专利名称：补体h因子用作甲基苯丙胺成瘾患者的基因表达产物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质的检测方法，具体涉及甲基苯丙胺成瘾的检测方法与补体H因子(Complement factor, CFH)用作甲基苯丙胺(methamphetamine, METH)成瘾相关人群的基因表达产物中的应用。
背景技术：
药物滥用和药物依赖既是全球普遍存在的公共卫生问题，又是�：ρ现氐纳缁嵛侍�。药物依赖性是指由药物与机体相互作用所造成的一种精神状态，有时也包括身体状态，表现出一种强迫性要求连续或定期应用该药的行为和其它反应，目的是要去感受它的精神效应，或是为了避免停药引起的不适，包括精神依赖性和身体依赖性两方面。甲基苯丙胺(Methamphetamine, METH)俗称冰毒，属于苯丙胺类兴奋剂(amphetamine-typestimulants, ATS),其结构与苯丙胺和MDMA(摇头丸)近似,是我国规定管制的精神药品。 METH是苯丙胺类毒品的代表，曾是一种处方药，用于治疗注意力不足过动症(ADHD)、嗜睡症、极端的肥胖症，后发现它具有很强的耐受性和成瘾性，使用后会产生强烈快感或兴奋，长期使用可产生身体依赖和心理依赖，在停药后出现严重的戒断症状。METH具有药物依赖、中枢兴奋、致幻、食欲抑制及拟交感能等效应，并能够对机体各器官产生一定损伤。滥用者会处于强烈兴奋状态，可以使人有能力增加、觉醒程度提高的感觉，表现出精神振奋、清醒、机敏、思维活跃、情绪高涨、注意力集中、工作能力(特别是技巧性工作能力)提高，而药效过后会出现反应迟钝，疲劳乏力，头痛头昏，心悸气�。乖昙ざ认窒�。大剂量使用METH可导致急性中毒，长期滥用可造成慢性中毒，出现被害妄想、幻觉等苯丙胺精神�。募�、心律不齐等心血管系统表现，肠胃功能障碍、脑血管病变、窒息、肺水肿、肺衰竭、肾衰竭等，严重的还可产生惊厥、脑出血、昏迷致死等。同时，静脉注射方式滥用者可引起各种感染合并症，包括肝炎、败血症和爱滋病等。此外，METH的耐受性随长期使用而增加，长期滥用者为了达到初期使用时的欣快效应，竟可将剂量增加60倍以上，这极易引起急性中毒，可造成惊闕、昏迷甚至死亡。METH由于其强烈的兴奋作用和相对易于制作的特性，使它刚应用于临床不久就开始被滥用，成为一种高度心理成瘾的新型毒品。METH见效快、药效维持时间长，第一次使用便可能会上瘾，被称为“毒品之王”。现如今，METH的滥用和成瘾已呈现全球流行趋势。根据中国国家禁毒委员会办公室发布的《2011年中国禁毒报告》，截至2010年底，我国登记在册的吸毒人员154. 5万人，其中，以METH为首的滥用合成毒品的问题较往年更加突出，仅查获登记的就有43. 2万名，新查获11. 94万名，多数是25岁以下的青年。根据2009年国家药物滥用监测年度报告，METH是新发生药物滥用者主要滥用物质，与2005年比，METH滥用比例增长31.4%。根据联合国毒品与犯罪署发布的《2011年世界毒品报告》，2009-2010年度，苯丙胺类兴奋剂中苯丙胺类物质滥用的流行率为全球年龄介于15-64岁的人口的0. 8% ±0. 5%，这个数据高于阿片类物质(0. 65% ±0. 15% )和可卡因(0. 4% ±0. 1% )的滥用率，在所有种类毒品中的流行率仅次于大麻(3.65% ±0.85%)的滥用。该数据表明，2009年，世界范围内约有一千四百万到五千七百万的15-64岁人口滥用苯丙胺类物质，而大部分滥用人群分布在亚洲地区。METH是全球范围内最为广泛生产的一种苯丙胺类兴奋齐U，近年来在人群中的使用呈现明显上升趋势。我国METH的消费已居所有非法药品交易的前三位。