专利名称：肺腺癌的预后预测方法、肺腺癌的检测试剂盒以及用于治疗肺腺癌的医药组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种肺腺癌的预后预测方法、肺腺癌的检测试剂盒以及用于治疗肺腺癌的医药组合物。
背景技术：
肺腺癌的临床病期I期为没有发现向原发性以外的部位扩散的早期病变。在现行的分类中，I期肺腺癌进一步分为IA期(肿瘤直径不到3cm)和IB期(肿瘤直径为3cm以上)。在非专利文献I中报告有，肺腺癌的临床病期I期的术后五年生存率为85%，术后化学治疗法(替加氟尿嘧啶(UFT) 二年内服)对I期中的预后的改善作有意义地贡献。现在，相对于I期肺腺癌症病例虽然推荐进行术后化学治疗法，但是并不是I期肺腺癌的全体都可以通过术后化学治疗法获益。因此，可以认为如果能够进行I期的术后预后预测，对预后 良好的患者群就可以减轻进行不必要的化学治疗法的风险。在这里，α -辅肌动蛋白-4是一种作为参与癌细胞的浸润、扩散的肌动蛋白结合蛋白而被分离的分子(参照非专利文献2)。另外，也报告有α-辅肌动蛋白-4蛋白质的表达参与细胞运动和浸润性(参照非专利文献3)。现有技术文献非专利文献I Kato H. et al. , N. Engl. J. Med.，2004 Apr 22 ；350(17) :1713-21非专利文献2 Honda et al.，J Cell Biol. 1998 Mar 23 ；140 (6) :1383-93非专利文献3 :Honda et al. , Gastroenterology. 2005 Jan ；128 (I) :51_62。
发明内容
发明所要解决的问题本发明者们发现1期肺腺癌组织中的α -辅肌动蛋白_4(ACTN4)蛋白质表达增强的病例，与并非如此的病例相比，具有统计学上的有意义差且总生存期(OS)短。另外，本发明者们发现1期肺腺癌组织的细胞中的α-辅肌动蛋白-4基因(ACTN4)的基因组上的复制数增加了的群，与非增加群相比OS短。进一步，本发明者们发现通过ACTN4基因的基因组的复制数和α-辅肌动蛋白-4蛋白质表达水平的组合，与基因复制数或者蛋白质表达各自的单独解析相比，可以精密地预测I期肺腺癌的OS。本发明是基于这些见解而完成的发明。因此，本发明的目的在于提供一种肺腺癌的预后预测方法、肺腺癌的检测试剂盒以及用于肺腺癌治疗的医药组合物。解决问题的手段根据本发明第一方式的肺腺癌的预后预测方法，是通过检测在哺乳动物中的预后不良的I期肺腺癌来预测预后的预后预测方法，其特征在于，
包括测定由所述哺乳动物得到的I期肺腺癌组织的细胞中的α -辅肌动蛋白-4基因(ACTN4)的复制数的步骤，当所述基因的复制数超过4时，预测来自所述哺乳动物的I期肺腺癌为预后不良的I期肺腺癌。根据本发明第二方式的肺腺癌的检测试剂盒，是用于检测在哺乳动物中的预后不良的I期肺腺癌的检测试剂盒，其特征在于，含有能够测定细胞中的ACTN4基因的复制数的试剂而成。根据本发明第三方式的肺腺癌的预后预测方法，是通过检测在哺乳动物中的预后不良的I期肺腺癌来预测预后的预后预测方法，其特征在于，包括以下步骤 步骤(a)在由所述哺乳动物而得到的I期肺腺癌的组织或者细胞中，测定ACTN4基因表达量；以及步骤(b)将步骤(a)得到的表达量与对应的正常组织或者细胞中的ACTN4基因表达量相比较，相对于所述正常组织或者细胞，当所述I期肺腺癌的组织或者细胞中的所述基因表达增强时，预测来自所述哺乳动物的I期肺腺癌为预后不良的I期肺腺癌。根据本发明第四方式的肺腺癌的检测试剂盒，是用于检测在哺乳动物中的预后不良的I期肺腺癌的检测试剂盒，其特征在于，含有能够测定组织或者细胞内的ACTN4基因表达量的试剂。根据本发明第五方式的用于治疗肺腺癌的医药组合物，其特征在于，含有α -辅肌动蛋白-4抑制剂和医药上允许的载体而成。根据本发明第六方式的肺腺癌的检测试剂盒，是用于测定人体细胞中的ACTN4基因的复制数的检测试剂盒，其特征在于，含有可利用于FISH法中的、对基因组上的所述基因具有特异性的探针而成，该特异性探针由人体第19号染色体上第43. 81Mb 第44. 02Mb区域的核苷酸序列构成。发明效果根据本发明，可以预测I期肺腺癌的预后，选择适宜的治疗方法。例如，在本发明中，当判断该I期肺腺癌为预后不良时，推荐在其摘出手术后进行使用了替加氟 尿嘧啶混合剂、顺钼等药剂的化学治疗法。而另一方面，在本发明中判断该I期肺腺癌为非预后不良时，可以避开不必要的化学治疗法。进一步，根据本发明提供治疗I期肺腺癌、例如预后不良的I期肺腺癌的方法。
