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专利名称：电化学检测可卡因的方法及其中使用的三段式适配体探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物检测领域，具体涉及可卡因检测的领域，更具体地涉及利用适配体探针进行可卡因电化学检测的领域
背景技术：
目前对于毒品的检测技术虽有很多，如高效液相-紫外光谱技术、质谱技术、高效液相-电化学技术、电子鼻、电子俘获、显微拉曼技术(MRS,micro raman spectroscopy)、X射线探测技术、热中子断层扫描等。这些技术的检测灵敏度高，但检测步骤繁琐、设备昂贵，测试程序复杂，成本较高，需要专业技术人才，不适合现场快速筛查使用。针对缉毒工作的实际需求，需要开发灵敏度高、选择性好、便携式、能耗低、易操作的智能化毒品快速检测产品，以达到现场、灵敏、快速的检测目的。目前国内外正对吸毒人员快速现场筛查和液体中毒品检测的主要技术是各种基于免疫反应的产品，主要有酶免疫分析和免疫胶体金技木。前者涉及酶反应，检测步骤繁琐，试剂稳定性差，通常不能很稳保存。后者简便，快速，但误判率高，只能进行定性测试，灵敏度较低，难以进行质量控制，即使是同一批生产的试剂，也很难保证每个试剂的同一性，因此一般只能用于定性试验，不能进行定量分析。相对于抗体，适配体具有多方面的显著优点。适配体(aptamer)是新一代的非常有应用前景的功能性生物分子。适配体是从 1014的随机序列的DNA或RNA库中通过指数富集的系统分子进化方法(SystematicEvolution of Ligands by Exponentialenrichment,简称SELEX)筛选出来的，能够特异性地与祀标分子结合，从而特异性地识别靶标分子(Ellington AD, Szostak Jff (1990) Nature 346 :818-822. Tuerk C，Gold L (1990)Science249 :505-510.)。适配体可以用于包括蛋白质、小分子、重金属离子、细胞和病毒等的各种各样的生物分子的检测，具有极大的应用前景。与传统的抗体相比，适配体在多个方面具有显著的优越性(表I)。适配体稳定性高、价格低廉、不同批次产品质量完全相同，而且具有与抗体相当甚至更好的专ー性和亲和性。表I :适配体与抗体的比较
权利要求
1.用于电化学检测可卡因的三段式适配体探针，所述三段式适配体探针在特异性识别可卡因，包括具有巯基修饰的探针I、具有氧化还原基团，优选氧化还原基团亚甲基蓝修饰的探针2和未修饰的探针3，所述探针1、2和3在存在可卡因时，与可卡因形成络合物。
2.权利要求I所述的三段式适配体探针，其中所述探针1、2和3的序列分别为5’ -HS-C6-TTTGTTCTTCAAT，5’ -GGGAGTCAAGAAC-MB 和 5’ -AGTGGGACGACA，其中 MB 是氧化还原基团亚甲基蓝，HS是巯基。
3.ー种电化学检测可卡因的方法，其特征在于使用根据权利要求I或2所述的三段式适配体探针，包括以下步骤 (1)将所述探针I包被到金电极上，形成检测电极； (2)将所述探针2和所述探针3与空白对照或待测样品混合，形成空白对照混合物或待测样品混合物；和 (3)将所述检测电扱、对电极和參考电极插入到所述空白对照混合物或待测样品混合物中，进行电化学检测，当待测样品产生的电流信号大于空白对照产生的电流信号时表示所述待测样品中含有可卡因。
4.权利要求3所述的方法，其特征在于 在所述步骤(I)中，将所述金电极浸泡在含有所述探针I和还原试剂的反应缓冲溶液中；然后用去离子水冲洗电极，并浸泡在含有lmM6_mercaptohexanol的反应缓冲溶液中；电极然后用去离子水冲洗，浸泡在反应缓冲溶液中备用，其中所述探针I的量优选为5-50 u L，100 U M，所述还原试剂优选为最终浓度为5-50 y M的TCEP (tris- (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride),反应缓冲溶液优选为 IOmM, IMNaCl磷酸盐缓冲溶液。