由于其�：π砸丫鸾コ撕Ｂ逡虻劝⑵喽酒罚晌�21世纪最危险的新型毒品之一，METH的滥用和成瘾已经成为中国乃至全球亟待解决的公共卫生问题。对METH滥用和成瘾的诊断通常采用国际通用的国际疾病分类第十版(International Classification of Diseases, I CD-10)和美国精神病学协会(AmericanPsychiatric Association, APA) 2000年修订的第四版精神病诊断与统计手册(TheDiagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders-IV,DSM-IV)中的苯丙胺类药物依赖诊断标准。这两种诊断标准均主要从用药行为着眼，判断目标个体或人群是否不当、使用METH或对此种药品产生了依赖，但由于用药行为的隐蔽性以及苯丙胺类物质的戒断反应不甚明显，目前还缺乏有效手段准确甄别个体是否对METH产生了依赖性，对刑事鉴定及临床诊断带来了难题。生物标记物是客观衡量和评估正常生理过程、病理过程或在治疗干预中对药物反应的一种特定指示物，与METH成瘾相关的稳定生物标记物，可以为其滥用情况的评估提供有效依据。目前，还未见补体因子H(Complement factor H，CFH)与METH之间存在关系的任何报道。
发明内容
本发明的目的在于提供补体H因子(Complement factor, CFH)用作甲基苯丙胺(methamphetamine, METH)成瘾相关人群的基因表达产物中的应用。本发明的目的在于提供人血清中CFH含量表达上调用于鉴定或确认METH成瘾相关人群的方法中的应用，优选所述的人血清中CFH含量选自CFH绝对含量、CFH相对含量的任一种或其组合，更优选所述的CHl相对含量为血清中CFH相对于血清总蛋白的质量百分比。本发明的优选技术方案中，所述方法通过检测人血清中的CFH蛋白含量，并将人血清中CFH蛋白含量表达上调用作鉴定METH成瘾的方法中的应用。本发明的另一目的在于提供免疫印迹法用于定量检测人血清中CFH蛋白含量的方法中的应用。本发明的目的在于提供一种用于双向电泳(2-DE)分析的血清样品的预处理方法，包括下述步骤I)静脉穿刺，分别抽取METH成瘾患者组和正常对照组的血液样品；2)将抽取的待测血液样品置于4°C下，3，OOOg转速离心lOmin，分离血清，再用白蛋白/IgG去除试剂盒去除血清中的白蛋白和IgG，即得。血清中高丰度的白蛋白和IgG会影响其他低丰度蛋白在双向电泳(2-DE)分析图谱中的检测，而低丰度蛋白(如CFH) —般为生物样本中重要的生物标记物或药物靶点，并与特定的病生理机制相关。本发明采用白蛋白/IgG去除试剂盒对血清样品进行去除白蛋白和IgG的预处理后，再进行双向电泳分析，寻找和分析差异表达蛋白后，使用生物质谱技术对差异表达蛋白进行结构确认，结果显示，CFH和a I酸性糖蛋白2 (Alpha-l-acid glycoprotein
2),转甲状腺素蛋白(Transthyretin),载脂蛋白LI (Apolipoprotein LI),和结合珠蛋白(Haptoglobin)在METH成瘾患者血清中稳定表达上调，可以作为METH成瘾相关的基因表达产物。CFH为METH成瘾患者血清中的差异表达蛋白之一。再利用酶联免疫吸附法和/或免疫印迹法检测待测血清中的CFH含量，再次验证了 METH成瘾患者血清以及METH成瘾条件性位置偏爱模型大鼠血清和成瘾相关脑区(海马、腹侧被盖区)中的CHl水平表达稳定上调，从而确认CFH为METH成瘾的相关蛋白，并将人血清中CFH蛋白含量表达上调作为鉴定METH成癒的指标。