专利名称：肝细胞癌标记物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于在受试动物中诊断肝细胞癌的肝细胞癌标记物以及使用该标记物区别诊断肝硬化和肝细胞癌的方法。
背景技术：
近年来，已知许多蛋白质上结合有糖链，结合了蛋白质的糖链作为细胞间粘附或分离等的信号以及作为蛋白质的合成和运输、分解等的辅助因子的作用也日益明确。有报道表明，在复杂的糖链结构内，即使只有一个糖存在，结合有糖链的蛋白质所具有的功能也会改变。例如，血清中大量存在的免疫球蛋白，在其Fc区域具有N-连接型糖链的结合位点。有报道表明，在该结合位点结合的糖链结构中具有在还原末端的GICNAC处连接有岩藻糖的糖链结构的免疫球蛋白，与具有未连接岩藻糖的糖链结构的免疫球蛋白相比，其具有的抗体依赖性细胞毒性相差100倍以上。然而，纯化糖蛋白糖链需要大量的时间，糖链结构的系统性分析方法尚不成熟，因此，尚不能简单、灵敏并且定量地分析糖蛋白糖链。在这种情况下，本发明者之一的池中等人，通过使用HPLC系统的方法，发现一种具有一个岩藻糖基化外臂的三天线型三半乳糖基化结构(triantermary trigalactosylated structure with one outer arm fucosylation)(下文中称为A3G3Fo)的糖链，其在肺癌患者血清中有所增加(非专利文献1、幻。此外，在专利文献1中，基于A3G3R)检测肺癌的癌症检测法以及用于该方法中的癌症检测物质已被公开。然而，上述专利文献和非专利文献仅特别地公开了肺癌的特异性糖蛋白糖链，尚未公开关于其他组织的癌中的糖蛋白糖链。已知的是，肝脏合成和分泌血液中几乎所有的糖蛋白，所以，当体内引起炎症或肝脏本身的功能发生损害时，就会观察到血清中糖蛋白的表达发生变化。目前，临床上使用的肝细胞癌标记物有甲胎蛋白(AFP)和维生素K缺乏诱导的蛋白IKprotein induced vitamin K II) (PIVKAII)，发现不仅是肝细胞癌的情况下标记物会上升，炎症反应等情况下标记物也有所上升。而且，早期肝细胞癌中，标记物经常不上升。即，这些标记物用于检测肝细胞癌的准确度和特异性方面并不够。其中，就AFP而言，检测的是具有岩藻糖基化糖链的AFP，已知可以提高肝细胞癌的诊断准确度(特异性)，但是，至今尚不存在能对肝硬化和肝细胞癌进行准确的区别诊断的标记物。近年来的一系列研究中有报道称，在肝细胞癌患者的血清中和肝脏细胞的前体细胞中，合成糖链的糖基转移酶的活性提高，表达出正常成熟肝脏细胞中未发现的糖链结构。 但是，尚未发现能对肝硬化和肝细胞癌进行准确的区别诊断的作为指标的分子。在这样的背景下，期待一种检测方法来分析肝病患者的血清中糖蛋白糖链的异常，进而区分肝硬化和肝细胞癌，并且准确地诊断出早期肝细胞癌。现有技术文献专利文献
专利文献1 特开2001-289860号公报非专利文献非专利文献1 J. Biochem. 129，537-542, 2001非专利文献2 =Anal. Biochem. 267,336-343,199
发明内容
