专利名称：用于纯化至少一种待鉴定的靶物质的方法
技术领域：
本发明涉及用于纯化至少一种待鉴定的靶物质的方法，所述耙物质是 在培养细胞时，在细胞培养基中存在或形成的，在所述方法中，将磁性粒 子加入到所述细胞培养基中，并通过应用磁场从所述细胞培养基中选择耙 物质附着的粒子，所述磁性粒子称为珠，其表面被官能化并且所述靶物质 选择性附着在所述表面上。
现有技术
优选地使用一般方法制备分离由细胞释放到细胞培养基中的物质，从 而研究细胞特性及其进一步的生长行为。具体相关应用是研究肿瘤细胞， 其不受控的细胞生长是人类死亡最常见的原因。
为了提供抵抗在人中检测到的肿瘤的可靠治疗，需要最初确定肿瘤的 类型，例如它是非-侵入还是侵入类型的肿瘤，或是原位导管癌，等等。随 后的治疗依赖于肿瘤类型，因为肿瘤细胞进展导致肿瘤细胞性质的改变。
例如，非-侵入性癌细胞系MCF-7包含雌激素受体，因此雌激素受体抑制 剂，例如他莫昔芬能够治疗这种类型的肿瘤。在进展过程中，良性的，即 非-侵入性肿瘤细胞能够转化为恶性的，即侵入类型的细胞，其表面上不再 有雌激素受体，由此排除了激素治疗的可能性。
肿瘤进展主要由突变触发，突变又可以是由外部效应诸如缺氧(缺氧 症)引起的。除这样的事实之外，即肿瘤细胞表面特别具有经历由突变引 起的类型、作用和数量的主要改变的受体外，肿瘤细胞还改变它们与不同 调节肽和蛋白分泌有关的行为。
现代蛋白质组研究中的一种用于从血清/血浆中鉴定肿瘤标记的方法 是使用多种层析步骤，即二-维凝胶电泳和随后的质谱法。然而，目前，因 为血清/血浆中非常高度浓縮的蛋白质遮蔽标记，关于潜在标记的研究已经 中断。由于该原因，越来越多地对肿瘤细胞系进行测试。然而，这些关于肿瘤细胞的测试显示，细胞仅以极低的浓度，即10"2-10-9 M的量释放肽 和蛋白质。因为目前质谱仪的检测极限是10—9M，并且为了用质谱仪检测，
物质必须以高纯度状态存在，所以需要有效的纯化步骤，从而浓缩细胞培 养物上清液中的分析物，例如分泌的分子。
为了该原因，蛋白质组研究的注意力目前集中于预-分析以低浓度存在 的物质。然而，对少量蛋白质进行一系列不同的连续纯化步骤由于这样的 事实而导致蛋白质的严重-完全损失，所述事实是蛋白质与使用的容器壁形 成非特异性结合。当实施很多次纯化步骤时遭遇的另一个问题是样品变得 愈加被污染，并且因此使得质谱分析由于干扰信号而不能进行。为了该原 因，细胞分泌物测试仅能够对非常高的细胞计数进行。
己经发现关于起始细胞计数在107个细胞数量级，且增殖状态在包含
血清的培养基中持续数日，并随后在无血清环境中培养的实验仅生成很少
mg的总蛋白。例如，在用109个细胞的细胞计数进行的细胞培养过程完成 后，对酵母细胞的测试测量到上清液中AIP蛋白质浓度为30nM。然而，
通常不可能使用如此大量的细胞进行分析。例如，在癌细胞测试中，所述 癌细胞是通过活组织检查从肿瘤组织中切除的，每针芯样品最多能够分离 105个细胞，但是其中包含的许多细胞不是肿瘤细胞。由于分布的物质非 常低的浓度，因此在单一纯化步骤中有效地分离分泌物分子和在没有任何 中间步骤的条件下执行随后的分析程序是非常重要的。
在过去的5年中，已经尝试使用SELDI-TOF MS技术(表面增强激光 解吸附电离飞行时间质谱法)作为筛选细胞分泌的肽和蛋白质的方法。在 该方法中，将待测试的样品置于具有主要是疏水性表面的3 mn^芯片上。 随后，通过激光轰击将与芯片结合的蛋白质电离，在质谱仪中检测，并随 后显现在二维图像上。例如，该方法使不同癌细胞系能够彼此间比较。然 而，限制因素是该技术不充足的灵敏性。该系统的灵敏性极限通常是最大 300nM，且因此，目前，SELDI-TOFMS技术仍仅用于确定血清样品的特 征。
只能通过使用较小尺寸的粒子来增高灵敏性，因为这为结合蛋白提供 更大的总表面积。利用磁性粒子作为结合蛋白质和肽的载体使该过程能够 自动进行，并由此获得更大的样品通量。利用与磁性链霉抗生物素珠附着
10的生物素化的抗体示范了磁性粒子分离蛋白质的用途，所述磁性粒子也称
其为磁珠，并将其成功地用在关于获自血清的prostrate特异性抗原(PSA) 的质谱测试中。然而，当使用磁性"抗体粒子"时，每次仅能分离一种蛋 白质。
发现具有疏水性表面的粒子有利于结合来自于溶液，诸如血浆、血清、 尿液或细胞培养基的尽可能多的不同肽或蛋白质。这些粒子通过疏水性相 互作用结合蛋白质，并因此能够结合广泛范围的肽或蛋白质。因此，越来 越多地使用这种具有疏水性表面的磁性微粒子类型(RP-珠)，例如，用来脱 盐和浓缩来自血清的肽和蛋白质。现在，典型地，将这些通过该方法从不 同血清中获得的纯化的肽和蛋白质，例如，直接应用于MALDI-TOF MS 靶板，例如，从而产生肽和蛋白质的分布。
血清由大量以非常多变的浓度存在的物质组成。例如，清蛋白以mg/ml 范围内的浓度存在，而白细胞介素仅以ng/ml范围内的浓度存在。这些高 度浓缩的肽和蛋白质阻止检测以低浓度存在的肽和蛋白质，如由在细胞培 养中生长的细胞、例如肿瘤细胞释放进入细胞培养基中的那些的能力。这 种类型的调节肽和蛋白仅以非常少的量释放。