本发明的另一个目的在于提供一种血清差异表达蛋白的鉴定方法，包括下述步骤I)分别抽取METH成瘾患者组和正常对照组的血清样品，将其使用白蛋白/IgG去除试剂盒去除血清中的白蛋白和IgG，获得待测血清样品；2)将待测血清样品采用双向电泳进行分离，包括第一向等电聚焦电泳和第二向SDS-聚丙烯酰胺电泳，得到蛋白分离凝胶；3)将步骤2)得到的蛋白分离凝胶进行硝酸银染色，得到METH成瘾患者组和正常对照组的血清样品的双向电泳图谱；4)将步骤3)中得到的双向电泳图谱进行比对，选取变化稳定(重复3次及以上)、分离度较好、易切取的蛋白质斑点，斑点切下后，经过脱色和酶切后，进行生物质谱分析，得到蛋白质斑点的肽质量指纹图谱；5)将步骤4)得到的蛋白质斑点的肽质量指纹图谱在SwissProt蛋白序列数据库中检索，得到差异表达蛋白质的名称及其相关信息。本发明的优选技术方案中，所述的对照样品包括空白调零对照、空白对照、标准对照的任一种，其中，空白调零对照为加入过氧化氢-四甲基联苯胺底物及终止溶液的对照样品，用于检测时调零OD值；空白对照为加入稀释液的对照样品；标准对照为加入已知浓度的CFH蛋白标准样品的对照样品。 本发明的另一目的在于提供一种酶联免疫试剂盒，所述试剂盒由包被CFH蛋白的特异性多克隆抗体的酶标板、封闭液、样品稀释液、抗原标准品、CHl蛋白的特异性多克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗CFH多克隆抗体的二抗、浓缩洗涤液、底物和终止液，其中，所述的封闭液为含I %牛血清白蛋白的PBST溶液，所述的样品稀释液为0. OlMTris-HCl (pH 7. 4)缓冲液，所述抗原标准品为纯化的重组人CFH蛋白抗原，所述的浓缩洗涤液为25XPBST缓冲液，所述的底物为过氧化氢-四甲基联苯胺，所述的终止液为酸溶液，优选为2M的硫酸溶液。本发明的优选技术方案中，所述的PBST缓冲液的组成为，NaCl 137mmol/L, KCl
2.7mmol/L, Na2HPO4 4. 3mmol/L, KH2PO4 I. 4mmol/L, TWEEN-20 0. 05%, pH 7. 4。本发明的目的在于提供一种夹心式酶联免疫法定量检测人血清CFH蛋白的方法，所述的方法包括下述步骤I)将血清样品用0. OlM Tris-HCl (pH 7. 4)缓冲液稀释20-50倍(优选稀释为30倍)，制得待测样品；
2)将对照样品和待测样品分别加入包被了浓度为100ng/mL-20ug/mL人CFH蛋白的特异性多克隆抗体的微孔板上的微孔中，振�。筫ra蛋白与人era蛋白的特异性多克隆抗体充分结合；
3)用PBST缓冲液冲洗微孔板，去除未结合的其他组分后，加入以封闭液稀释的CFH蛋白特异性多克隆抗体稀释液，充分结合；4)弃去孔内液体后，用PBST缓冲液冲洗，去除未结合的抗体及其它组分，加入以封闭液稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗CFH多克隆抗体的二抗，充分结合；5)弃去孔内液体后，用PBST缓冲液冲洗，去除未结合的抗体及其它组分，HRP标记的抗体后，加入过氧化氢-四甲基联苯胺底物，与HRP反应；6)加入终止液，使反应停止，在450nm波长处，测定黄色反应产物的吸收度，获得CFH蛋白的绝对含量。本发明的优选技术方案中，所述的对照样品包括空白调零对照、空白对照、标准对照的任一种，其中，空白调零对照为加入过氧化氢-四甲基联苯胺底物及终止溶液的对照样品，用于检测时调零OD值；空白对照为加入稀释液的对照样品；标准对照为加入已知浓度的CFH蛋白标准样品的对照样品。本发明的优选技术方案中，所述的终止液为酸溶液，优选酸溶液为2mol/L的硫酸溶液。