一种云芝糖肽中单糖组分的检测方法-山东亚星游戏官网机床有限公司

专利名称：一种云芝糖肽中单糖组分的检测方法
技术领域：
本发明属于多糖组分分析领域，具体涉及一种云芝糖肽中单糖组分的检测方法。
背景技术：
云芝糖肽是从担子菌纲云芝Cov-1菌株的液体发酵菌丝体中提取得到的一种中成药，其活性成分为结合蛋白多糖，临床研究证明云芝糖肽具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、降血脂、促进受损肝细胞恢复等作用，用于食管癌、胃癌及原发性肺癌患者放、化疗所致的气阴两虚、心脾不足证。云芝糖肽是一类天然高分子有机物，其结构复杂多样。云芝糖肽国家标准WS3-228 (Z-047)-2003 (Z)中记载了多糖含量测定、蛋白含量测定等主要质控指标。其中，多糖含量测定是采用分光光度法，以葡萄糖(C6H12O6)作为多糖含量的测定指标，不得少于38.0%。可见，我们目前缺乏监控云芝糖肽中多糖组分的专属性方法。如今，市场上来源于云芝的产品较多，不仅有以云芝Cov-1菌株的菌丝体为原料制备而成的云芝糖肽，还有以其他云芝菌株菌丝体为原料的云芝胞内糖肽以及以云芝子实体为原料制备而成的云芝多糖。由于原料不同以及提取工艺的差异导致不同产品质量的巨大差异，临床疗效也各不相同，如云芝糖肽的适应症是肿瘤，云芝胞内糖肽和云芝多糖的适应症主要是肝炎。然而由于现有云芝糖肽质量标准中检测方法缺乏专属性，尚不能有效区分采用不同原料和不同工艺制备而成的多糖肽类产品。目前单糖组分色谱分离测定的方法有气相色谱法、薄层色谱法和高效液相色谱法。但是各种色谱方法均存在一定的不足之处。气相色谱法是测定单糖组分的经典方法，由于糖本身没有足够的挥发性，所以必须在色谱分析之前预先进行乙酰化或硅烷化衍生化处理，将糖转化成挥发性强的衍生物。从而导致单糖组分在衍生化过程中发生异构化，产生的异构化衍生物影响了组分的分离及定量。薄层色谱法虽然比较简单，但是由于存在灵敏度低的缺点，有些含量低的单糖不易检测出来。采用HPLC检测单糖的难点也在于单糖不具有紫外吸收的基团，因此必须先对单糖进行衍生化处理，使它带上能紫外吸收的基团，才能进行分析。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生化高效液相色谱法，曾被尝试用于云芝糖肽中单糖组分的分析，虽然采用了非常复杂的梯度洗脱法也未能实现D-木糖、D-半乳糖和D-阿拉伯糖三种单糖的有效分离。

发明内容
本发明的目的是提供一种云芝糖肽中单糖组分的检测方法，从云芝糖肽中有效分离出8种单糖组分，得出该8种单糖间的摩尔比。本发明所采用的检测方法为1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生化高效液相色谱法，通过如下步骤实现(I) HPLC色谱条件与系统适应性试验；(2)单糖组分测定，分别吸取混合对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪中分析得到色谱图，并根据各单糖分子量及其衍生物的色谱峰面积计算各单糖的摩尔比；所述对照品溶液为D-葡萄糖、D-甘露糖、D-木糖、L-岩藻糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖、D-盐酸氨基葡萄糖和L-鼠李糖对照品的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的衍生物溶液；所述供试品溶液为云芝糖肽酸水解产物的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的衍生物溶液。所述步骤(I)中的色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相是乙腈-磷酸缓冲液，其中乙腈的体积百分比为16-20%，磷酸缓冲液的浓度为O. 01-0. lmol/L,pH值为6. 8-7. 2 ;紫外检测器检测波长为250-260nm，理论塔板数按葡萄糖1_苯基_3_甲基-5-吡唑啉酮衍生物计算不得低于2000，为2000-20000。优选的，所述磷酸缓冲液的浓度为O. 03-0. 07mol/L, pH值为6. 9-7.1。所述步骤(2)中混合对照品溶液液的制备方法是，将D-葡萄糖、D-甘露糖、D-木糖、L-岩藻糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖、D-氨基葡萄糖和L-鼠李糖的对照品溶解于水；在对照品水溶液中加入NaOH溶液和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液混合并加热，糖的总量与NaOH和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的摩尔比为1:35-40 :47-55 ;冷却后在混合液中加入HCl溶液中和，HCl与所述NaOH的摩尔比为1:1 ;烘干、萃取、取水相过滤，即得混合对照品溶液。