而且，通常细胞为了在细胞培养基中生长，还需要添加胎牛血清 (FCS)。在一方面，该添加剂为细胞提供需要的生长因子，但是，在另一 方面，这意味着以非常高的浓度添加了另外的蛋白质。在与疏水性磁珠结 合的过程中，这些高度浓縮的物质因此竞争结合位点，并且因此，处于低 浓度的肽和蛋白质仅与少量部分的这些结合位点结合。
因此，成功用于分析血清或血浆样品的磁珠仅适合于在有限范围内用 于在细胞培养基中，以选择性分离由肿瘤细胞释放进入细胞培养基中的调 节肽和蛋白。
发明内容
本发明的目的是开发用于纯化至少一种待鉴定和由细胞释放到细胞培 养基中的靶物质的方法，在该方法中，将具有不同官能化表面的磁性粒子， 即称它们为珠，加入到细胞培养基中，在所述细胞培养基中靶物质选择性 附着于珠表面，通过以这样的方式应用磁�。酉赴嘌醒≡袼鲋椋龇绞绞强赡芤愿慕潭鹊难≡裥裕酉赴嘌醒≡裥缘胤掷氤龈锇� 物质，所述靶物质以低量或低浓度存在于细胞培养基中。具体地，当培养
细胞，特别是肿瘤细胞时，所述纯化方法应该以耙定的方式提取以l(T12 -
10;M低浓度存在于细胞培养基中的物质，所述物质特别是由分泌过程产 生。
本发明的目的是通过权利要求1中所述的方法实现的。还通过从属权 利要求中指定的特征和能从说明书中推断而来的那些，特别是参考实施方 案，方便地开发按照该技术方案的方法。
按照本发明用于纯化至少一种由细胞培养基中的细胞，特别是肿瘤细
胞释放的待鉴定靶物质，优选是调节肽和蛋白的方法，所述方法包括(a) 利用血清替代物进行细胞培养和(b)向细胞培养基中加入磁性表面-官能 化粒子，即称其为磁珠，所述靶物质选择性附着在所述表面上，并通过应 用磁场从所述细胞培养基中选择出所述靶物质附着的粒子，并且所述方法
的特征在于下列方法步骤(用粗体表示每个主要处理步骤的关键词，以
使所述步骤易于理解)。
提供血清替代物，所述血清替代物获自天然血清并且不具有或几乎不
具有分子量低于或等于60 kDa, 30kDa，优选地低于或等于10 kDa的低分 子量物质。因此所述血清替代物的特征明确在于这样的事实，即如其他产 物一样，其对细胞生长没有不利作用，但特别不包含任何尺寸低于10kDa
的分裂物质。
原则上，动物血清可以作为天然血清使用，优选地，仅列出几种，胎 牛血清、牛或绵羊血清。也可以使用人血清。
为了制备和提供血清替代物，在一个优选的实施方案中，最初通过利 用超滤装置离心天然血清，以获得上清液，和渗透物，所述上清液称为保 留物。根据使用的过滤器尺寸，渗透物包含具有比在每种情形中使用的过 滤器孔尺寸小的粒子尺寸的物质。为了该目的，使用具有适当选择的3 kDa-100 kDa的孔尺寸或排阻界限的膜。为了获得尽可能不含微小粒子的 血清，将生长培养基加入由第一次离心过程获得的上清液中，并再次进行 离心。方便地重复该程序数次，该程序在下文称为洗涤步骤。生长培养基， 诸如Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、 IMDM、 IMEM、 ERDF、RPMI1640或缓冲液，诸如PBS、 MES、 TRIS、等可以作为洗涤溶液使用， 将所述洗涤溶液添加到在每种情形中获得的上清液中。
洗涤过程后，随即对获得的上清液或保留物进行反-离心，在该过程中， 仅将容纳所述上清液的容器倒置，并再次离心，将保留物运出离心装置， 以进一步处理，并且与各自使用的生长培养基或缓冲液混合，优选地，通 过加入足量的生长培养基来获得最初使用的体积。为了进一步纯化和灭菌 的目的，优选地通过利用0.2pm过滤器，对以上述方式获得的上清液，即 称为血清上清液，进行无菌过滤处理，并且，作为通过按照所述技术方案 的方法提供的血清替代物，所述上清液随后被分成便于使用的量，例如500 ^的等分试样，并冷冻在-20 。C一 -80 。C以便将来使用。
添加所述血清替代物到已加入了细胞的细胞培养基中，对于该过程， 上述生长基，即Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、 IMDM、 IMEM、 ERDF、 RPMI1640是适合的。添加体积份额为1-10%的血清替代物，在其 中培养细胞数日，即1-14日。随后分离细胞培养物上清液，在所述上清液 中，在培育细胞培养基、细胞和血清替代物的混合物的过程中，物质得到 浓缩，并将其转移到合适形式的容器中，即称它们为小瓶，并任选地，为 了运输或储存的目的，进行冷冻。
为了进一步处理或纯化包含在细胞培养物上清液中的物质，在需要时 解冻后，利用超滤装置离心细胞培养物上清液。在该情形中，优选使用具 有适当选择的3kDa-60kDa的孔尺寸或排阻界限的膜。随后，通过用适当
官能化的磁珠处理而纯化通过过滤获得的滤出液。