本发明的优选技术方案中，黄色反应产物的吸收度与CFH蛋白的浓度呈正比，可通过测量黄色反应产物的吸收度来定量检测CFH蛋白的浓度。本发明的优选技术方案中，进一步采用双金鸡宁酸(BCA)法测定血清样品中的总蛋白浓度，计算CFH蛋白相对于样品中总蛋白的含量百分比，获得CFH蛋白的相对含量。本发明的优选技术方案中，所述的双金鸡宁酸(BCA)法采用BCA蛋白定量试剂盒测定血清样品中的总蛋白浓度。本发明的另一目的在于提供一种甲基苯丙胺成瘾的检测方法，采用免疫印迹法或者酶联免疫试剂盒定量检测人血清中的CFH蛋白含量，并将人血清中CFH含量表达上调用于鉴定或确认METH成瘾相关人群，优选所述的人血清中era含量选自era绝对含量、era相对含量的任一种或其组合，更优选所述的CFH相对含量为血清中CFH相对于血清总蛋白的质量百分比。为了清楚地表述本发明的保护范围，本发明对术语进行如下界定本发明所述的人CFH蛋白的特异性多克隆抗体指由人CFH蛋白作为抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与人CFH蛋白有特异性结合能力的一组球蛋白，每种免疫球蛋白能识别人CFH蛋白分子上的一个表位。本发明所述的对照样品包括空白调零对照、空白对照、标准对照的任一种，其中，空白调零对照为加入过氧化氢-四甲基联苯胺底物及终止溶液的对照样品，用于检测时调零OD值；空白对照为加入稀释液的对照样品；标准对照为加入已知浓度的CFH蛋白标准样品的的对照样品。本发明所述的PBST 缓冲液的组成为，NaCl 137mmol/L, KCl 2. 7mmol/L, Na2HPO4
4.3mmol/L, KH2PO4 I. 4mmol/L，TWEEN-20 0. 05%, pH 7.4。本发明所述的“抗原”广义地包括了在适当条件下能直接或间接引起特异性免疫反应，且与该反应的产物反应(即与特异性抗体或特异性致敏的T淋巴细胞的任一种或其组合反应)的任何物质，如蛋白/肽、多糖、脂类和多或寡核苷酸。本发明所述的免疫检定方法包括基础夹心检定法(basic sandwich assay)、三联夹心检定(triple sandwich assay)法和免疫色谱检定法等。本发明所述的基础夹心检定法，需要二个一级抗体，其中，一个一级抗体与固定载体结合，而另一个一级抗体用检测试剂标记。本发明所述的夹心检定法中，夹心检定的固体载体选自塑料珠、聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯等；检测试剂可以是酶标记物(如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)、荧光或发光试剂(如荧光黄，罗明丹，或吖啶颜料(acridium))、放射性同位素标记(如I125)、有色颗粒(如金、银、蓝色乳液或硒)等。
除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果I、针对目前国际上对METH成瘾的鉴别诊断还停留在行为学指标上，缺乏有效的生物学指标，本发明采用双向电泳联用生物质谱技术，发现补体因子H(Complementfactor H, CFH)和 a I 酸性糖蛋白 2 (Alpha-l-acid glycoprotein 2),转甲状腺素蛋白(Transthyretin),载脂蛋白 LI (Apolipoprotein LI),和结合珠蛋白(Haptoglobin)在METH成瘾患者血清中稳定表达上调，可以作为METH成瘾相关的基因表达产物，并将人血清中CFH蛋白含量表达上调作为鉴定METH成瘾的指标。