图I为显示对于在肺腺癌组织(I期和IA期)(队列I)中α -辅肌动蛋白_4蛋白质表达亢进的阳性病例和阴性病例的2群根据Kaplan-Meier法而绘制的生存曲线图。图2为显示对于在肺腺癌组织(I期和IA期)(队列2)中的α -辅肌动蛋白_4蛋白质表达亢进的阳性病例和阴性病例的2群根据KapIan-Meier法而绘制的生存曲线图。图3为，将I期肺腺癌患者分为接下来的3群血清CEA5ng/mL以下且辅肌动蛋白-4阴性的群；血清CEA超过5ng/mL或者α -辅肌动蛋白_4蛋白质阳性的群；以及血清CEA超过5ng/mL且α-辅肌动蛋白-4蛋白质阳性的群,显示对于各群根据Kaplan-Meier法而绘制的生存曲线图。图4为将I期肺腺癌患者分为接下来的3群ACTN4扩增(-)且辅肌动蛋白_4蛋白质表达阴性的群；ACTN4基因扩增(_)且α-辅肌动蛋白-4蛋白质表达阳性的群；以及ACTN4基因扩增(+)且α-辅肌动蛋白-4蛋白质表达阳性的群，显示在各自的群中的根据Kaplan-Meier法而绘制的生存曲线图。图5为显示因免疫组织化学染色的表达状态的肺腺癌细胞的显微镜照片。图6为显示对于在肺腺癌组织(I III期和I期)(队列I和2)中的α -辅肌动蛋白-4蛋白质表达亢进的阳性病例和阴性病例的2群根据Kaplan-Meier法而绘制的生存曲线图。图7为通过荧光原位杂交(FISH)法标识的肺腺癌细胞的显微镜照片。·
图8为，显示对于在肺腺癌组织(I期)中的组织微阵列的阳性病例和阴性病例的2群根据Kaplan-Meier法而绘制的生存曲线图。图9为显示对于在肺腺癌组织(I期和IA期)(队列I和2)中的、α -辅肌动蛋白-4蛋白质表达亢进、以及组织微阵列的阳性病例和阴性病例的群根据Kaplan-Meier法而绘制的生存曲线图。
具体实施例方式成为本发明对象的癌是I期肺腺癌。肺癌大致分为非小细胞癌和小细胞癌。肺腺癌分类在非小细胞癌中。I期肺腺癌是肺腺癌中的最早期的癌，为还没有向淋巴结或其它的内脏器官转移的肺腺癌。根据由本发明的方法，可以判断哺乳动物所患的I期肺腺癌是否为预后不良。另外，本发明中的治疗对象为I期肺腺癌，优选为预后不良的I期肺腺癌。在其它的优选实施方式中，本发明中的治疗对象为在其癌细胞中发现了 ACTN4基因的扩增或表达增强的I期肺腺癌，特别是根据本发明的预后预测方法而被判断为预后不良的I期肺腺癌。在本说明书中，「预后不良」的用语意味着，例如，在癌的切除5年后中的生存率不到90%，优选为不到85%，更优选为不到70%，最优选为不到60 %。另外，本说明书中「预后不良」是指，癌的切除后需要化学治疗法。因此，根据本发明的其它方式，本发明的方法为检测在哺乳动物中需要术后的化学治疗法的I期肺腺癌的方法，或者判断I期肺腺癌的患者是否需要术后的化学治疗法的方法。在本发明中，作为预测(诊断)的标的物、成为治疗的标的的「α-辅肌动蛋白_4」或者「ACTN4」可以是来自成为诊断或者治疗被检物的哺乳动物的α -辅肌动蛋白-4(ACTN4基因产物)。ACTN4基因的序列以及由其编码的氨基酸序列为在本领域公知的，可以举出例如，序列号 I 以及序列号 2 (Ensembl ID ENSG00000130402 以及 ENST00000252699)所示的来自人体的ACTN4序列。另外,来自人体的ACTN4序列也登录在NCBI中(Naional Centerfor Biotechnology Information)登录号NM_004924 和 NP_004915。另外，ACTN4 基因的基因座也为本领域公知的，例如，人体的ACTN4基因是位于第19染色体的第43，830，167 43，913，010碱基。对于人体以外的哺乳动物，可以利用与来自人体的ACTN4对应的同样的基因以及蛋白质。