为了成功地使用本发明所述的方法，要特别提供官能化的磁性粒子、 简称珠或磁珠，其与至今可商购的珠相比，具有更高的结合能力并允许使 用新的结合物质的方法，所述方法的特征在于低浓度物质更好的浓縮。因 此，所述新型磁珠的官能化表面具有多个树状聚体，其中每个包括多至10 个分支，即10代，每个树状聚体最后一代的末端点受到修饰。 可以通过下列方法生成或形成这种类型的新型磁珠 首先，提供磁性粒子，所述磁性粒子可以以纳米或微米-规格，即一或 多nm或^n的不同粒子尺寸商购的，且在其表面上应用例如氨基。将所 述珠加入到已添加了丙烯酸甲酯的有机溶剂中，从而进一步官能化氨基珠
13表面。在优选地2-48小时的暴露时间后，从反应液中分离所述珠并用新鲜 的溶剂洗涤。随后，将以这种方法制备的珠加入到已添加了乙二胺的有机 反应液中，从而在其表面上形成第一树状聚体代(Gl-珠)。所述珠在该环
境中进一步反应2-48小时，通过搅拌反应浴促进该反应过程。随后，优选 地利用磁体，从反应液中分离珠，并再次洗涤。为了获得多种树状聚体形 成，其使以新型方式官能化的珠具有非常高的结合能力，重复上述形成第 一树状聚体代Gl的过程多至9次。
将适当处理后获得的任何树状聚体珠混悬在溶剂中，并加入活化的烷
基(d-C;。)或芳香族衍生物、单芳香族或多芳香族，从而最终用疏水性衍
生物修饰树状聚体链末端点，由此提供具有疏水性性质的珠。这些官能化
的珠因此称为树状反相珠(G1RP珠-G10RP珠)。
通过从反应混悬液中分离它们，再次洗涤它们，并将它们保存在蒸馏 水或缓冲液，诸如PBS、 MES、 TRIS等中，而提供所述珠。
为了进一步纯化和分离包含在无菌过滤的细胞培养物上清液中的物 质，包括由细胞分泌的调节肽和蛋白，将以上述方法获得的树状聚体RP 珠加入到过滤后获得的滤出液中，并还加入缓冲溶液。随后在环境温度下 进行培养过程，持续过程的持续时间为10-120分钟。在该过程中，包含在 细胞培养物上清液中的物质结合于树状聚体结构的修饰的末端点。随后， 从混合物中磁性选择磁珠，并洗脱与树状结构结合的物质，特别是由细胞 分泌的物质，具体为调节肽和蛋白。当然也可能根据磁珠的官能化，以靶 定的方式，选择另外的物质，例如代谢物、类固醇，等等。
本发明所述的纯化方法背后的核心概念基本包括2个方便协助操作的 方面，即一方面，提供细胞培养添加剂或血清替代物，其在开始时，不包 含任何小粒子尺寸的干扰物质，所述小粒子尺寸的干扰物质可以与在随后 分析程序中鉴定的实际靶物质潜在竞争，且另一方面，提供具有树状结构 和反相的新型磁珠，而所述树状结构具有多至10个分支点，且由此为了 结合待鉴定的靶物质而最优化其数量。
按照该技术方案的方法允许分离比至今常规使用的正常血清如胎牛血 清多得多的物质。例如，使用新型珠使得关于细胞培养物上清液的灵敏性 与商购珠相比，增高了 10-100倍。总之，使用所述珠和血清替代物允许获得比使用常规血清和商购获得的珠高多至1,000倍的灵敏性。 以下描述了该过程的一些具体实施方案
实施例1:制备血清替代物
(a) 通过离心并用Dulbecco's Eagle改良培养基洗涤，例如，从而胎 牛血清或人血清中，去除低-分子物质。根据需要，利用具有3kDa-100kDa 孔尺寸的过滤膜进行离心过程。进行离心过程1小时。如果需要，处理前， 可以将蛋白酶抑制剂(PMSF，EDTA,蛋白酶抑制剂，以单独抑制剂形式或 其蛋白酶混合物形式，等)加入到血清中。
(b) 将Dulbecco's Eagle改良培养基(DMEM)加入到通过离心获得的 上清液中，并再次进行离心1小时(血清纯化)。
(c) 进行离心和洗涤步骤，总共2-5次。
(d) 然后将获得的上清液反-离心到容器中，并通过添加DMEM恢复 到最初体积。
(e) 利用0.2 pm过滤器无菌过滤获得的血清代替物(也称为血清上 清液)。
(f) 将血清替代物分成500 pl的等分试样，并冷冻在-20。C，直至使用。
实施例2:生成修饰的磁珠
从所述珠的氨基表面开始，通过在每个氨基上进行支链反应而形成树 状结构。该过程基于合成星爆炸分子(starburst molecular)的原理，并且 进行直到在树状结构中形成1-10个分支，从而获得称为G1-G10珠的珠。 在该过程结束时，用不同长度的(CrC3o)烷基链通过活化的基团，特别通过 微波合成的方法，来修饰所述树状聚体珠的末端NH2基团。
(a) 提供10-2,000 mg氨基珠，并在容器中用10-100 ml MeOH洗涤它们。
(b) 将珠加入到10-100 ml MeOH中，并添加10-100 ml冷丙烯酸甲 酯。容许在环境温度下，在搅拌器中反应2-48小时。
(c) 利用磁体，从反应液中分离所述珠，并每次用10-200 ml MeOH洗涤所述珠3次。
(d) 添加10-100 ml MeOH，并逐渐添加10-lOOml冷乙二胺。容许在 室温下，随着搅拌反应2-48小时；(Gl珠)。
(e) 参见步骤(c)，即利用磁体，从反应液中分离所述珠，并每次用 10-100 ml MeOH洗涤所述珠3次。
(f) 重复步骤(b) - (e) n次，n是0-9。