所述步骤(2)中供试品溶液的制备方法是，将研细的云芝糖肽待测样品用三氟乙酸酸解；酸解的待测样品反复经过蒸干、乙醇溶解、再蒸干三个步骤，直至无三氟乙酸酸性气味产生为止；在蒸干的样品中加入蒸馏水溶解，再加入NaOH溶液和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液混合并加热，样品与NaOH和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的加入比例为Ig 0. 1-0. 15mol :0. 1-0. 2mol ;冷却后在混合液中加入HCl溶液中和，HCl与所述NaOH的摩尔比为1:1 ;烘干、萃取、取水相过滤，即得供试品溶液。所述三氟乙酸的浓度为2-4mol/L，酸解时间为2_6小时。所述加热温度为65°C -75°C，所述烘干温度为65°C -75°C。所述步骤(2)中的萃取剂为氯仿，再加入等体积的蒸馏水，充分振�。仓梅植愫笪∩喜闼啵僦馗�3次萃取操作，最后把上层水溶液通过O. 22-0. 45 μ m的滤膜过滤。所述步骤(2)中，分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各5-20 μ L并注入高效液相色谱仪中分析得到色谱图，根据各单糖分子量及其衍生物的色谱峰面积计算各单糖的摩尔比。经过检测，云芝糖肽中的D-葡萄糖D_甘露糖D_木糖L_岩藻糖D_半乳糖D-阿拉伯糖L-鼠李糖D-氨基葡萄糖的摩尔比为1:0. 50±0. 40:0. 45±0. 35:O. 21±0· 20 :0. 21±0· 20 :0. 21±0· 20 :0. 11±0· 10 :0. 11±0· 10。本发明提供的云芝糖肽中单糖组分的检测方法，可以用于检测云芝糖肽原料药及其制剂的单糖组分分析。包括云芝糖肽的硬胶囊剂、软胶囊剂、片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、口含片剂、口崩片剂、口服液剂、颗粒剂、粉剂、丸剂、丹剂、散剂、膏剂、混悬剂、注射剂、溶液剂、喷雾剂、滴剂。本发明的有益效果是采用本发明公开的检测方法，在HPLC上实现了 D-木糖、D-半乳糖和D-阿拉伯糖衍生物的有效分离，建立了在同一色谱条件下同时检测云芝糖肽中8种单糖组分的摩尔比例；通过检测组分中各单糖组分的摩尔比来有效区分云芝糖肽、云芝胞内糖肽、云芝胞外糖肽和云芝多糖等多糖肽类产品，从而确保云芝糖肽的质量和疗效。

图1是混合对照品的高效液相色谱图。图2是实施例1的云芝糖肽供试品的高效液相色谱图。图中1、D-甘露糖，2、D-氨基葡萄糖，3、L-鼠李糖，4、D-葡萄糖，5、D-木糖，6、D-半乳糖，7、D-阿拉伯糖，8、L-岩藻糖。
具体实施例方式下面结合实施例，对本发明作进一步说明实施例1按照中国药典2010版(一部)附录VI D高效液相色谱法测定。色谱条件与系统适应性试验用Phenomenex Luna C18 (4. 6mmX250mm, 5 μ m)柱；流动相是乙腈-磷酸缓冲液，其中乙腈的体积百分比为18%，磷酸缓冲液的浓度为0. 05mol/L,磷酸缓冲液的pH值为7. 0,紫外检测器检测波长为255nm，理论塔板数按葡萄糖1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生物计算为6560。混合对照品溶液的制备精密称取经105°C干燥至恒重的D-葡萄糖、D-甘露糖、D-木糖、L-岩操糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖、D-盐酸氨基匍萄糖和L-鼠李糖对照品适量，加水配制成各单糖浓度为2mmol/L的混合对照品溶液，取250 μ L置于EP管中，加入250 μ L0. 6mol/L NaOH溶液和500 μ L O. 4mol/Ll_苯基-3-甲基_5_吡唑啉酮的甲醇溶液，70°C水浴反应I小时。冷水浴冷却IOmin后加入500 μ L 0. 3mol/L HCl中和，70°C烘干，再加入氯仿lmL，蒸馏水lmL，充分振�。仓梅植愫笪∩喜闼啵僦馗�3次萃取操作，最后把上层水溶液通过0. 22 μ m的滤膜过滤，即为混合对照品标准液。供试品溶液的制备将云芝糖肽待测样品置于碾钵中研细将云芝糖肽待测样品置于碾钵中研细，精密称定5. 0mg置于5mL安瓿中，加入ImL 3mol/L三氟乙酸并封管,在110°C条件下酸解4小时；酸解样品转移至小坩埚中蒸干，再加入5mL乙醇溶解后再蒸干，反复3次上述蒸干、溶解步骤后样品无三氟乙酸酸性气味产生；加入ImL蒸馏水，轻轻摇晃充分溶解样品，精密吸取250μ L到5mL EP管中，加入250 μ L 0. 6mol/L Na0H,500y L0. 4mol/L1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液，70°C水浴反应I小时。冷水浴冷却10min，W；v500yL 0. 3mol/L HCl中和，70°C烘干，再加入氯仿lmL，蒸馏水lmL，充分振�。仓梅植愫笪∩喜闼啵僦馗�3次萃取操作，最后把上层水溶液通过0. 