在本说明书中，ACTN4基因的扩增(基因组上的复制数增加)以及作为其转录产物的α-辅肌动蛋白-4蛋白质的表达增强被证实为I期肺腺癌的预后不良因素。进一步，在癌细胞内的ACTN4基因的扩增与蛋白质的表达增强的组合，与各自单独的预后预测I期肺腺癌的预后相比被证实为能更严密地预测预后的预后不良因素。因此，通过调查由成为被检物的哺乳动物(人体或者除了人体以外的哺乳动物)而得到的I期肺腺癌组织的细胞中的ACTN4基因的复制数，能够预测(诊断)该I期肺腺癌是否为预后不良。另外，通过调查由所述哺乳动物而得到的I期肺腺癌的组织或者细胞中的α -辅肌动蛋白-4蛋白质的表达增强，能够预测(诊断)该I期肺腺癌是否为预后不良。成为诊断对象的I期肺腺癌的组织或者细胞可以是来自患者的由外科手术而被摘出的手术样品，也可以是由内视镜等而得到的生检样品。在根据本发明的第一方式的方法中，通过调查I期肺腺癌组织的细胞中的ACTN4基因的复制数，来判断该I期肺腺癌是否为预后不良，由此来检测预后不良的I期肺腺癌。该方法包括测定I期肺腺癌组织的细胞中的ACTN4基因复制数的步骤，在该复制数超过4 时，判断(诊断)作为被检物的哺乳动物的I期肺腺癌为预后不良。在测定ACTN4基因复制数时，可以使用在本领域公知的标准的方法。关于ACTN4基因的序列以及由其编码氨基酸序列如上述所述，只要是本领域的技术人员就可以通过参照这些序列，使用标准的方法来测定ACTN4基因的复制数。作为基因复制数的测定方法，特别是可以举出基于杂交和扩增的试验。作为基于杂交的试验有印迹杂交法。在该方法中，使基因组DNA片断化，用电泳进行分离，转录到膜上，使其杂交在ACTN4的特异性探针上。通过比较来自该特异性探针的杂交信号的强度和没有复制数增加的相同的基因组区域进行杂交的来自对照探针的信号强度，得到相对的ACTN4基因的复制数。根据本发明优选的实施方式，ACTN4基因复制数的测定是通过对基因组上的该基因使用特异性探针的荧光原位杂交(FISH)法(参照Angerer，Meth. Enzymol. 152,649,1987)来进行的。一般，原味杂交主要是通过以下来进行的，即使被分析的组织或者细胞固定化，将该组织或者细胞进行预杂交处理，使相对于该组织或者细胞中的核酸的特异性探针进行杂交，进行清洗以除去没有结合的特异性探针，检测杂交的特异性探针。在这样的用途中使用的特异性探针由荧光指示器进行标识。通过计算在I个细胞核内的荧光数，能够得到在该细胞中的ACTN4基因的复制数。根据本发明的特别优选的实施方式，在FISH法中使用的所述特异性探针由人体第19号染色体上的第43. SlMb 第44. 02Mb区域的核苷酸序列构成。在这里，由该区域的核昔酸序列构成的探针在测定基因组上的ACTN4基因的复制数上特别有效，是能够以闻感度正确的测定的探针。因此，根据本发明的其它方式，提供一种用于测定人体细胞中的α -辅肌动蛋白-4基因复制数的试剂盒，该试剂盒含有可利用于FISH法的、在基因组上的所述基因中的特异性的探针，该特异性探针由人体第19号染色体上的第43. SlMb 第44. 02Mb区域的核苷酸序列构成。该特异性探针也可以由一条核苷酸分子构成，也可以为覆盖人体第19号染色体上的第43. 81Mb 第44. 02Mb区域的2条以上(优选为2条)的核苷酸分子的组合。作为基于杂交的其它的试验也可以利用比较基因组杂交(CGH)法。就CGH法而言，从被分析的被检验细胞和成为对照的正常细胞中提取各自的DNA，以不同颜色的荧光颜料标识各自的DNA，调制由这些等量标识DNA构成的混合溶液，将该混合溶液保存在37°C、暗处2 3天。