专利名称：：非接触式基因扩增电化学快速检测方法
技术领域：
：本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种非接触式基因扩增电化学快速检测方法。
背景技术：
：对于基因扩增来说，反应产物是否特异性，其结果是否准确可靠，有赖于严格的分析与鉴定技术。就目前来讲，扩增产物与扩增进程的检测/监测与分析技术，可分为以下几种I.电泳法[见文献IhiraM,YoshikawaT,EnomotoY,AkimotoS，OhashiM,SugaS，NishimuraN,OzakiTjNishiyamaY，NotomiTjOhtaY，AsanoY:RapidDiagnosisofHumanHerpesvirus6InfectionbyaNovelDNAAmplificationMethod,Loop-MediatedIsothermalAmplification,J.Clin.Microbiol.2004，42(I)，140-145]。包括琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳及与之相关的酶切-凝胶电泳等。本方法具有使用仪器简单、结果易于判定的优点，但缺点也显而易见——如染料(特别是有毒染料)的使用、周期长、过程污染风险、定量效果差等。尤其是，囿于其根本工作原理，即使改良后的该方法[见文献Y.HataokajLZhangjY.MorijN.TomitajT.NotomijY.BabajAnalysisofspecificgenebyintegrationofisothermalamplificationandelectrophoresisonpoly(methylmethacrylate)microchips,Anal.Chem.2004，76，3689-3693]也只能用作反应终点分析。2.杂交法。基于目测杂交结果的印迹杂交法和斑点杂交法，虽然方法简单、设备廉价，但也存在和电泳法相同的缺点染料的使用、周期长、过程污染风险、定量效果差、只能终点分析等。基于生物传感器[见文献W.SunjP.QinjH.GaojG.Li，K.Jiao,ElectrochemicalDNAbiosensorbasedonchitosan/nano-V205/MWCNTscompositefilmmodifiedcarbonionicliquidelectrodeanditsapplicationtotheLAMPproductofYersiniaenterocoliticagenesequence,Biosens.Bioelectron.2010，25，1264-1270；X.LuojI.-M.HsingjElectrochemicaltechniquesonsequence-specificPCRampIicondetectionforpoint—of—careapplications,Analyst,2009,134,1957-1964;孙伟，高宏伟，钟江华，覃鹏，焦奎，环介导等温扩增-纳米硫化镉标记电化学检测单增李斯特菌的方法，专利公开号101260424;AhmedMjHasanQ，HossainMjSaitoMjTamiyaE:MeatspeciesidentificationbasedontheloopmediatedisothermalamplificationandelectrochemicalDNAsensor,FoodControl,2010，21，599-605]和基因芯片[见文献Nakamura,N.;FukudajΤ·;NonenjS.;HashimotojK.;AzumajJ.;Gemma,N.SimpleandaccuratedeterminationofCYP2D6genecopynumberbyaloop-mediatedisothermalamplificationmethodandanelectrochemicalDNAchip,Clin.Chim.Acta2010，411，568-573;S.-J.Park,T.A.TatonjC.A.MirkinjArray-basedelectricaldetectionofDNAwithnanoparticleprobes,Science,295，1503-1506;H.J.An,N.H.ChojS.Y.Lee,I.H.KimjC.Lee,S.J.KimjM.S.MunjS.H.KimjJ.K.JeongjCorrelationofcervicalcarcinomaandprecancerouslesionswithhumanpapillomavirus(HPV)genotypesdetectedwiththeHPVDNAchipmicroarraymethod,Cancer,2003，97(7)1672-1680;X.Fang,Y.LiujJ.Kong,X.Jiang.Loop-mediatedisothermalamplificationintegratedonmicrofluidicchipsforpoint-of-carequantitativedetectionofpathogens，Anal.Chem.2010，82，3002-3006]的杂交法，解决了染料使用问题，而且结果易于自动化输出，但存在制备繁琐、污染风险大、成本高的缺点。3.核酸序列分析法。本方法是检测扩增产物特异性的最可靠方法，但费用高、周期长，仪器昂贵，因而难以在通常检测中推广。4.同位素标记法。