(g) 每次用10-100 ml MeOH洗涤树状聚体珠3次，并每次用 10-iOOml卤代烃洗涤5次。
(h) 将树状聚体珠混悬在50-100ml卤化溶剂中，并逐滴逐渐添加 5-10ml活化的垸基衍生物，例如C,-C3。或芳香族衍生物。在环境温度下在 超声浴中，和/或通过加热到最高38。C或通过微波合成的方式，反应10-120 分钟。
(i) 每次用10-100ml MeOH洗涤修饰的树状聚体珠5次，并用 10-100ml超纯水洗涤5次。
(j)将树状聚体珠加入到超纯水中，并保存在+4。C。 备选地，代替方法步骤(h)，还可能例如通过加入抗体，在其树状聚 体链的末端点区别性地修饰树状聚体珠。为了该目的，将预处理的树状氨 基珠(G1-G10)在缓冲液中与用于氨基的双官能连接体反应。戊二醛、二 (磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯、琥珀酰亚胺基辛二酸酯、庚二亚氨酸二 甲酯(dimethyl pimelimidate)或双官能PEG连接体优选地适合作为连接 体。随后，优选地，在磷酸盐缓冲液中洗涤所述珠。最后向缓冲液中加入 浓度为1 mg/ml-50 mg/ml缓冲液的抗体。在环境温度或+4 。C下，约1-14 小时的培养时间后，洗涤具有抗体的珠，并在约+4 。C保存在缓冲液中， 以便随后使用。
实施例3:通过利用实施例1中获得的血清替代物和实施例2中修饰的磁 性粒子纯化由在细胞培养基中存在的肿瘤细胞分泌的物质
根据实验规模，将肿瘤细胞加入到处于不同容器中的Dulbecco改良的 Eagle培养基(DMEM)和获自胎牛血清(FCS)的1-10%血清替代物中， 并在37 。C和5 % C02富集下，培养数日。将细胞培养物上清液，即DMEM+ 1-10% 08血清替代物，简称CCS，倾析到预处理的小瓶中，并为了运
输的目的在-20 。C冷冻。
在利用修饰的树状聚体珠(G1-G10)进行纯化前，将解冻的CCS经 过膜过滤装置过滤。随后利用修饰的树状聚体珠(G1-G10)纯化滤出液， 并进行浓缩。这之后进行洗脱和进一步处理。
具体地
(a) 将细胞加入到DMEM和FCS上清液中，并且根据批次(体积)， 在合适的细胞培养容器中在37 。C和5 % C02培养3天。
(b) 弃去细胞培养物上清液，并每次用10ml PBS pH7.2或DMEM小 心洗涤细胞；重复洗涤程序2-5次。
(c) 加入需要量的DMEM+l-10。/。FCS血清上清液，并将细胞培养 一段需要量的时间(1-14天)。培养完成后，将CCS转移到预处理的小瓶
(lml)中，并在-20。C或-80。C冷冻。
(d) 解冻冷冻的CCS，并将每500 pl量转移到过滤装置中。
(e) 在12,000 rpm，对CCS进行离心1小时，并收集滤出液。
(f) 同时，准备珠以进行培育。将80pl修饰的树状聚体珠(G1-G10) 加入到450 jil处于pH 7.2的缓冲液中，并短时间混悬。随后利用磁体分离 所述珠。
(g) 加入450 pl处于pH 7.2的缓冲液，并混悬珠。随后加入450)il 通过离心CCS获得的滤出液，并进行上下吸移10次(完全混悬珠)。
(h) 在环境温度下培育10-120分钟。
(0磁分离后弃去溶液，并每次用500 ^缓冲液洗涤磁性树状聚体珠 (G1-G10) 3次。
(j)加入20 nl乙腈:TFA 1:1, v:v，并通过上下吸移10次混合珠溶液 (洗脱)。
(k)在环境温度下温育1-120分钟。
(1)分离磁性粒子，并随后分离洗脱溶液，以进行进一步处理。
实施例4:关于进一步测试具有靶物质的磁珠的5个备选实施例，所述具 有靶物质的磁珠通过按照所述技术方案的纯化方法获得。第一备选方案
将负载靶物质的磁珠加入到非-还原性或还原性凝胶电泳样品缓冲液
中，所述缓冲液由TRIS、尿素、硫脲、LDS、 SDS或CHAPS等组成。优 选地，将由此形成的混合物加热到60 。C达5-30分钟，由此导致靶物质 从所述珠中释放出来。随后，通过磁体，从混合物中分离磁珠，吸出剩余 含有靶物质的凝胶电泳样品缓冲液，加入到电泳凝胶(SDS凝胶、非变性 凝胶、2-D凝胶)的凝胶槽中，并随后进行电泳分离过程。
第二备选方案(仅适用于与树状聚体珠(G1-G10)偶联的抗体)
通过加入羧酸或离液序列高的高盐缓冲液，洗脱与抗体粒子结合的靶 物质。
可以縮小获自洗脱过程的羧酸洗出液的体积(速度-真空)，并再溶解 在合适的缓冲溶液中。
最后，酶消化包含在缓冲溶液中的靶物质。随后，通过多肽质量指纹 分析(PMF)或MS/MS谱，对消化的靶物质进行质谱鉴定过程。
第三备选方案
洗涤负载一种或多种靶物质的磁珠，并随后将其加入到包含用于消化 所述靶物质的蛋白酶的缓冲溶液中。随后，通过多肽质量指纹分析(PMF) 或MS/MS谱，对消化的靶物质进行质谱鉴定过程。另外，再次洗涤磁珠， 并且然后将其加入到有机溶剂和/或羧酸的混合物中，从而获得洗出液。最 后，对洗出液进行质谱测量。
第四备选方案-.