由此，相对于染色体的全部部位，在被检验DNA和对照DNA之间，产生竞争性的结合。该结果为，在被检验DNA中如果存在基因复制数的增加，载玻片的与该基因相对应的位置上，强烈地观察到标识了被检验DNA的颜色的荧光，相反的，在被检验DNA中如果存在基因复制数的减少，载玻片上的与该基因相对应的位置上，强烈地观察到标识了对照DNA的颜色的荧光。作为基于扩增的试验有定量的核酸扩增法。在该方法中，由于基因组中的ACTN4基因成为扩增反应的模板，因此能够得到与该复制数相应量的扩增产物。作为具体的核酸扩增法，可以举出定量的PCR法，例如，实时定量PCR法等。在由本发明第二方式的方法中，通过调查I期肺腺癌的组织或者细胞中的α -辅肌动蛋白-4蛋白质的表达增强，来判断该I期肺腺癌是否为预后不良，由此，检测预后不良的I期肺腺癌。该方法包括测定所述I期肺腺癌的组织或者细胞中的ACTN4基因的表达量 的步骤，其表达量比对应的正常的组织或者细胞的表达量多时，即、α -辅肌动蛋白-4蛋白质的表达增强时，判断(诊断)作为被检物的哺乳动物的I期肺腺癌为预后不良。就ACTN4基因表达量的测定而言，可以使用本领域公知的标准的方法。一般基因表达量典型的是将mRNA量或者蛋白质量作为标的物来测定。在本发明中也可以同样将ACTN4的mRNA量或者蛋白质量作为标的物来测定α -辅肌动蛋白_4蛋白质的表达量。对于ACTN4基因的序列以及由其编码的氨基酸序列如上所述，只要是本领域的技术人员就可以通过参照这些序列，使用标准的方法来测定α -辅肌动蛋白-4蛋白质的表达量。根据本发明的优选实施方式，测定基因表达量的步骤包括测定所述组织或者细胞内的α -辅肌动蛋白-4蛋白质量。α-辅肌动蛋白-4蛋白质量可以通过本领域公知的方法来进行测定。例如可以举出以序列号2所表示的序列作为α-辅肌动蛋白-4蛋白质的氨基酸序列，只要是本领域的技术人员通过参照该序列，就可以适宜地测定同蛋白质的量。α -辅肌动蛋白-4蛋白质的量例如可以通过使用与同蛋白质相结合的抗体来适宜地进行测定。像这样的抗体优选为对α-辅肌动蛋白-4蛋白质有特异性的抗体。抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体。α -辅肌动蛋白-4蛋白质的定量优选通过使用这样的抗体的免疫组织化学染色而进行。或者也可以使用将从所述组织或者细胞而得到的蛋白质提取物进行电泳后使用抗体将其进行定量的免疫印迹法。根据本发明的其它的优选实施方式，测定基因表达量的步骤包括将所述组织或者细胞内的ACTN4的mRNA进行定量而成。例如可以举出含有以序列号I表示的核苷酸序列(只是，序列中的t变换成u)作为ACTN4的mRNA，只要是本领域的技术人员通过参照该序列，就可以适宜地定量ACTN4的mRNA。作为用于定量的具体的方法，例如可以举出，在通过使用特异性的引物的RT-PCR而进行的扩增后进行电泳的方法等。成为比较对照的正常的组织或者细胞可以是来自成为被检物的同一个体的正常的组织或者细胞，也可以是来自不同的个体的正常的组织或者细胞。另外，就来自不同的多个个体的正常的组织或者细胞而言，可以测定α-辅肌动蛋白-4蛋白质的表达量，将其平均值作为比较对照。进一步，由预先测定的多个正常的组织或者细胞中的表达量的数据出发，预先设定平均值+标准偏差等合理值，当被检验组织或者细胞的表达量比该合理值高时，可以判断为有ACTN4基因的表达增强。作为“对应的正常的组织或者细胞”可以举出正常的肺组织或者细胞。在本说明书中，与α -辅肌动蛋白-4蛋白质的表达增强一起确认出该被检验哺乳动物的血清CEA浓度上升时，证实具有更显著的有意义差从而可以判断该I期肺腺癌为预后不良的I期肺腺癌。因此，根据本发明的优选实施方式，由本发明的第二方式的诊断法进一步包括以下步骤而成步骤(c)在由所述哺乳动物而得到的血清中，测定癌胚抗原(CEA)的浓度；以及步骤(D)将在步骤(c)中得到的浓度与正常的血清中的癌胚抗原(CEA)的浓度进行比较步骤。