2、本发明提供了人血清中CFH含量表达上调用于鉴定或确认METH成瘾相关人群的方法中的应用，优选所述的人血清中CFH含量选自CFH绝对含量、CFH相对含量的任一种或其组合，更优选所述的CHl相对含量为血清中CFH相对于血清总蛋白的质量百分比。3、本发明采用白蛋白/IgG去除试剂盒对血清样品进行去除白蛋白和IgG的预处理后，再进行双向电泳分析，寻找和分析差异表达蛋白后，使用生物质谱技术对差异表达蛋白进行结构确认，结果显示，补体因子H(Complement factor H, CFH)和a I酸性糖蛋白 2 (Alpha-l-acid glycoprotein 2),转甲状腺素蛋白(Transthyretin),载脂蛋白LI (Apolipoprotein LI),和结合珠蛋白(Haptoglobin)在METH成瘾患者血清中稳定表达上调，可以作为METH成瘾相关的基因表达产物。CFH为METH成瘾患者血清中的差异表达蛋白之一。再利用酶联免疫吸附法和/或免疫印迹法检测待测血清中的CHl含量，再次验证了 METH成瘾患者血清以及METH成瘾条件性位置偏爱模型大鼠血清和成瘾相关脑区(海马、腹侧被盖区)中的CFH水平表达稳定上调，从而确认CFH为METH成瘾的相关蛋白，并将人血清中CFH蛋白含量表达上调作为鉴定METH成瘾的指标。
图IMETH患者与对照血清蛋白双向电泳图谱；图2表达差异蛋白区域放大及表达量分析结果；图31号蛋白斑点肽指纹图谱(peptide mass fingerprinting, PMF)检测结果。
图41号蛋白斑点数据库检索结果。图52号蛋白斑点肽指纹图谱(peptide mass fingerprinting, PMF)检测结果。图62号蛋白斑点数据库检索结果。图73号蛋白斑点肽指纹图谱(peptide mass fingerprinting, PMF)检测结果。图83号蛋白斑点数据库检索结果。图94号蛋白斑点肽指纹图谱(peptide mass fingerprinting, PMF)检测结果。图104号蛋白斑点数据库检索结果。 图115号蛋白斑点肽指纹图谱(peptide mass fingerprinting,PMF)检测结果。图125号蛋白斑点数据库检索结果。图136号蛋白斑点肽指纹图谱(peptide mass fingerprinting,PMF)检测结果。图146号蛋白斑点数据库检索结果。图157号蛋白斑点肽指纹图谱(peptide mass fingerprinting,PMF)检测结果。图167号蛋白斑点数据库检索结果。图17METH成瘾条件性位置偏爱大鼠模型建立方法的示意图；图18大鼠条件性位置偏爱(CPP)实验结果(与正常对照组相比< 0. 001)；图19免疫印迹分析法分析METH成瘾患者及大鼠血清CFH表达变化情况(与正常对照组相比*P < 0. 05 ;**P < 0. 01)；图20ELISA分析法分析METH成瘾患者及大鼠血清CFH表达变化情况(与正常对照组相比*P < 0. 05 ;**P < 0. 01)；图21免疫印迹分析法分析METH成瘾大鼠相关脑区CFH表达变化情况(与正常对照组相比*P < 0. 05 ;**P < 0. 01)。
具体实施例方式以下将结合实施例具体说明本发明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明的实质。实施例I人血清样本的制备和CFH的分离I、受试人群METH成瘾患者经由北京大学中国药物依赖性研究所协助、从深圳市强制隔离戒毒所招募；正常对照(健康志愿者)从北京大学第三医院招募。所有受试者签署知情同意书后，由成瘾相关专业人员进行评估诊断。