通过加入羧酸或高盐缓冲液，洗脱与抗体结合的靶物质。将树状反相 珠加入到洗出液中。持续培育l-60分钟后，由磁体分离所述珠，并随后用 缓冲液对其进行重复洗涤。然后，可能进行备选方案1中所述的关于凝胶 电泳分离的方法，或备选方案3中所述的关于生成蛋白水解肽的方法，所 述蛋白水解肽随后通过MS或MS/MS谱进行检测和显示。
18第五备选方案
根据实验，将细胞，诸如肿瘤细胞加入到不同的容器中，并在37 。C 和5 0/。CO2含量下，培养数日。随后用细胞培养基或缓冲液洗涤细胞。随
后加入无血清的细胞培养基，并再进行培养0-72小时。将各自细胞培养物 上清液转移到小瓶中，并任选地，在-20。C冷冻。通过将修饰的树状聚体
珠加入到解冻的细胞培养物上清液中，所述物质结合于所述珠。随后洗涤
珠，并如备选方案1中所讨论地，对其进行凝胶电泳，或如备选方案3中 所讨论地，用蛋白酶消化，并对消化的物质进行MS或MS/MS分析。
上述官能化磁珠本身代表这样一种产品，所述产品原则上可以用作在 大量不同应用中可能影响检测的物质。 一种可能的用途是纯化上述靶物 质。为了生成处于一般形式的该类产品，应该采用下列措施
a) 提供磁性粒子，简称珠，其具有纳米-和/或微米-规格，即一或数 nm或(im的粒子尺寸，并包括官能团，诸如应用于其表面上的氨基， b) 使所述珠在包含支化试剂诸如丙烯酸甲酯的有机溶剂中反应，
c) 从所述有机溶剂中分离所述珠，并用有机溶剂洗涤所述珠，
d) 使所述珠与包含粘合剂诸如乙二胺的有机液反应，
e) 从所述有机液中分离所述珠，并洗涤所述珠，
f) 重复步骤b) -e) n次，
g) 将所述珠混悬在包含至少一种衍生物的溶液中，和
h) 分离并洗涤所述珠，并将衍生化的珠提供在水或包含缓冲剂的溶液
中。 .
优选地，n选自0-9。醇特别适合作为反应液。为了使所述珠呈现反相
特征，通过化学基团诸如烷基(C,-C30)或芳基，或蛋白原基团衍生化所述珠。
具有10nm-10(Lim粒子尺寸的稳定磁性粒子适合作为所述珠的基本单位。
为了官能化所述珠的目的而应用于磁性粒子的基团优选地由下列基团 的至少一种物质组成伯和仲氨基，伯、仲和不对称肼，叠氮化物，磷化
氢，醛，聚醛，羧酸，羧酸酯，氰酸酯，异氰酸酯，硫氰酸酯，羟基，硫 醇，亚氨基，酰肼，哌啶，偶氮甲碱，縮氨基脲，腙，氰基溴，甲苯磺酰 基，环氧化物，氰尿酸氯和氰尿酸酯基团和二氨基、三氨基和四氨基杂环。 上述官能化磁性粒子进一步与溶剂中提供的支化试剂反应，所述支化试剂选自下列基团中至少之一
三聚氰胺，二氨基、三氨基、和四氨基杂环，三环氧化物，四环氧化 物，二烯丙基胺，丙烯酸甲酯，三丙烯酸脂，四丙烯酸脂，三(羟甲基胺)， 嗪，氧杂环丁烷和二乙醇胺。
负载支化试剂的磁性粒子随后与双官能或三官能连接体反应，所述连 接体选自下列列出的物质之一赖氨酸，二氨基垸，二氨基-、三氨基-、 四氨基杂环，二氨基乙二醇，哌嗪，烯丙胺，三环氧化物，四环氧化物， 三(羟甲基胺)。
最后，在重复前述方法步骤b)-e) n次后，用下列化学基团作为末端 基团或用任意类型的肽、蛋白质、聚糖或糖蛋白衍生化所述磁性粒子
正-垸基、仲-垸基或叔-烷基基团，未取代和取代的芳基，未取代和取 代的酰基，伯、仲和叔氨基，伯、仲和不对称肼，叠氮化物，醛，磷化氢， 聚醛，羧酸，羧酸酯，羧酸卤化物，羧酸酐，氰酸酯，异氰酸酯，硫氰酸 酯，羟基，硫醇，硫化物，亚硫酸酯，硫酸酯，亚氨基，酰肼，哌啶，偶 氮甲碱，縮氨基脲，腙，异羟肟酸，氨基腙，脒，氰基溴，甲苯磺酰基， 环氧化物，氰尿酸氯，氰尿酸酯基团，未取代和取代的碳二亚胺，N-羟基 琥珀酰亚氨酯，乙二醇，未取代和取代的芳基烷，芳基烯，杂环化合物，
单和多环化合物。在该情形中，碳的数目是2-100。
权利要求