在该诊断法中，相对于所述正常的组织或者细胞，所述I期肺腺癌的组织或者细胞中的α-辅肌动蛋白-4蛋白质的表达增强，且相对于所述正常的血清，从所述哺乳动物得到的血清中的癌胚抗原(CEA)浓度为有意义地高时，表示来自所述哺乳动物的I期肺腺癌为预后不良的I期肺腺癌。就测定CEA的血清浓度的方法而言，可以使用本领域公知的标准的方法。CEA为众所周知的肿瘤标记，作为该血清浓度的测定方法，已知有ELISA法或CLEIA法等各种各样的方法，而用于实施这样的各自方法的试剂盒在市场上也有售。成为比较对照的正常的血清可以是来自成为被检物的同一个体的正常的血清，也可以是来自不同个体的正常的血清。另外，对于来自不同的多个个体的正常的血清，可以测定CEA的浓度，将其平均值作为比较对照。进一步，由预先测定的多个正常的血清中的CEA浓度的数据出发，预先设定平均值+标准偏差等合理值，当被检验血清的CEA浓度比该合理值高时，可以判断为有CEA血清浓度的上升。例如，就人体血清而言，CEA浓度超过5. Ong/mL时，可以判断相对于正常的血清为有意义地闻。·根据本发明的优选实施方式，根据本发明的第二方式的方法是组合本发明的第一方式的方法来进行的。即、在该实施方式中，本发明的由第二方式的方法进一步包括以下的步骤而成(e)测定从所述哺乳动物而得到的I期肺腺癌组织的细胞中的ACTN4基因的基因组上的复制数的步骤。在该方法中，相对于所述正常的组织或者细胞，所述I期肺腺癌的组织或者细胞中的α-辅肌动蛋白-4蛋白质的表达增强、且ACTN4基因的复制数超过4时，表示来自所述哺乳动物的I期肺腺癌为预后不良的I期肺腺癌。为了实施以上这样的根据本发明的检测/诊断法，可以将必要的试剂汇集在一起来制成试剂盒。由此，根据本发明提供一种用于在哺乳动物中检测预后不良的I期肺腺癌的试剂盒，该试剂盒含有可以测定细胞中的ACTN4的基因组上的复制数的试剂。根据要实施的具体的方法来选择这样的试剂，优选为在FISH法中可使用的、对于基因组上的该基因为特异性的探针。所述特异性探针优选由人体第19号染色体上的第43. SlMb 第44. 02Mb的区域的核苷酸序列构成。根据本发明的其它方式的试剂盒为用于检测哺乳动物中预后不良的I期肺腺癌的试剂盒，含有能测定组织或者细胞内的ACTN4基因或α -辅肌动蛋白-4蛋白质的表达量的试剂。作为像这样的试剂可以适宜地使用用于定量所述组织或者细胞内的α-辅肌动蛋白-4蛋白质的试剂，例如，特异性结合α-辅肌动蛋白-4蛋白质的抗体。或者像这样的试剂也可以为用于定量所述组织或者细胞内的ACTN4的mRNA的试剂，例如可以是，将ACTN4的mRNA作为模板的在RT-PCR中使用的特异性引物以及RT-PCR用的其它试剂。根据本发明的优选实施方式，该试剂盒为进一步含有能测定血清中的癌胚抗原(CEA)浓度的试剂的试剂盒。根据本发明的其它优选实施方式，该试剂盒为进一步含有能测定细胞中的ACTN4基因的复制数的试剂的试剂盒，像这样的试剂优选为能在FISH法使用的、对基因组上的该基因为特异性的探针的试剂。所述特异性探针优选由人体第19号染色体上的第43. SlMb 第44. 02Mb区域的核苷酸序列构成。根据本发明的试剂盒，根据要实施的具体方法，还可以进一步含有其它试剂类、反应容器、说明书等。根据本发明提供一种含有向被检验者投入有效的治疗量的ACTN4抑制剂而成的、治疗或者予防I期肺腺癌的方法。进一步根据本发明提供一种在制造用于治疗I期肺腺癌的药剂中ACTN4抑制剂的使用。成为治疗或者予防对象的被检验者优选是哺乳动物，例如为人体或者非人体哺乳动物。根据本发明的优选实施方式，ACTN4抑制剂为药物等小分子。像这样的小分子可以通过将ACTN4的阻害活性作为标的物，根据本领域公知的方法进行筛选而得到。根据本发明的优选实施方式，ACTN4抑制剂为特异性地结合在α _辅肌动蛋白_4蛋白质上的抗体。抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体，优选是单克隆抗体。