22 μ m的滤膜过滤，即为供试品溶液。单糖组分测定分别精密吸取混合对照品溶液液和供试品溶液各10 μ L，注入高效液相色谱仪，根据各单糖分子量及其衍生物的色谱峰面积计算各单糖的摩尔比，结果如图1、图2。分析结果表明，云芝糖肽原料中D-葡萄糖D-甘露糖D-木糖L-岩藻糖D-半乳糖D-阿拉伯糖L-鼠李糖D-氨基葡萄糖的摩尔比为1:0. 22 :0. 19 :0. 14 :0. 09 :0. 07 0. 04 :0. 02。实施例2按照中国药典2010版(一部)附录VI D高效液相色谱法测定。色谱条件与系统适应性试验用Hypersil BDS C18 (4. 6mmX 200mm, 5 μ m)柱；流动相是乙腈-磷酸缓冲液，其中乙腈的体积百分比为16%，磷酸缓冲液的浓度为O0. 03mol/L,磷酸缓冲液的pH值为6. 9，紫外检测器检测波长为250nm，理论塔板数按葡萄糖1_苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生物计算为8308。混合对照品溶液的制备同实施例1中的混合对照品标准液的制备方法。供试品溶液的制备取10粒云芝糖肽胶囊，将其内容物倒出并置于碾钵中研细，精密称定5. Omg置于5mL安瓿中，加入ImL 4mol/L三氟乙酸并封管,在120°C条件下酸解2小时；酸解样品转移至小坩埚中蒸干，再加入5mL乙醇溶解后再蒸干，反复3次上述蒸干、溶解步骤后样品无三氟乙酸酸性气味产生；加入ImL蒸馏水，轻轻摇晃充分溶解样品，精密吸取 250 μ L 到 5mL EP 管中，加入 250 μ L O. 5mol/L Na0H、500yL O. 25mol/L1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液，70°C水浴反应I小时后冷水浴冷却lOmin，加入500 μ L O. 25mol/L HCl中和，70°C烘干，再加入氯仿lmL，蒸馏水lmL，充分振�。仓梅植愫笪∩喜闼啵僦馗�3次萃取操作，最后把上层水溶液通过O. 45 μ m的滤膜过滤，即为供试品溶液。单糖组分测定分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各10 μ L，注入高效液相色谱仪，根据各单糖分子量及其衍生物的色谱峰面积计算各单糖的摩尔比。分析结果表明，云芝糖肽胶囊中D-葡萄糖D-甘露糖D-木糖L-岩藻糖D-半乳糖D-阿拉伯糖L-鼠李糖D-氨基葡萄糖的摩尔比为1:0. 28 :0. 19 :0. 13 :0. 11 :0. 09 :0. 07 :0. 03。实施例3按照中国药典2010版(一部)附录VI D高效液相色谱法测定。色谱条件与系统适应性试验用Phenomenex Gemini C18 (4. 6mmX 250mm, 5 μ m)柱；流动相是乙腈-磷酸缓冲液，其中乙腈的体积百分含量为20%，磷酸缓冲液的浓度为O. 07mo 1/L，磷酸缓冲液的pH值为7. 1，紫外检测器检测波长为260nm，理论塔板数按葡萄糖1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生物计算为12310。混合对照品溶液的制备同实施例1中的混合对照品标准液的制备方法。供试品溶液的制备取10片云芝糖肽片置于碾钵中研细，精密称定5. Omg置于5mL安瓿中，加入ImL 2mol/L三氟乙酸并封管，在110°C条件下酸解6小时；酸解样品转移至小坩埚中蒸干，再加入5mL乙醇溶解后再蒸干，反复3次上述蒸干、溶解步骤后样品无三氟乙酸酸性气味产生；加入ImL蒸馏水，轻轻摇晃充分溶解样品，精密吸取250 yL到5mL EP管中，加入250 μ L O. 75mol/L Na0H、500yL O. 5mol/Ll-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液，70°C水浴反应I小时后冷水浴冷却10min，WA500yL O. 375mol/L HCl中和，70°C烘干，再加入氯仿lmL，蒸馏水lmL，充分振�。仓梅植愫笪∩喜闼啵僦馗�3次萃取操作，最后把上层水溶液通过O. 45 μ m的滤膜过滤，即为供试品溶液。单糖组分测定分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各10 μ L，注入高效液相色谱仪，根据各单糖分子量及其衍生物的色谱峰面积计算各单糖的摩尔比。分析结果表明，云芝糖肽片剂中D-葡萄糖D-甘露糖D-木糖L-岩藻糖D-半乳糖D-阿拉伯糖L-鼠李糖D-氨基葡萄糖的摩尔比为1:0. 38 :0. 09 :0. 08 :0. 07 :0. 08 :0. 10 :0. 04。
权利要求