METH成瘾患者的选取依据中华人民共和国《吸毒成瘾认定办法》(公安部令第115号)、《苯丙胺类药物依赖诊断治疗指导原则》以及国际相关标准国际疾病分类第十版(International Classification of Diseases, ICD-10)和美国精神病学协会(American Psychiatric Association, APA) 2000年修订的第四版精神病诊断与统计手册(The Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders-IV,DSM-IV)中的苯丙胺类药物依赖诊断标准。评估项目包括苯丙胺类药物滥用行为、用药时间、减药或停药后的戒断症状、药物耐受性以及社会功能等。METH成瘾患者组和正常对照组中的研究对象均为中国汉族男性，每组30名。METH成瘾患者组的患者为口服方式成瘾者(见表I)，年龄在25. 9±4. 0岁之间。采血时间为末次使用苯丙胺类药物48小时之内，且未经任何成瘾相关治疗。所有患者尿毒品检测结果均为阳性，并有自供或他供METH药物滥用史。正常对照组从非METH成瘾的健康志愿者中招募(见表I)，年龄在18_22岁之间，没有苯丙胺类药物滥用史，经过DSM-IV苯丙胺类药物依赖诊断标准的评定，排除METH成瘾以及其它精神类疾病。表I.受试者统计学信息
权利要求
1.补体H 因子(Complement factor, CFH)用作甲基苯丙胺(methamphetamine, METH)成瘾相关人群的基因表达产物中的应用。
2.人血清中Cm含量表达上调用于鉴定或确认METH成瘾相关人群的方法中的应用，优选所述的人血清中CFH含量选自CFH绝对含量、CFH相对含量的任一种或其组合，更优选所述的CFH相对含量为血清中CFH相对于血清总蛋白的质量百分比。
3.免疫印迹法用于定量检测人血清中CFH蛋白含量的方法中的应用。
4.一种用于双向电泳(2-DE)分析的血清样品的预处理方法，包括下述步骤 1)静脉穿刺，分别抽取METH成瘾患者组和正常对照组的血液样品； 2)将抽取的待测血液样品置于4°C下，3，OOOg转速离心lOmin，分离血清，再用白蛋白/IgG去除试剂盒去除血清中的白蛋白和IgG，即得。
5.一种血清差异表达蛋白的鉴定方法，包括下述步骤 1)分别抽取METH成瘾患者组和正常对照组的血清样品，将其使用白蛋白/IgG去除试剂盒去除血清中的白蛋白和IgG，获得待测血清样品； 2)将待测血清样品采用双向电泳进行分离，包括第一向等电聚焦电泳和第二向SDS-聚丙烯酰胺电泳，得到蛋白分离凝胶； 3)将步骤2)得到的蛋白分离凝胶进行硝酸银染色，得到METH成瘾患者组和正常对照组的血清样品的双向电泳图谱； 4)将步骤3)中得到的双向电泳图谱进行比对，选取变化稳定(重复3次及以上)、分离度较好、易切取的蛋白质斑点，斑点切下后，经过脱色和酶切后，进行生物质谱分析，得到蛋白质斑点的肽质量指纹图谱； 5)将步骤4)得到的蛋白质斑点的肽质量指纹图谱在SwissProt蛋白序列数据库中检索，得到差异表达蛋白质的名称及其相关信息。这些差异高表达的蛋白是补体因子 H(Complement factor H, CFH), a I 酸性糖蛋白 2 (Alpha-l-acid glycoprotein 2),转甲状腺素蛋白(Transthyretin),载脂蛋白LI (Apolipoprotein LI),和结合珠蛋白(Haptoglobin)。
6.根据权利要求5所述的鉴定方法，所述的对照样品包括空白调零对照、空白对照、标准对照的任一种，其中，空白调零对照为加入过氧化氢-四甲基联苯胺底物及终止溶液的对照样品，用于检测时调零OD值；空白对照为加入稀释液的对照样品；标准对照为加入已知浓度的CFH蛋白标准样品的对照样品。