本发明的目的是提供ー种生物标记物以及使用该标记物来诊断肝細胞癌的方法 等，所述生物标记物用于诊断受试动物中的肝細胞癌，尤其是用于肝硬化和肝細胞癌的区 别诊断。本发明人等认真研究解决上述问题，结果发现，在检测受试者血清中二天线型的 N-连接型糖链(尤其是中性糖链型M5A、A2G0、A2G0B、A2G1 (6) FB, A2G2B ；脱唾液酸糖链型 A2G2B和A2G2R^)吋，肝細胞癌患者血清中含有的量与健康者和肝硬化患者血清中含有的 量相比有明显的差別。此外，发现以中性糖链型M5、A2G0B、A2G1(6)FB和A2G2B在受试者 血清中的量为指标吋，有可能诊断出按 M分类为I期的早期肝細胞癌患者，可以区别诊断 肝硬化和肝細胞癌。而且，这些肝細胞癌标记物可以检测出以往的肝細胞癌标记物AFP和 PIVKAII无法检测出的早期肝細胞癌，从而完成本发明。本发明提供如下内容。(1) ー种含有下式(1)-(7)之任ー项表示的糖链的肝細胞癌标记物，化学式权利要求
1. 一种含有下式(1)-(7)之任一项表示的糖链的肝细胞癌标记物， 化学式1
2.一种用于受试动物中诊断肝细胞癌的测定方法，其特征在于，测定从所述动物采集的体液中的权利要求1所述的肝细胞癌标记物的量，并以所述肝细胞癌标记物的量或基于所述肝细胞癌标记物的量计算出的值为指标。
3.如权利要求2所述的用于诊断肝细胞癌的测定方法，其中，所述测定权利要求1所述的肝细胞癌标记物的量的步骤包括从所述体液中，使用与结合在作为所述标记物的糖链上的蛋白质特异性结合的物质，预先提取含有所述蛋白质和糖链的复合物。
4.一种在动物中进行的肝细胞癌的预防或治疗效果的评价方法，其特征在于，将肝细胞癌预防或治疗药物给予有必要进行肝细胞癌预防或治疗的动物后，测定从所述动物采集的体液中的权利要求1所述的肝细胞癌标记物的量，并以所述肝细胞癌标记物的量或基于所述肝细胞癌标记物的量计算出的值为指标。
5.如权利要求4所述的肝细胞癌的预防或治疗效果的评价方法，其中，所述测定权利要求1所述的肝细胞癌标记物的量的步骤包括从所述体液中，使用与结合在作为所述标记物的糖链上的蛋白质特异性结合的物质，预先提取含有所述蛋白质和糖链的复合物。
6.一种候选药物化合物的肝细胞癌的预防或治疗效果的评价方法，其特征在于，将所述候选药物化合物给予有必要进行肝细胞癌的预防或治疗的动物后，测定从所述动物采集的体液中的权利要求1所述的肝细胞癌标记物的量，并以所述肝细胞癌标记物的量或基于所述肝细胞癌标记物的量计算出的值为指标。
7.如权利要求6所述的候选药物化合物的肝细胞癌的预防或治疗效果的评价方法，其中，所述测定权利要求1所述的肝细胞癌标记物的量的步骤包括从所述体液中，使用与结合在作为所述标记物的糖链上的蛋白质特异性结合的物质，预先提取含有所述蛋白质和糖链的复合物。
8.如权利要求2-7中任一项所述的方法，其特征在于，基于所述肝细胞癌标记物的量计算出的值是使用糖链与所述肝细胞癌标记物的量的比值计算出的值，所述糖链是其在样品中的含量在健康动物与患有肝细胞癌的动物间没有显著差异的糖链。
9.一种用于肝细胞癌诊断、肝细胞癌治疗效果评价或候选药物化合物的肝细胞癌预防或治疗效果评价的试剂盒，其中，所述试剂盒含有能够测定权利要求1所述的任意肝细胞癌标记物的量的试剂。
全文摘要
本发明涉及一种使用肝细胞癌标记物来诊断肝细胞癌的方法，尤其用于肝硬化和肝细胞癌的区别诊断，该肝细胞癌标记物含有以下式(1)-(7)之任一项表示的糖链。
文档编号G01N33/574GK102576025SQ201080041579
公开日2012年7月11日 申请日期2010年9月17日 优先权日2009年9月18日
发明者东干人, 出口章广, 池中一裕 申请人:三菱化学株式会社, 国立大学法人香川大学, 大学共同利用机关法人自然科学研究机构