5.权利要求3或4所述的方法，其特征在于 在所述步骤⑶中，电化学检测采用方波伏安法，其中使用钼丝作为对电扱，Ag/AgCl电极作为參考电极；方波伏安法测量的扫描电势、电势扫描梯度、振幅和频率可以根据检测结果进行优化，其中优选地，扫描电势相对于Ag/AgCl电极为从0到-0. 4V，电势扫描梯度为0. 001V，振幅0. 05V，频率60Hz ;所述反应缓冲溶液为10mM，IM NaCl磷酸盐缓冲溶液，pH7.0 ;所述探针3的浓度优选为0. 1-10 u M，所述探针2的浓度优选为0. 1-10 u M。
6.ー种电化学定量检测可卡因的方法，其特征在于使用根据权利要求I或2所述的三段式适配体探针，包括以下步骤 (1)将所述探针I包被到金电极上，形成检测电极； (2)将所述探针2和所述探针3与一系列不同浓度的可卡因标准品或未知浓度的待测样品分别混合，形成一系列不同浓度的可卡因标准品混合物和待测样品混合物； (3)将所述检测电扱、对电极和參考电极插入到步骤(2)中配制的一系列不同浓度的可卡因标准品混合物中，进行电化学检测，根据不同浓度的可卡因标准品产生电流信号的变化绘制可卡因电化学检测的标准工作曲线；和 (4)将所述检测电扱、对电极和參考电极插入步骤(2)中配制的待测样品混合物中，进行电化学检测，根据所述待测样品产生的电流信号的变化和步骤(3)中绘制的标准工作曲线确定所述待测样品中的可卡因浓度。
7.权利要求6所述的方法，其特征在于所述可卡因电化学检测的标准工作曲线满足如下关系I = 11.8661og10C+12. 303 (r2 = 0. 9984)，其中C为可卡因的摩尔浓度，单位为u M,I为电流信号的百分比变化。
8.权利要求6或7所述的方法，其特征在于 在所述步骤(I)中，将所述金电极浸泡在含有所述探针I和还原试剂的反应缓冲溶液中；然后用去离子水冲洗电极，并浸泡在含有lmM6-mercaptohexanol的反应缓冲溶液中；电极然后用去离子水冲洗，浸泡在反应缓冲溶液中备用，其中所述探针I的量优选为5-50 u L，100 U M，所述还原试剂优选为最终浓度为5-50 y M的TCEP (tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride),反应缓冲溶液优选为 IOmM, IMNaCl磷酸盐缓冲溶液。
9.权利要求6-8中任一项所述的方法,其特征在于 在所述步骤(3)和(4)中，电化学检测采用方波伏安法，其中使用钼丝作为对电扱，Ag/AgCl电极作为參考电极；方波伏安法测量的扫描电势、电势扫描梯度、振幅和频率可以根据检测结果进行优化，其中优选地，扫描电势相对于Ag/AgCl电极为从0到-0. 4V，电势扫描梯度为0. 001V,振幅0. 05V,频率60Hz ;所述反应缓冲溶液为10mM，IM NaCl磷酸盐缓冲溶液，pH 7. 0 ;所述探针3的浓度优选为0. 1-10 u M，所述探针2的浓度优选为0. 1-10 u M ;所述不同浓度的可卡因标准品的浓度优选分别为O、I ii M、10 ii M、100 ii M、1000 u M。
全文摘要
本发明提供用于电化学检测可卡因的三段式适配体探针，以及使用所述三段式适配体探针进行可卡因电化学检测的方法。所述三段式适配体探针特异性识别可卡因，包括具有巯基修饰的探针1、具有氧化还原基团亚甲基蓝修饰的探针2和未修饰的探针3。
文档编号G01N27/30GK102650612SQ20111004686
公开日2012年8月29日 申请日期2011年2月25日 优先权日2011年2月25日
发明者娄新徽 申请人:首都师范大学