结合质谱仪，同位素标记可以精确给出扩增产物中核苷的组成[见文献XianChen,Z.Fei,L.M.Smith,E.M.Bradbury,V.Majidi，Stable-isotope-assistedMALDI-TOFmassspectrometryforaccuratedeterminationofnucleotidecompositionsofPCRproducts,Anal.Chem.1999，71(15),3118-3125]，但所需仪器昂贵，核污染处理费用高。5.肉眼直接观察法。对于一些产物量较大的扩增反应，可以通过肉眼直接观察副产物沉淀的生成来判断结果[见文献EnosawaM,KageyamaS，SawaiK,WatanabeK,NotomiT,OnoeS，MoriY,YokomizoY:Useofloop-mediatedisothermalamplificationoftheIS900sequenceforrapiddetectionofculturedMycobacteriumaviumsubsp.Paratuberculosis,J.Clin.Microbiol.2003,41,4359-4365]，或滴加显色剂后观察颜色变化[见文献ZhangQ,ShiC，HuangJ,JiaK,ChenX,LiuH:Rapiddiagnosisofturbotreddishbodyiridovirusinturbotusingtheloop-mediatedisothermalamplificationmethod,J.Virol.Meth.2009,158,18-23]。该方法简单快捷，但主观误差不可避免，且不能定量。6.光学仪器方法。一是利用突光标记信号[专利L.Stuyver,G.A.Snellvile,M.J.Otto,G.A.Lilburn.Simultaneousquantificationofnucleicacidsindiseasedcells,US2009/0220950A1;专利缪金明，一种新型荧光定量PCR检测技术，公开号101033486;文献C.Farrugia,0.Cabaret,F.Botterel,C.Bories,F.Foulet,J.-M.Costa,S.Bretagne.CytochromebgenequantitativePCRfordiagnosingplasmodiumfalciparuminfectionintravelers,J.Clin.Microbiol.，2011，49(6)，2191-2195],二是通过池度仪测定副产物沉淀来表征扩增进程与结果[见文献MoriY,KitaoM,TomitaN,NotomiT:Real-timeturbidimetryofLAMPreactionforquantifyingtemplateDNA,J.Biochem.Biophys.Methods.2004,59，145-157]。光学方法有效避免了产物污染环境的可能性，使得实时监控扩增反应进程及精确定量分析成为可能，但依然存在不可忽视弊端对各相关试剂溶液及器皿的透明度都有苛刻要求；光学设备昂贵；需要光/电转换装置才能方便地自动输出结果；使用探针将明显增加操作成本。目前的各种方法虽然能够在一定方向、一定范围内完成扩增反应的结果分析或过程监测，但就低成本化、高通量、自动化与小型化等方面，还不够理想。
发明内容为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种非接触式基因扩增电化学快速检测方法，用于基因扩增过程监测与结果分析，通过电容耦合非接触式电导传感器测定扩增反应液离子强度变化，结合反应时间因素，简便、快速、自动化、低成本地给出样品DNA或RNA中目的基因片段的定性、定量信息。本发明提供的一种非接触式基因扩增电化学快速检测方法，包括以下步骤(I)针对目的基因序列设计特异性引物，并将引物与相应的基因扩增反应试剂混合，封装入非导体材质反应管中；优选的非导体材质为玻璃、石英或塑料等。(2)将反应管置入单通道或多通道电容耦合非接触式电导传感器腔体，传感器置于恒温或变温扩增反应温控单元；(3)计算机控制激励信号输出与电导率值采集；(4)利用Office软件对取得的电导率变化值、反应时间及初始模板DNA或RNA含量三者间的关系进行计算，拟合出工作曲线或函数方程；(5)取样品液，与相应的基因扩增反应试剂混合，封装入反应管中，重复步骤(2)-(3)，将测得电导率变化值与反应时间参数代入工作曲线或函数方程，进而对样品液中目的基因进行定性判断或定量推算。上述方法中对电学信号检测时，参与扩增反应的成分及其产物被体系的包装物完全封闭，检测器件不与参与扩增反应体系的成分及其产物发生直接接触。本发明与已有技术对比具有以下特点I、与光学方法相比，电导检测法从本质上具有内在的优越性——得到的是电信号，不需要转换装置即可以直接输出，因而仪器简单，便于自动化、微型化和集成化。2、扩增过程与结果分析全封闭，无需扩增反应后处理，彻底解决污染问题。3、无需光学、电学、生物学探针或指示剂，不但应用成本低，而且消除健康�：Ψ缦铡�4、具有即时响应效果。对样品扩增的整个过程进行实时监控，扩增与分析同时进行，能够实时地观察到产物的增加，直观地看到反应的对数期。5、对所有试剂、反应物、生成物及反应容器的透明度没有要求，可以直接以菌悬液等为模板。6、检测�？榧虻チ郏寤。芎牡停诵谐杀炯汀Ｍ糏、本发明所使用的系统装置示意图；图2、本发明中各模板浓度下电导率值变化值与反应时间函数关系图。具体实施例方式下面通过实施例来详细叙述本发明的技术方法(本发明不限于实例)。