专利名称：显微镜方盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及显微镜方盒。
背景技术：
荧光显微是通过成像来自处在样品上或内的像有机分子或无机化合物那样的目标物质的荧光或磷光发射，以研究样品的结构或性质的光显微技术。例如，样品可以用荧光团(fluorophore)来标记，所述荧光团即吸收激发波长附近的光并作为响应发出荧光、从而发出典型地长于激发波长的发射波长上的光的分子。通过检测发出的荧光而获取样品的荧光图像。全内反射荧光(TIRF)显微是只在样品的表面附近探测荧光的技术。在TIRF中， 当光束以临界角或大于临界角照射在样品上时发生入射光的全内反射，该临界角至少部分取决于样品和周围环境的光学性质。尽管入射光被反射，但在样品中生成具有与入射光相同波长的隐失波(evanescent wave)。隐失波在远离样品表面的地方成指数衰减，并且只穿入样品中很浅深度。因此，只有样品表面附近的荧光团被激发。因为通过TIRF只探测样品的很小区域，所以相对于标准荧光显微技术提高了所得图像的信噪比。
发明内容
在一般方面中，显微镜方盒包括外壳，该外壳具有在该外壳的第一壁上的第一开口和在该外壳的第二壁上的第二开口，该第一壁与该第二壁相邻；布置在该第一开口内的激发滤光器；布置在该第二开口内的发射滤光器；以及位于该外壳内的分色镜。该分色镜具有大于或等于1. 5mm的厚度。在另一个方面中，显微镜方盒包括外壳，该外壳包括在该外壳的第一壁上的第一开口和在该外壳的第二壁上的第二开口，该第一壁与该第二壁相邻；布置在该第一开口内的激发滤光器；布置在该第二开口内的发射滤光器；以及位于该外壳内的分色镜。该激发滤光器相对于该外壳的第一壁成角度放置。这些实施例可以包括如下之一或多种。该分色镜具有在2mm到3mm之间的厚度。 该分色镜被放置成接收从第一开口入射的光和从第二开口入射的光。该激发滤光器相对于该外壳的第一壁成角度放置。该激发滤光器与该第一壁之间的角度在0°到10°之间，例如，大约3. 75°。该发射滤光器相对于该外壳的第二壁成角度放置。该发射滤光器与该第二壁之间的角度在0°到10°之间，例如，大约4°。该分色镜与该第一壁之间的角度是可调的。该分色镜与该第一壁之间的角度手动地或通过压电驱动器来调整。该分色镜与该第二壁之间的角度是可调的。该显微镜方盒进一步包括与该第一壁和该第二壁两者接触的第三壁，该分色镜与该第三壁之间的角度是可调的。该显微镜方盒被配置成可移除地插入显微镜中。该显微镜方盒被配置成接收来自激光器的光。该显微镜方盒由金属制成。该显微镜方盒进一步包括用于附在激光器模拟板 (breadboard)上的适配器。该激发滤光器、该发射滤光器、和该分色镜的光学特性根据目标样品的光学特性来选择。除了别的优点之外，本文所述的显微镜方盒非常适合涉及激光器光源的各种应用。被倾斜的激发滤光器反射的来自激光器的任何入射光不沿着与入射光相同的路径被反射回来。因此防止了反射光重新进入激光器中，避免了引起激光器空腔中的干涉图案和潜在损伤或甚至毁坏激光器的状况。倾斜的发射滤光器有助于减少可以由入射的激光引起的或由样品发出的荧光引起的、以及能在成像面中产生不希望干涉图案的内部反射(即，显微镜方盒内的反射)。具有光滑表面的极平坦分色镜对于TIRF显微来说是重要的。本文所述的显微镜方盒能够接纳厚分色镜。一般说来，在厚镜上形成平坦、光滑表面比在薄镜上既更廉价又更容易。但是，厚镜可能对光束的路径产生不可忽略影响，可以将这种影响计算出来，以确定显微镜内的光路。而且，较厚的镜片降低了由施加于镜的任何应力或力矩引起的光学效应。显微镜中的分色镜的角度是可调的，以便使TIRF临界角更好地对准。可调分色镜进一步使显微镜方盒可用在各种显微镜型号中或用于其它非商业、定制应用和用在各种波长上。