根据本发明的优选实施方式，ACTN4抑制剂为特异性地抑制ACTN4基因表达的反义核酸分子。反义法是用于抑制特定的基因表达的公知技术。在一个具体例中，所述反义核酸分子为基于ACTN4基因的5’编码区域的序列而设计成的大约10 40碱基长的反义RNA0在其它的具体例中，所述反义核酸分子设计成与参与ACTN4基因的转录区域的序列为互补的DNA寡核苷酸。像这样的反义核酸分子可以基于序列号I所示的ACTN4基因的序列而容易地进行设计。根据本发明的优选实施方式，ACTN4抑制剂为特异性地抑制ACTN4基因表达的siRNA核酸分子。在本说明书中，“ siRNA核酸分子”并不仅仅是siRNA其本身，也意味着能在标的细胞中导入siRNA的更长的两条链RNA分子。siRNA核酸分子为通过RNA干扰(RNAi)能抑制特定基因表达的公知的工具(参照Elbashir，S. M. et al.，Nature 411,494-498，2001)。siRNA典型的为，含有与标的基因的mRNA上特异性序列相同的19 21碱基对的核苷酸序列。上述两条链RNA分子典型的为含有与标的基因mRNA上特异性序列相同的更长的核苷酸序列。像这样的siRNA核酸分子可以基于序列号I所示的ACTN4基因的序列而容易地进行设计。进一步，所述siRNA核酸分子可以通过传达到细胞中的适宜的专用载体来使其表达。因此，ACTN4抑制剂可以是特异性抑制ACTN4基因表达的使siRNA核酸分子进行表达的载体。像这样的载体可以通过本领域公知的标准程序而容易地构建(参照Bass，B.L，Cell 101，235-238，2000 ；Tavernarakis, N. et al.，Nat. Genet. 24，180-183，2000 ；Malagon，F. et al.，Mol. Gen. Genet. 259,639-644，1998 ；Parrish, S. et al.，Mol. Cell 6，1077-1087，2000)。ACTN4抑制剂可以通过局部、静脉内、皮下、筋肉内、经口、直肠、粘膜等适宜的途径来给药。另外，其治疗上的有效量依照症状的病势危急程度、被检验者的年龄、使用的具体药物的有效性、给药途径、给药频度等，由医生或者兽医来适宜决定。一般，所述治疗上有效量每一天为约O. 001 约IOOOmg/体重kg,优选大约O. 01 大约IOmg/体重kg,更优选为大约O. 01 大约Img/体重kg。
ACTN4抑制剂可以与医药上允许的载体一起给药。因此，根据本发明，提供一种含有ACTN4抑制剂和医药上允许的载体的、用于治疗I期肺腺癌治疗的医药组合物。医药上允许的载体，例如，媒介物、赋形剂、稀释剂等由本领域的技术人员按照给药途径、所使用的具体药物的性质等来适宜选择。进一步，根据本发明提供一种治疗I期肺腺癌的方法，包括以下步骤而成，即通过根据本发明的第一方式的方法或者根据第二方式的方法或者这些方法的组合，对判断为预后不良的I期肺腺癌的患者给药有效治疗量的化学治疗法制剂。作为该化学治疗法制剂可以使用上述ACTN4抑制剂，也可以使用替加氟.5-氟脲嘧啶混合剂或顺钼等其它的抗癌剂。实施例以下、通过实施例更具体地说明本发明，但本发明并不限定于这些。·
实施例I :1期肺腺癌和α -辅肌动蛋白-4基因的表达亢进的关联作为样品使用被甲醛固定石蜡包埋的来自1997年12月到2001年3月在国立癌中心中央医院(日本)实施了 I期肺腺癌切除手术的372名患者的切除样体(以下称为“队列I”)。在这些样品中，通过免疫组织化学分析来讨论α-辅肌动蛋白-4蛋白质的表达。在免疫组织化学分析中所使用的一次抗体是在国立癌中心研究所(日本)所制造的抗人体α-辅肌动蛋白-4兔多克隆抗体。免疫染色通过使用生物素·亲合素复合体(Avidin-Biotin Complex)的 ABC 法来进行。作为α-辅肌动蛋白-4蛋白质表达的评价，与同一切片上的血管内皮相比，将癌部的表达为亢进，且其亢进部分的面积占肿瘤整体面积的30%以上的样品定义为阳性例，其以外的样品定义为阴性例。