7.—种酶联免疫试剂盒，所述试剂盒由包被CFH蛋白的特异性多克隆抗体的酶标板、封闭液、样品稀释液、抗原标准品、CHl蛋白的特异性多克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗CFH多克隆抗体的二抗、浓缩洗涤液、底物和终止液，其中，所述的封闭液为含1%牛血清白蛋白的PBST溶液，所述的样品稀释液为0. OlM Tris-HCKpH 7.4)缓冲液，所述抗原标准品为纯化的重组人CFH蛋白抗原，所述的浓缩洗涤液为25XPBST缓冲液，所述的底物为过氧化氢-四甲基联苯胺，所述的终止液为酸溶液，优选为2M的硫酸溶液。
8.—种夹心式酶联免疫法定量检测人血清CFH蛋白的方法，所述的方法包括下述步骤 I)将血清样品用0. OlM Tris-HCl (pH 7. 4)缓冲液稀释20-50倍(优选稀释为30倍)，制得待测样品；2)将对照样品和待测样品分别加入包被了浓度为100ng/mL-20ug/mL人CFH蛋白的特异性多克隆抗体的微孔板上的微孔中，振�。笴Hl蛋白与人CFH蛋白的特异性多克隆抗体充分结合； 3)用PBST缓冲液冲洗微孔板，去除未结合的其他组分后，加入以封闭液稀释的CFH蛋白特异性多克隆抗体稀释液，充分结合； 4)弃去孔内液体后，用PBST缓冲液冲洗，去除未结合的抗体及其它组分，加入以封闭液稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗CFH多克隆抗体的二抗，充分结合； 5)弃去孔内液体后，用PBST缓冲液冲洗，去除未结合的抗体及其它组分，HRP标记的抗体后，加入过氧化氢-四甲基联苯胺底物，与HRP反应； 6)加入终止液，使反应停止，在450nm波长处，测定黄色反应产物的吸收度，获得CFH蛋白的绝对含量。
9.根据权利要求8所述的方法，进一步采用双金鸡宁酸(BCA)法测定血清样品中的总蛋白浓度，计算CFH蛋白相对于样品中总蛋白的含量百分比，获得CFH蛋白的相对含量。
10.根据权利要求8或9所述的方法，所述的双金鸡宁酸(BCA)法采用BCA蛋白定量试剂盒测定血清样品中的总蛋白浓度。
11.一种甲基苯丙胺成瘾的检测方法，采用免疫印迹法或者酶联免疫试剂盒定量检测人血清中的CFH蛋白含量，并将人血清中CFH含量表达上调用于鉴定或确认METH成瘾相关人群，优选所述的人血清中CFH含量选自CFH绝对含量、CFH相对含量的任一种或其组合，更优选所述的CHl相对含量为血清中CFH相对于血清总蛋白的质量百分比。
全文摘要
本发明涉及一种甲基苯丙胺成瘾的检测方法与补体H因子(Complement factor，CFH)用作甲基苯丙胺(methamphetamine，METH)成瘾相关人群的基因表达产物中的应用，发明人通过大量的实验发现，CFH和α1酸性糖蛋白2(Alpha-1-acid glycoprotein 2)，转甲状腺素蛋白(Transthyretin)，载脂蛋白L1(Apolipoprotein L1)，和结合珠蛋白(Haptoglobin)在METH成瘾患者血清中稳定表达上调，可以作为METH成瘾相关的基因表达产物。采用免疫印迹法或酶联免疫试剂盒定量检测人血清中的CFH蛋白含量，并将人血清中CFH蛋白含量表达上调用作鉴定METH成瘾的方法中的应用。
文档编号G01N33/68GK102707068SQ20121017648
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月31日 优先权日2012年5月31日
发明者刘志民, 史琬璐, 蒲小平, 赵欣 申请人:北京大学
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