将分色镜的角度调整成使显微镜方盒的光学元件与特定显微镜的光学元件对准， 以达到更精确的TIRF条件。类似地，可以将镜子的角度调整成达到给定激发波长的TIRF 条件。可调镜子还具有改进显微镜的转台内的不同显微镜方盒之间的图像配准(image registration)的优点。本文所述的显微镜方盒的进一步优点是它的机械稳定性。由金属制成的显微镜方盒即使稍有偏角地插入显微镜中，也只将很小的力矩施加在内部的光学元件上或不会将力矩施加在内部的光学元件上。显微镜中的紧密适配的旋塞阀(stopcock)系统或螺栓座进一步稳定了显微镜中的显微镜方盒。显微镜方盒的稳定性对于保证一旦TIRF对准了光学元件就不受力矩、振动或其它机械力干扰来说是重要的。更一般地说，显微镜方盒的尺寸和显微镜方盒内的镜子和滤光器的定位可针对各种显微镜型号定制。
图1是被配置用于全内反射荧光(TIRF)显微的显微镜的示意图；图2是显微镜方盒的透视图；图3示出了在TIRF条件下相对于样品的表面放置的物镜；图4A是图2的显微镜方盒的前视图；图4B是沿着图4A的显微镜方盒的剖面A-A的剖视图；图4C是图2的显微镜方盒的底视图；以及图5示出了用在激光器模拟板装置中的显微镜方盒。
具体实施例方式参照图1，被配置用于全内反射荧光(TIRF)显微的显微镜100用于成像支承在显微镜台101上的样品102。样品102包含荧光团，该荧光团吸收激发波长的光，并对该光作出响应而发出荧光，从而发出在长于激发波长的发射波长上的光。像激光器那样的光源104 产生在荧光团的激发波长上的光。光源104与光纤106耦合，光纤106将激发光束108从光源104传送到显微镜100。在一些实施例中，从光源发出的光不经过光纤传送直接传递给显微镜方盒150。在其它实施例中，激发光束108在到达显微镜方盒150之前通过像透镜和光阑那样的光学元件。激发光束108进入位于显微镜100的转台107中的显微镜方盒150 的第一端口 151中。旋塞阀系统使显微镜方盒150保持在显微镜100的转台107内。转台107中的弹簧124支承的球体122被显微镜方盒150侧面的小燕尾凹口(dovetail indent) 120接纳。 弹簧1 提供的摩擦使显微镜方盒保持在位置上。凹口 120进一步防止了显微镜方盒150 的移动。球体122与凹口 150之间的紧密适配稳定了转台107中的显微镜方盒150。在其它实施例中，在转台107中提供了将显微镜方盒150锁定在位置上的机构。可替代的是，在显微镜方盒的侧面或基底中(例如，在燕尾凹口 120中)钻一个使显微镜方盒可以螺栓在显微镜中的位置上的小孔。这样的螺栓连接防止了显微镜方盒在显微镜的转台107或其它滑动机构内的任何运动。参照图1和2，显微镜方盒150包括容纳在端口 151中和接收来自光纤106的激发光束108的短波通(short-pass)激发滤光器152。在其它实施例中，滤光器152是只透射波长与样品102中的荧光团的激发波长类似的激发光束108分量的带通滤光器。激发光束108透射过激发滤光器152，并被长波通(long-pass)分色镜IM接收，该长波通分色镜 154反射在荧光团的激发波长上的光，并且透射在荧光团的发射波长上的光。因此，激发光束108被分色镜IM反射。分色镜IM在显微镜方盒150内对角地取向，例如，相对于侧壁 156成大约45°角，这样使得激发光束108通过开口 158朝着样品102反射。在其它实施例中，分色镜巧4是透射激发光束108和反射在荧光团的发射波长上的光的短波通镜。显微镜方盒150的这个实施例往往与显微镜的定制布置或定制模拟板设计一起使用。在从显微镜方盒出射后，激发光束108通过物镜110，并且照射在样品102上，其在样品102上激发存在于样品102之中的荧光团。荧光团发出荧光，从而发出在荧光团的发射波长上的荧光112。