1.一种云芝糖肽中单糖组分的检测方法，其特征在于所述检测方法为1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生化高效液相色谱法，其步骤包括(1)HPLC色谱条件与系统适应性试验；(2)单糖组分测定，分别吸取混合对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪中分析得到色谱图，并根据各单糖分子量及其衍生物色谱峰面积计算各单糖的摩尔比；所述对照品溶液为D-葡萄糖、D-甘露糖、D-木糖、L-岩藻糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖、D-盐酸氨基葡萄糖和L-鼠李糖对照品的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的衍生物溶液；所述供试品溶液为云芝糖肽酸水解产物的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的衍生物溶液。
2.根据权利要求1所述的一种云芝糖肽中单糖组分的检测方法，其特征在于所述步骤(I)中的色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相是乙腈-磷酸缓冲液，其中乙腈的体积百分比为16-20%，磷酸缓冲液的浓度为O. 01-0. lmol/L，pH值为6. 8-7. 2 ;紫外检测器检测波长为250-260nm,理论塔板数按葡萄糖1-苯基-3-甲基-5-卩比唑啉酮衍生物计算不得低于2000。
3.根据权利要求2所述的一种云芝糖肽中单糖组分的检测方法，其特征在于所述磷酸缓冲液的浓度为O. 03-0. 07mol/L, PH值为6. 9-7.1。
4.根据权利要求1所述的一种云芝糖肽中单糖组分的检测方法，其特征在于所述步骤(2)中混合对照品溶液的制备方法是，将D-匍萄糖、D-甘露糖、D-木糖、L-岩操糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖、D-盐酸氨基葡萄糖和L-鼠李糖的对照品溶解于水；在对照品水溶液中加入NaOH溶液和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液混合并加热，糖的总量与NaOH 和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的摩尔比为1:35-40 47-55 ;冷却后在混合液中加入HCl 溶液中和，HCl与所述NaOH的摩尔比为1:1 ;烘干、萃取、取水相过滤，即得混合对照品溶液。
5.根据权利要求1所述的一种云芝糖肽中单糖组分的检测方法，其特征在于所述步骤(2)中供试品溶液的制备方法是，将研细的云芝糖肽待测样品用三氟乙酸酸解；酸解的待测样品反复经过蒸干、乙醇溶解、再蒸干三个步骤，直至无三氟乙酸酸性气味产生为止；在蒸干的样品中加入蒸馏水溶解，再加入NaOH溶液和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液混合并加热，样品与NaOH和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的加入比例为Ig O.1-0. 15mol 0. 1-0. 2mol ;冷却后在混合液中加入HCl溶液中和，HCl与所述NaOH的摩尔比为1:1;烘干、萃取、取水相过滤，即得供试品溶液。
6.根据权利要求5所述的一种云芝糖肽中单糖组分的检测方法，其特征在于所述三氟乙酸的浓度为2-4mol/L，酸解时间为2-6小时。
7.根据权利要求4或5所述的一种云芝糖肽中单糖组分的检测方法，其特征在于所述萃取液通过滤膜过滤，滤膜的孔径为O. 22-0. 45 μ m。
8.根据权利要求4或5所述的一种云芝糖肽中单糖组分的检测方法，其特征在于所述加热温度为65°C _75°C，所述烘干温度为65°C —75V。
全文摘要
本发明属于多糖组分分析领域，具体涉及一种云芝糖肽中单糖组分的检测方法，进行HPLC色谱条件与系统适应性试验，然后分别吸取混合对照品溶液和供试品溶液注入HPLC色谱仪中分析得到色谱图；所述对照品溶液为D-葡萄糖、D-甘露糖、D-木糖、L-岩藻糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖、D-盐酸氨基葡萄糖和L-鼠李糖对照品的1苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生物溶液；所述供试品溶液为云芝糖肽酸水解产物的1苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的衍生物溶液，通过检测供试品中8种单糖组分的摩尔比来有效区分云芝糖肽、云芝胞内糖肽、云芝胞外糖肽和云芝多糖等多糖肽类产品，从而确保云芝糖肽的质量和疗效。
文档编号G01N30/06GK103018352SQ20121037690
公开日2013年4月3日申请日期2012年9月28日优先权日2012年9月28日
发明者袁萍, 茅仁刚, 叶晓平, 陈浙江, 林东昊, 金丹凤, 吕丹申请人:上海师范大学, 上海新康制药厂

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一种云芝糖肽中单糖组分的检测方法