1. 用于纯化至少一种在培养细胞时在细胞培养基中存在或形成的待鉴定靶物质的方法，在所述方法中，将磁性粒子加入到所述细胞培养基中，所述磁性粒子它们称为珠，在所述磁性粒子的表面上进行官能化且所述靶物质选择性附着于所述磁性粒子的表面，并且通过应用磁�。铀鱿赴嘌醒≡袼霭形镏矢阶诺牧Ｗ樱龇椒ㄌ卣髟谟谙铝蟹椒ú街�-提供血清替代物，所述血清替代物获自天然血清，并且不具有或几乎不具有质量小于或等于60kDa、特别是小于或等于10kDa的低分子物质，-将所述血清替代物加入到所述细胞培养基中，所述细胞培养基已包含细胞或向其中加入了细胞，-在富含血清替代物的细胞培养基中培养所述细胞，-分离至少一些在所述培养过程中形成的细胞培养物上清液，-通过超滤方法，过滤所述细胞培养物上清液，以获得保留物，-以这样的方式提供所述珠，所述方式是所述珠的官能化表面包括多个每个包含多至10个分支，即10代的树状聚体，每个树状聚体最后一代的末端点被修饰，-将所述珠和缓冲溶液加入到所述保留物中，以形成混合物，-温育包含在所述保留物中的靶物质，并使其与所述珠结合，并从所述混合物中磁性选择出所述磁珠。
2. 按照权利要求l的方法，其特征在于，在超滤来自动物或人的天然血清后，获得作为保留物的血清替代物，并且特征在于，用生长培养基或缓冲液洗涤所述保留物。
3. 按照权利要求2的方法，其特征在于，使用Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、 IMDM、 IMEM、 ERDF或RPMI1640作为所述生长培养基洗涤溶液。
4. 按照权利要求1-3中任一项的方法，其特征在于以下列方式获得和提供所述血清替代物a)利用超滤装置离心天然血清，以获得上清液和渗透物，所述上清液称其为保留物，b) 将生长培养基加入到所述保留物中，并随后按照步骤a)进行离心过程，c) 重复步骤b) n次，d) 将生长培养基加入到获得的保留物中，以获得众所周知的血清上清液，禾口e) 过滤所述血清上清液，以获得对应于所述血清替代物的渗透物。
5. 按照权利要求4的方法，其特征在于，当过滤所述血清上清液时，进行无菌过滤。
6. 按照权利要求4的方法，其特征在于，在步骤a)之前，向所述天然血清中加入至少一种可逆或不可逆的蛋白酶抑制剂。
7. 按照权利要求6的方法，其特征在于，将苯基甲基磺酰氟(PMSF)和/或乙二胺四乙酸(EDTA)和/或蛋白原抑制剂单独作为蛋白酶抑制剂加入到所述血清中，或作为蛋白酶抑制剂混合物加入到所述血清中。
8. 按照权利要求4的方法，其特征在于，步骤a)和b)中的离心过程在环境温度到低至+4 。C的温度下进行至少1小时。
9. 按照权利要求4的方法，其特征在于，重复步骤b)n次，n是2-5。
10. 按照权利要求4的方法，其特征在于，步骤e)中的过滤过程利用0.2 (am无菌过滤器进行。
11. 按照权利要求1的方法，其特征在于，在过滤前，将所述细胞培养物上清液冷冻在-20 。C 一 -80°C，特征在于，将冷冻的细胞培养物上清液解冻，并且特征在于，通过利用超滤装置的离心方式进行过滤。
12. 按照权利要求1的方法，其特征在于，当加入所述珠和所述保留物时，使用离液序列低的缓冲溶液。
13. 按照权利要求1的方法，其特征在于，在培育后和在包含在所述保留物中的靶物质结合于所述珠并且已经磁性选择所述珠后，用低盐缓冲溶液洗涤具有所述靶物质的珠，并且特征在于，随后在包含至少一种有机成分和/或酸的混合物中，从所述珠洗脱下至少一种耙物质。
14. 按照权利要求13的方法，其特征在于，使用醇或乙腈作为所述有机物质，并使用羧酸或单-、二-、三卤代羧酸作为所述酸。
15. 按照权利要求l-14中任一项的方法，其特征在于，使用Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、 IMDM、 IMEM、 ERDF或RPMI1640作为洗涤溶液。
16. 按照权利要求1-15中任一项的方法，其特征在于，当将所述血清替代物加入到所述细胞培养基中时，将1-10体积％的血清替代物加入到所述细胞培养基中。
17. 按照权利要求1-16中任一项的方法，其特征在于为了提供所述珠进行下列步骤a) 提供磁性粒子，简称珠，其具有纳米-和/或微米-规格，即一或多nm或pm的粒子尺寸，并包括应用于其表面上的氨基，b) 使所述珠在包含丙烯酸甲酯的有机溶剂中反应，c) 从所述有机溶剂中分离所述珠，并用有机溶剂洗涤所述珠，d) 使所述珠在包含乙二胺的有机液中反应，e) 从所述有机液中分离所述珠，并洗涤所述珠，f) 重复步骤b) -e) n次，g) 将所述珠混悬在包含至少一种官能化物质的溶液中，和h) 分离并洗涤所述珠，并将所述官能化的珠提供在水中。
18. 按照权利要求17的方法，其特征在于n选自0-9。