荧光112被物镜110收集，并且被形成为通过开口 158进入显微镜方盒150中的发射光束114。在显微镜方盒150中，发射光束114透射过分色镜154，并且照射容纳在显微镜方盒150中的第二端口 161中的发射滤光器160。发射滤光器160是透射荧光团的发射波长附近的光，并且且反射其它光(诸如例如可能已被样品102反射的在激发波长上的任何光)的带通滤光器。在一些实施例中，发射滤光器160是长波通滤光器。 因此，发射光束114透射过发射滤光器160，并被引导出显微镜100至检测系统116。检测系统116例如是传感器、分光光度计、CCD照相机、或目镜。在一些实施例中，在发射滤光器 160与检测系统116之间存在像透镜或分束器那样的光学元件，以便适当地引导发射光束 114。为了用在TIRF显微中，优选使用表面光滑的平坦分色镜154，因为平坦、光滑镜中的缺陷对激发光束108的散射较小。一般说来，在厚镜上形成平坦、光滑表面比在薄镜上既更廉价又更容易。将显微镜方盒150配置成接纳厚度大于或等于大约0. 5mm的分色镜，诸如厚度大于或等于1. 5mm，在大约1. 5mm和3mm之间，或者在大约2mm与3mm之间。但是，在朝着物镜110反射后，厚分色镜1 可能对激发光束108的路径产生不可忽略的影响，在对激发光束108的路径的任何确定中要计及这种影响。显微镜方盒150可从显微镜100中移除。由于每种类型的荧光团有它自己独特的激发和发射谱，所以对每种类型荧光团使用激发滤光器152、分色镜154、和发射滤光器160 的不同组合。因此，可以组装具有滤光器和镜的特定组合的显微镜方盒，以用在特定类型的荧光团上。取决于存在于样品102之中的荧光团类型，将具有滤光器和镜的适当组合的显微镜方盒插入显微镜100的转台107中。类似地，选择显微镜方盒150中的滤光器和镜子以用在特定光源上。显微镜方盒150典型地由金属制成，这样使得显微镜方盒中的滤光器 152，160和镜子IM对力矩、振动、和其它机械干扰稳定。参照图1和3，激发光束108通过物镜110，并且以入射角302照射在样品102的表面300上。当入射角302接近临界角时，发生激发光束108的全内反射，并且激发光束被反射成反射光束304。在样品102中生成具有与激发光束108相同波长的隐失波306，并且隐失波306激发样品102的表面300附近的荧光团308。激发光束108照射样品102的入射角302通过物镜110和通过显微镜方盒150内的分色镜154的角度来控制(参见下文)。在TIRF显微中，激发光束108聚焦在物镜110 的后焦面312上的焦点310上。如果焦点310处在物镜110的中心上(即，在点314上)， 则激发光束108垂直(S卩，以0°的入射角302)照射样品102。随着焦点310从物镜110 的中心314移开，激发光束108被物镜110折射，并且出射成以大于0°的入射角302照射在样品102上。因此，通过适当定位焦点310，可以实现临界入射角，以便发生激发光束108 的全内反射。现在参照图2和3，物镜110上焦点310的位置通过分色镜154来控制。因此，通过改变显微镜方盒150内的分色镜154的角度，调整当激发光束108从显微镜方盒150出射时激发光束108的角度。在一些实施例中，分色镜154的角度通过手使用旋钮162或其它类似设备来调整。在其它实施例中，分色镜154的角度可通过一组柱180，182，184和调整螺丝190，192，194(参见图4C)在三个维度上进行调整。在其它实施例中，分色镜154的调整是计算机控制的，例如，经由压电驱动器进行控制。可调分色镜154也有利于显微镜100内的显微镜方盒150的对准，这种对准一般在将显微镜方盒150插入显微镜100中之前利用激光器夹具(jig)对准工具来进行。