接下来，通过Cox比例风险模型的单变量解析和多变量解析来分析关于α _辅肌动蛋白-4蛋白质表达的上述分类、以及各种临床病理学上的因素相对于I期肺腺癌患者生存期间的危险率。作为变量除了 α-辅肌动蛋白-4蛋白质表达(阳性/阴性)之外，使用性别(男性/女性)、年龄(65以上/不到65)、吸烟(无/有)、阶段(ΙΑ/ΙΒ)、血清CEA(超过5ng/mL/5ng/mL以下)、淋巴管侵袭(阳性/阴性)以及静脉侵袭(阳性/阴性)。以下表I显示该结果。表I :使用Cox比例风险模型的I期肺腺癌的临床病理学上的预后因素解析(队列I : α -辅肌动蛋白-4蛋白质表达解析)
权利要求
1.一种肺腺癌的预后预测方法，是通过检测在哺乳动物中的预后不良的I期肺腺癌来预测预后的预后预测方法，其特征在于， 包括测定由所述哺乳动物得到的I期肺腺癌组织的细胞中的α -辅肌动蛋白-4基因(ACTN4)的复制数的步骤而成， 当所述基因的复制数超过4时，预测来自所述哺乳动物的I期肺腺癌为预后不良的I期肺腺癌。
2.根据权利要求I所述的肺腺癌的预后预测方法，其特征在于，所述基因的复制数的测定是通过对基因组上的该基因使用特异性的探针的FISH法来进行的。
3.根据权利要求2所述的肺腺癌的预后预测方法，其特征在于，所述特异性探针由人体第19号染色体上的第43. 81Mb 第44. 02Mb区域的核苷酸序列构成。
4.一种肺腺癌的检测试剂盒，其为用于检测在哺乳动物中的预后不良的I期肺腺癌的检测试剂盒，其特征在于，含有能够测定细胞中的ACTN4基因的复制数的试剂而成。
5.根据权利要求4所述的肺腺癌的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂对基因组上的所述基因为特异性的探针。
6.根据权利要求5所述的肺腺癌的检测试剂盒，其特征在于，所述特异性探针由人体第19号染色体上的第43. 81Mb 第44. 02Mb区域的核苷酸序列构成。
7.一种肺腺癌的预后预测方法，是通过检测在哺乳动物中的预后不良的I期肺腺癌来预测预后的预后预测方法，其特征在于，包括以下步骤 步骤(a)在由所述哺乳动物而得到的I期肺腺癌的组织或者细胞中，测定ACTN4基因表达量；以及 步骤(b)将步骤(a)得到的表达量与对应的正常组织或者细胞中的ACTN4基因表达量相比较， 相对于所述正常组织或者细胞，当所述I期肺腺癌的组织或者细胞中的所述基因表达增强时，预测来自所述哺乳动物的I期肺腺癌为预后不良的I期肺腺癌。
8.根据权利要求7所述的肺腺癌的预后预测方法，其特征在于，在所述步骤(a)中，检测所述组织或者细胞内的α -辅肌动蛋白-4蛋白质。
9.根据权利要求8所述的肺腺癌的预后预测方法，其特征在于，α-辅肌动蛋白-4蛋白质含有以序列号2表示的氨基酸序列。
10.根据权利要求8所述的肺腺癌的预后预测方法，其特征在于，α-辅肌动蛋白-4蛋白质的检测是通过使用特异性抗体的免疫组织化学染色来进行的。
11.根据权利要求7所述的肺腺癌的预后预测方法，其特征在于，在所述步骤(a)中，检测所述组织或者细胞内的α -辅肌动蛋白-4的mRNA。
12.根据权利要求11所述的肺腺癌的预后预测方法，其特征在于，α-辅肌动蛋白-4的mRNA含有以序列号I表示的核苷酸序列(只是，序列中的t变换成u)。
13.根据权利要求7所述的肺腺癌的预后预测方法，其特征在于，进一步包括以下步骤 步骤(c)测定由所述哺乳动物而得到的血清中的癌胚抗原(CEA)浓度；以及 步骤⑷将步骤(c)中得到的浓度与正常的血清中的癌胚抗原(CEA)的浓度相比较， 相对于所述正常的组织或者细胞，所述I期肺腺癌的组织或者细胞中的所述基因表达增强，且相对于所述正常的血清由所述哺乳动物而得到的血清中的癌胚抗原(CEA)浓度为有意义高时，则预测来自所述哺乳动物的I期肺腺癌为预后不良的I期肺腺癌。
14.根据权利要求13所述的肺腺癌的预后预测方法，其特征在于，当由所述步骤(c)得到的浓度超过5. Ong/mL时，判断相对于所述正常的血清为有意义地高。