本发明所使用的系统如图I所示，由生化反应体系、温控系统、电容耦合非接触式电导传感器与信号处理器(例如，软件CES2008)四个部分组成。按以下技术方案实现目的基因的定量检测I、针对目的基因序列设计特异性引物，并将引物与相应的基因扩增反应试剂混合、封装入玻璃、石英、塑料等非导电材质反应管中。2、将反应管置入单通道或多通道电容耦合非接触式电导传感器腔体，传感器置于温控单元中。传感器结构如图I所示，中间空腔尺寸刚好可以插入长柱状反应管。恒温扩增反应温控单元可以由普通水浴锅、金属浴池等常见装置实现。3、计算机应用软件进行控制激励信号输出与电导率值采集。电容耦合非接触式传感器中生化反应管内溶液电导率值的实时在线采集由软件自动完成并输出，然后应用Office软件对获得数据进行处理。此外，也可以人工从CES2008-C4/⑶-IB型电导检测器数字显示屏读出电导值数据并处理。4、利用Office软件对取得的电导率变化值、反应时间及初始模板DNA或RNA含量三者间的关系进行计算，拟合出工作曲线(或函数方程)。或者人工计算/绘制得到工作曲线(或函数方程)。5、将目标生化反应液测得电导率变化值与反应时间参数代入工作曲线(或函数方程)，得到扩增反应进程状况与扩增产物数量，进而对初始模板中目的基因进行定性判断与定量推算。实施例对虾白班综合征病毒衣壳蛋白VP37基因快速定量检测步骤一、搜索GenBank，筛选对虾白班综合征病毒衣壳蛋白VP37基因序列的保守区段，通过Primer5.O设计可检测VP37基因的外引物I、外引物2、内引物I、内引物2，如下外引物I:5，-atcaaaggcctttgtcggt-3’(SEQIDNO1)外引物2:5，-ggtctcagtgccagagtagg-3，(SEQIDNO2)内引物1:5，_accacacacaaaggtgccaacti:t1:tagctccaacacctcctcc-3’(SEQIDNO:3)内引物2:5，-accacctttggcgcaccaatttttcgtgcacgtacatgtcga-3，(SEQIDNO:4)步骤二、配制标准反应液，反应体系如下内引物I和2各1.6μM，外引物I和2各O.2μM，dATP、dGTP、dTTP和dCTP各I.4mM,MgCl26mM,Betaine1M,Tris-HCl20mM,KClIOmM,MgS042mM,(NH4)2SO4IOmM,TritonX-1000·1%,IμLDNA聚合酶(8U/μL)。然后向每个反应体系中分别添加浓度为O、10°、IO1UO2'103、IO4、105、IO6、107、IO8拷贝的含有VP37基因的质粒作为模板，分别装入玻璃反应管，用灭菌水补充不足部分，使每份终体积为25μL，密封。步骤三、将玻璃反应管分别置入各电容耦合非接触式电导传感器腔体内，控温64。C0步骤四、计算机应用软件CES2008控制开启电容耦合非接触式传感器，实时在线采集、记录(频率1次/30s)各反应管中电导率值并转换成电压值输出。步骤五、应用MicrosoftExcel软件统计并计算各模板浓度下电导率值变化值与反应时间函数关系并输出。电导率值变化值计算公式S。(HiV)=Stl-S”其中Stl为Os时测得反应液电导率值，Si为第i分钟时测得反应液电导率值。结果如图2所示。步骤六、常规方法提取待测对虾样品的DNA。从步骤二开始，以待测样品DNA代替已知浓度模板DNA进行扩增。测得扩增溶液S。与反应时间之间的关系曲线位于IO5与IO6拷贝模板与反应时间之间的关系曲线之间，说明单位该待测样品质粒中含有VP37基因的拷贝数在IO5IO6个范围内。权利要求1.一种非接触式基因扩增电化学快速检测方法，其特征在于包括以下步骤(1)针对目的基因序列设计特异性引物，并将引物与相应的基因扩增反应试剂混合，封装入非导体材质反应管中；(2)将反应管置入单通道或多通道电容耦合非接触式电导传感器腔体，传感器置于恒温或变温扩增反应温控单元；(3)计算机控制激励信号输出与电导率值采集；(4)利用Office软件对取得的电导率变化值、反应时间及初始模板DNA或RNA含量三者间的关系进行计算，拟合出工作曲线或函数方程；(5)取样品液，与相应的基因扩增反应试剂混合，封装入反应管中，重复步骤(2)-(3)，将测得电导率变化值与反应时间参数代入工作曲线或函数方程，进而对样品液中目的基因进行定性判断或定量推算。2.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述的非导体材质为玻璃、石英或塑料。3.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于所述的方法中对电学信号检测时，参与扩增反应的成分及其产物被体系的包装物完全封闭，检测器件不与参与扩增反应体系的成分及其产物发生直接接触。全文摘要本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种非接触式基因扩增电化学快速检测方法，用于基因扩增过程监测与结果分析，通过电容耦合非接触式电导传感器测定扩增反应液离子强度变化，结合反应时间因素，简便、快速、自动化、低成本地给出样品DNA或RNA中目的基因片段的定性、定量信息。文档编号G01N27/26GK102888454SQ20121033087公开日2013年1月23日申请日期2012年9月7日优先权日2011年9月13日发明者张旭志,崔毅,曲克明,马绍赛,张庆利申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所
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