在其它例子中，对准可以在显微镜方盒安装于显微镜中时进行，例如，通过使用压电驱动器来进行，从而使得能够进行精确调整以对于显微镜方盒安装于其中的特定显微镜而优化显微镜方盒的几何。显微镜方盒150可以用在各种显微镜中；通过调整分色镜的角度，可以将显微镜方盒中的光学元件与方盒插入在其中的特定显微镜的光学元件对准。参照图4A和4B，来自光纤106的激发光束108照射激发滤光器152，该激发滤光器 152相对于显微镜方盒150的第一壁402倾斜角度400。角度400主要受限于方盒150的物理约束和激发光束108路径中的无阻挡光阑的要求。角度400的范围从大约0°到10°， 典型地为大约3. 75°。在一些情况下，根据角度400选择滤光器152涂层的成分。在一些实施例下，角度400可使用楔形垫片(wedge washer)401来调整。由于激发滤光器152的倾斜，激发滤光器152反射的任何光404都不会沿着与入射激发光束108相同的路径反射回来。因此，防止了反射光404重新进入光纤106和光源104。反射光的重新进入对于激光器光源来说尤其令人担心，因为这样的状况可能潜在地在激光器空腔中引起能够损害或甚至毁坏激光器的有害干涉图案。将激发端口 151设计成接纳厚度高达6mm的激发滤光器 152。6mm的间隙使激发滤光器152可以从多种类型的滤光器中选择。而且，6mm的间隙还允许多个薄光学元件插入激发端口 151中。例如，端口 151可以容纳选择激发波长的短波通滤光器和减小激发光束功率的中性密度滤光器。类似地，参照图4B和4C，使发射滤光器160相对于显微镜方盒150的第二壁408 倾斜角度406，以便减少发射光束114的内反射。角度406主要受限于方盒150的物理约束和发射光束114路径中的无阻挡光阑的要求。角度406的范围从大约0°到10°，典型地大约4°。在一些实施例中，角度406可使用处在发射端口 161中的楔形垫片407来调整。将发射端口 161设计成接纳厚度高达6mm的发射滤光器160。与激发端口 151—样， 6mm的间隙允许发射滤光器160从多种类型的选项中选择，或可替代地，允许多个薄光学元件插入到发射端口 161中。例如，在一个实施例中，可以将容纳在2. 3mm厚环中的长波通发射滤光器与容纳在第二 2. 3mm厚环中的带通发射滤光器一起使用。每个滤光器单独提供6 光密度(o. d.)的遮挡。两个滤光器一起使用提供接近9的ο. d.。脊件410处在显微镜方盒150的接收大量不希望的散射和/或反射光的区域中。 脊件410起挡板的作用，从而吸收这种不希望的光，或否则防止光进入激发光束108或发射光束114的路径中。参照图5，在另一个实施例中，显微镜方盒500包括配置成附在柱504上以便用在激光器模拟板506上的燕尾适配器502。在这个实施例中，显微镜方盒500接收来自像等离子激光器那样的光源508的直接照射。倾斜的激发滤光器510防止光反射回到光源508。参照图5，燕尾适配器502使显微镜方盒150附在支柱504上以便用在激光器模拟板506上。在其它实施例中，将螺丝或其它类型的适配器用于附在支柱504上。显微镜方盒150接收来自像等离子激光器那样的光源510和/或其它光源的直接照射508。倾斜的激发滤光器152防止激发滤光器反射的任何光512沿着与入射照射508相同的路径反射回来。因此防止了反射光重新进入激光器中，避免了在激光器空腔中引起干涉图案和潜在损伤或甚至毁坏激光器的状况。应该明白，前面的描述旨在例示本发明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其它实施例在所附权利要求书的范围之内。
权利要求
1.一种显微镜方盒，包含外壳，其包括在所述外壳的第一壁上的第一开口和在所述外壳的第二壁上的第二开口，所述第一壁与所述第二壁相邻；布置在所述第一开口内的激发滤光器； 布置在所述第二开口内的发射滤光器；以及位于所述外壳内的分色镜，所述分色镜具有大于或等于1. 5mm的厚度。