19. 按照权利要求17或权利要求18的方法，其特征在于使用醇，简写为R-OH，作为反应液，R是C,-Q。
20. 按照权利要求17-19中任一项的方法，其特征在于，在超声浴中，和/或通过加热到最高36。C，和/或通过微波合成，进行所述混悬过程。
21. 按照权利要求17-20中任一项的方法，其特征在于，使用添加了活化的烷基衍生物(C, - C3Q)的包含卤素的溶剂作为包含至少一种官能化物质的溶液，所述官能化物质是作为活性基团的卤素，特别是Cl、 Br， J，氰酸酯，异氰酸酯或异硫氰酸酯。
22. 按照权利要求17-20中任一项的方法，其特征在于，在反应步骤f)后，使所述珠与用于氨基的双官能连接体反应，特征在于，在缓冲液中洗涤所述珠，并且特征在于，使用在缓冲溶液中浓度为c = 1 pg/ml - 50 mg/ml的蛋白质，例如抗体，作为所述至少一种官能化物质。
23. 按照权利要求22的方法，其特征在于，使用戊二醛、二磺基琥珀酰亚胺基辛二酸酯(BS3)、琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DSS)、庚二亚氨酸二甲酯(DMP)或双官能PEG连接体作为双官能连接体。
24. 按照权利要求22的方法，其特征在于，使用磷酸盐或碳酸盐缓冲液作为所述洗涤缓冲液。
25. 按照权利要求1-24中任一项的方法，其特征在于，将负载至少一种靶物质的磁珠加入到凝胶电泳样品缓冲液中，特征在于，将由此形成的混合物加热到40-95 °C达5- 30分钟，特征在于，通过磁体从所述混合物中分离所述磁珠，并且特征在于，吸出剩余的凝胶电泳缓冲液，并将其加入到电泳凝胶的凝胶槽中，并进行电泳分离。
26. 按照权利要求l-24中任一项的方法，其特征在于，可以通过添加羧酸洗脱与所述珠结合的靶物质。
27. 按照权利要求26的方法，其特征在于，获自所述洗脱过程的所述羧酸洗出液的体积可以减小(速度-真空)，并再溶解到合适的缓冲溶液中。
28. 按照权利要求26或权利要求27的方法，其特征在于，所述靶物质经历酶消化，且特征在于，通过利用多肽质量指纹分析(PMF)或MS/MS谱，使消化的靶物质经历质谱鉴定过程。
29. 按照权利要求l-24中任一项的方法，其特征在于，洗涤负载所述耙物质的磁珠，并随后将其加入到包含用于消化所述靶物质的蛋白酶的缓冲溶液中。
30. 按照权利要求29的方法，其特征在于，在所述酶消化过程后，通过肽质量指纹分析(PMF)或MS/MS谱进行质谱测量。
31. 按照权利要求28或权利要求29的方法，其特征在于，洗涤所述珠，并随后将其加入到有机溶剂和/或羧酸混合物中，以获得洗出液。
32. 按照权利要求31的方法，其特征在于，对所述洗出液进行质谱测
33. 按照权利要求l-32中任一项的方法，其特征在于，通过加入羧酸或离液序列高的缓冲液洗脱至少一种与所述珠结合的靶物质，并利用磁性、树状、反相粒子结合包含在所获得的洗出液中的物质。
34. 按照权利要求33的方法，其特征在于，将负载包含在所述洗出液中的物质的所述磁性、树状、反相粒子加入到凝胶电泳样品缓冲液中，特征在于，将由此形成的混合物加热到40-95 。C达5- 30分钟，特征在于， 通过磁体从所述混合物中分离所述磁珠，并且特征在于，吸出剩余的凝胶 电泳样品缓冲液，并将其加入到电泳凝胶的凝胶槽中，并进行电泳分离过 程。
35. 按照权利要求33的方法，其特征在于，洗涤负载包含在所述洗出 液中的物质的所述磁性、树状、反相粒子，并随后将其加入到包含蛋白酶 的缓冲溶液中，所述蛋白酶用于消化与所述粒子结合的物质。
36. 由血清形成的产品，通过纯化方法从所述血清中除去低分子物质 成分，所述产品特征在于，纯化方法提供下列方法步骤a) 利用超滤装置离心天然血清，以获得上清液，和渗透物，所述上清 液称其为保留物，b) 将生长培养基加入到所述保留物中，并随后按照步骤a)进行离心 过程，c) 重复步骤b) n次，d) 将生长培养基加入到所获得的保留物中，以获得众所周知的血清上 清液，和e) 过滤所述血清上清液，以获得对应于所述血清替代物的渗透物。
