三氯乙酸溶液的制备：称取固体三氯醋酸10. 0g，加水100ml溶解，摇匀后转 移至棕色试剂瓶中待用。
[0022] 供试品溶液的制备方法：精密称取磷酸替米考星样品2g，于250ml容量瓶中，加纯 化水稀释至刻度，充分摇匀，精密吸取试验溶液5ml于100ml的容量瓶中，加10%三氯乙酸 溶液l〇ml，用水稀释至刻度，精密吸取滤液2ml于50ml容量瓶中，加纯化水5ml，A液、B液 各2ml，于沸水浴中加热35min，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，（若有沉淀物则用无磷滤纸过 滤）。
[0023]
【权利要求】
1. 一种磷酸替米考星中磷酸根的检测方法，其特征在于采用显色法将供试品溶液在紫 外分光光度计上于650nm处测吸光度，查标准曲线计算，其中 供样品溶液的制备：精密称取样品2g，于250ml容量瓶中，加纯化水稀释至刻度，充分 摇匀，精密吸取试验溶液5ml于100ml的容量瓶中，加10%三氯乙酸溶液10ml，用水稀释 至刻度，后精密吸取滤液2ml于50ml容量瓶中，加纯化水5ml，钥酸铵溶液、米吐尔溶液各 2ml，于沸水浴中加热35min，放冷，用水稀释至刻度，摇匀即可。
2. 按照权利要求1所述的磷酸替米考星中磷酸根的检测方法，其特征在于所述标 准曲线采用如下方法制备：配制浓度依次为〇· 613Pg/ml、0. 9198Pg/ml、L 2264Pg/ml、 1. 533(^g/ml、l. 8396Pg/ml、2. 1462Pg/ml、2. 4528Pg/ml、2. 7594Pg/ml 的 PCV3 溶液，以空白 为参比，用紫外分光光度计于650nm处测吸光度，以已知P(V3浓度为纵坐标，以测得的吸光 度为横坐标，绘制标准曲线，相关系数R > 0. 999。
3. 按照权利要求1所述的磷酸替米考星中磷酸根的检测方法，其特征在于所述钥酸铵 溶液的制备方法为：精密称取钥酸铵溶液5g，加水50ml，微热使溶解后，倒入加有75ml浓硫 酸和50ml水的冷混液的棕色试剂瓶中，于冰箱中保存。
4. 按照权利要求1所述的磷酸替米考星中磷酸根的检测方法，其特征在于所述米吐尔 溶液的制备方法为：精密称取对甲基对甲氨基酚硫酸盐〇. 2g，和亚硫酸钠 lg，加水10ml溶 解与44g亚硫酸氢钠溶于190ml水所成的溶液，混合均匀过滤，盛入棕色瓶中，冰箱保存。
【文档编号】G01N21/33GK104266987SQ201410435947
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年8月29日 优先权日:2014年8月29日
【发明者】任勇, 张金霞, 包洁华, 李晓萍 申请人:宁夏泰瑞制药股份有限公司
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