2.如权利要求1所述的显微镜方盒，其中所述分色镜具有在2mm与3mm之间的厚度。
3.如权利要求1所述的显微镜方盒，其中所述分色镜被放置成接收从所述第一开口入射的光和从所述第二开口入射的光。
4.如权利要求1所述的显微镜方盒，其中所述激发滤光器相对于所述外壳的第一壁成角度放置。
5.如权利要求1所述的显微镜方盒，其中所述发射滤光器相对于所述外壳的第二壁成角度放置。
6.如权利要求1所述的显微镜方盒，其中所述分色镜与所述第一壁之间的角度是可调的。
7.如权利要求6所述的显微镜方盒，其中手动调整所述分色镜与所述第一壁之间的角度。
8.如权利要求6所述的显微镜方盒，其中所述分色镜与所述第一壁之间的角度通过压电驱动器来调整。
9.如权利要求1所述的显微镜方盒，其中所述分色镜与所述第二壁之间的角度是可调的。
10.如权利要求1所述的显微镜方盒，进一步包含与所述第一壁和所述第二壁两者接触的第三壁，其中所述分色镜与所述第三壁之间的角度是可调的。
11.如权利要求1所述的显微镜方盒，其中所述显微镜方盒被配置成可移除地插入显微镜中。
12.如权利要求1所述的显微镜方盒，其中所述显微镜方盒被配置成接收来自激光器的光。
13.如权利要求1所述的显微镜方盒，其中所述显微镜方盒由金属制成。
14.如权利要求1所述的显微镜方盒，进一步包含附在激光器模拟板上的适配器。
15.如权利要求1所述的显微镜方盒，其中所述激发滤光器、所述发射滤光器、和所述分色镜的光学特性根据目标样品的光学特性来选择。
16.一种显微镜方盒，包含外壳，其包括在所述外壳的第一壁上的第一开口和在所述外壳的第二壁上的第二开口，所述第一壁与所述第二壁相邻；布置在所述第一开口内和相对于所述外壳的第一壁成角度放置的激发滤光器； 布置在所述第二开口内的发射滤光器；以及位于所述外壳内的分色镜。
17.如权利要求16所述的显微镜方盒，其中所述激发滤光器与所述第一壁之间的角度在0°到10°之间。
18.如权利要求17所述的显微镜方盒，其中所述激发滤光器与所述第一壁之间的角度是大约3. 75°。
19.如权利要求16所述的显微镜方盒，其中所述发射滤光器相对于所述外壳的第二壁成角度放置。
20.如权利要求19所述的显微镜方盒，其中所述发射滤光器与所述第二壁之间的角度在0°到10°之间。
21.如权利要求20所述的显微镜方盒，其中所述发射滤光器与所述第二壁之间的角度是大约4°。
22.如权利要求16所述的显微镜方盒，其中所述分色镜被放置成接收从所述第一开口入射的光和从所述第二开口入射的光。
23.如权利要求16所述的显微镜方盒，其中所述分色镜与所述第一壁之间的角度是可调的。
24.如权利要求16所述的显微镜方盒，其中所述分色镜与所述第二壁之间的角度是可调的。
25.如权利要求16所述的显微镜方盒，进一步包含与所述第一壁和所述第二壁两者接触的第三壁，其中所述分色镜与所述第三壁之间的角度是可调的。
全文摘要
一种显微镜方盒包括外壳，该外壳包括在该外壳的第一壁上的第一开口和在该外壳的第二壁上的第二开口，该第一壁与该第二壁相邻；布置在该第一开口内的激发滤光器；布置在该第二开口内的发射滤光器；以及位于该外壳内的分色镜。在一个方面中，该分色镜具有大于或等于1.5mm的厚度。在另一个方面中，该激发滤光器相对于该外壳的第一壁成角度放置。
文档编号G01N21/64GK102472889SQ201080035491
公开日2012年5月23日 申请日期2010年8月4日 优先权日2009年8月10日
发明者C·M·斯坦利 申请人:致茂电子股份有限公司
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