37. 产品，其包括具有官能化表面并能够以下列方法生成的磁珠a) 提供磁性粒子，简称珠，其具有纳米-和/或微米-规格，即一或多 nm或pm的粒子尺寸，并包括应用于其表面上的官能团，诸如氨基基团，b) 使所述珠在包含支化试剂诸如丙烯酸甲酯的有机溶剂中反应，c) 从所述有机溶剂中分离所述珠，并用有机溶剂洗涤所述珠，d) 使所述珠与包含粘合剂诸如乙二胺的有机液反应，e) 从所述有机液中分离所述珠，并洗涤所述珠，f) 重复步骤b) -e) n次，g) 将所述珠混悬在包含至少一种衍生物的溶液中，和h) 分离并洗涤所述珠，并将所述衍生化的珠提供在水或包含缓冲剂的 溶液中。
38. 按照权利要求37的产品，其特征在于n选自0-9。
39. 按照权利要求37或权利要求38的产品，其特征在于使用醇作为 反应液。
40. 按照权利要求37-39中任一项的产品，其特征在于，所述珠通过 化学基团诸如烷基(C,-C30)或芳基，或蛋白原基团衍生化，并由此呈现反相 特性。
41. 按照权利要求37-40中任一项的产品，其特征在于，使用具有 lOnm-lO pm粒子尺寸的稳定磁性粒子作为基本单位。
42. 按照权利要求37-41中任一项的产品，其特征在于，由下列物质 基团中的至少一种物质形成应用于所述磁性粒子的基团伯和仲氨基，伯、仲和不对称肼，叠氮化物，磷化氢，醛，聚醛，羧 酸，羧酸酯，氰酸酯，异氰酸酯，硫氰酸酯，羟基，硫醇，亚氨基，酰肼， 哌啶，偶氮甲碱，缩氨基脲，腙，氰基溴，甲苯磺酰基，环氧化物，氰尿 酸氯和氰尿酸酯基团和二氨基、三氨基和四氨基杂环。
43. 按照权利要求42的产品，其特征在于，所述官能化的珠与溶剂中 提供的支化试剂反应，且特征在于，所述支化试剂选自下列基团中的至少 一种三聚氰胺，二氨基、三氨基、和四氨基杂环，三环氧化物，四环氧化 物，二烯丙基胺，丙烯酸甲酯，三丙烯酸酯，四丙烯酸酯、三(羟甲基胺)， 嗪，氧杂环丁烷和二乙醇胺。
44. 按照权利要求37-43中任一项的产品，其特征在于，负载所述支 化试剂的磁性粒子与双-或三官能连接体反应，且特征在于，所述连接体选 自下列物质列表赖氨酸，二氨基烷，二氨基-、三氨基-、四氨基杂环，二氨基乙二醇， 哌嗪，烯丙胺，三环氧化物，四环氧化物，三(羟甲基胺)。
45. 按照权利要求37-44中任一项的产品，其特征在于，在重复步骤b) -e) n次后，用下列化学基团作为末端基团或用任意类型的肽、蛋白质、 聚糖或糖蛋白衍生化所述磁性粒子正-烷基、仲-垸基或叔-垸基基团，未取代和取代的芳基，未取代和取 代的酰基，伯、仲和叔氨基，伯、仲和不对称肼，叠氮化物，醛，磷化氢， 聚醛，羧酸，羧酸酯，羧酸卣化物，羧酸酐，氰酸酯，异氰酸酯，硫氰酸酯，羟基，硫醇，硫化物，亚硫酸酯，硫酸酯，亚氨基，酰肼，哌啶，偶 氮甲碱，縮氨基脲，腙，异羟肟酸，氨基腙，脒，氰基溴，甲苯磺酰基， 环氧化物，氰尿酸氯，氰尿酸酯基团，未取代和取代的碳二亚胺，、N-羟 基琥珀酰亚氨酯，乙二醇，未取代和取代的芳基垸，芳基烯，杂环化合物， 单和多环化合物。
全文摘要
本发明公开用于纯化至少一种待鉴定的和在培养细胞时在细胞培养基中存在或形成的靶物质的方法。在所述方法中，将靶物质选择性附着于其官能化表面的磁性粒子，即珠，加入到细胞培养基中，并通过应用磁场将靶物质附着的粒子从细胞培养基中选出。所述方法的特征在于下列步骤提供血清替代物，所述血清替代物获自天然血清，并且不具有或几乎不具有最大质量为60kDa、特别是最大质量为10kDa的低分子物质；将所述血清替代物与已包含细胞或向其中加入了细胞的细胞培养基相混合；在富含血清替代物的细胞培养基中培养所述细胞；分离至少一些在所述培养过程中形成的细胞培养物上清液；通过超滤处理的方式，过滤所述细胞培养物上清液，以获得保留物；以这样的方式提供所述珠，所述方式是所述珠的官能化表面包括若干个包含多至10个分支、即10代的树状聚体，每个树状聚体最后一代的末端点受到修饰；将所述珠和所述保留物与缓冲溶液相混合，以获得混合物；培养包含在所述保留物中的靶物质，并使其与所述珠固定；并从所述混合物中磁性选择出所述磁珠。
文档编号G01N33/543GK101535808SQ200780041386
公开日2009年9月16日 申请日期2007年11月7日 优先权日2006年11月8日
发明者约亨·彼得 申请人:约亨·彼得
专业数控铣床产品供应商
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