15.根据权利要求7所述的肺腺癌的预后预测方法，其特征在于，进一步包括以下的步骤 步骤(e)测定由所述哺乳动物而得到的I期肺腺癌组织的细胞中的ACTN4基因的复制数的步骤， 相对于所述正常的组织或者细胞，所述I期肺腺癌的组织或者细胞中所述基因的表达增强，且所述基因的复制数超过4时，则预测来自所述哺乳动物的I期肺腺癌为预后不良的I期肺腺癌。
16.根据权利要求15所述的肺腺癌的预后预测方法，其特征在于，所述基因的复制数的测定是通过对基因组上的该基因使用特异性探针的FISH法来进行的。
17.根据权利要求16所述的肺腺癌的预后预测方法，其特征在于，所述特异性探针由人体第19号染色体上的第43. 81Mb 第44. 02Mb区域的核苷酸序列构成。
18.一种肺腺癌的检测试剂盒，是用于检测在哺乳动物中的预后不良的I期肺腺癌的检测试剂盒，其特征在于，含有能够测定组织或者细胞内的ACTN4基因表达量的试剂。
19.根据权利要求18所述的肺腺癌的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂为用于定量所述组织或者细胞内的α -辅肌动蛋白-4蛋白质的试剂。
20.根据权利要求19所述的肺腺癌的检测试剂盒，其中，用于定量α-辅肌动蛋白-4蛋白质的试剂为特异性地结合在α-辅肌动蛋白-4蛋白质的抗体。
21.根据权利要求18所述的肺腺癌的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂为用于定量所述组织或者细胞内的α -辅肌动蛋白-4的mRNA的试剂。
22.根据权利要求18所述的肺腺癌的检测试剂盒，其特征在于，进一步含有能测定血清中的癌胚抗原(CEA)浓度的试剂。
23.根据权利要求18所述的肺腺癌的检测试剂盒，其特征在于，进一步含有能测定细胞中的ACTN4基因的复制数的试剂。
24.根据权利要求23所述的肺腺癌的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂对基因组上的所述基因为特异性的探针。
25.根据权利要求24所述的肺腺癌的检测试剂盒，其特征在于，所述特异性探针由人体第19号染色体上的第43. 81Mb 第44. 02Mb区域的核苷酸序列构成。
26.一种用于治疗肺腺癌的医药组合物，其特征在于，含有α-辅肌动蛋白-4抑制剂和医药上允许的载体而成。
27.根据权利要求26所述的用于治疗肺腺癌的医药组合物，其特征在于，α-辅肌动蛋白-4抑制剂为小分子。
28.根据权利要求26所述的用于治疗肺腺癌的医药组合物，其特征在于，α-辅肌动蛋白-4抑制剂为特异性地结合在α -辅肌动蛋白-4蛋白质上的抗体。
29.根据权利要求26所述的用于治疗肺腺癌的医药组合物，其特征在于，α-辅肌动蛋白-4抑制剂为特异性地抑制ACTN4基因表达的反义核酸分子。
30.根据权利要求26所述的用于治疗肺腺癌的医药组合物，其特征在于，α-辅肌动蛋白-4抑制剂为特异性地抑制ACTN4基因表达的siRNA核酸分子。
31.根据权利要求26所述的用于治疗肺腺癌的医药组合物，其特征在于，α-辅肌动蛋白-4抑制剂为对特异性地抑制ACTN4基因表达的siRNA核酸分子进行表达的媒介物。
32.—种肺腺癌的检测试剂盒，是用于测定人体细胞中的ACTN4基因的复制数的检测试剂盒，其特征在于，含有可利用于FISH法中的、对基因组上的所述基因具有特异性的探针而成，该特异性探针由人体第19号染色体上第43. SlMb 第44. 02Mb区域的核苷酸序列构成。
全文摘要
本发明提供了一种肺腺癌的预后预测方法、肺腺癌的检测试剂盒以及用于治疗肺腺癌的医药组合物，所述肺腺癌的预后预测方法为通过检测在哺乳动物中的预后不良的I期肺腺癌来预测预后的预后预测方法，测定由所述哺乳动物得到的I期肺腺癌组织的细胞中的ACTN4的复制数。当所述基因的复制数超过4时，预测为来自所述哺乳动物的I期肺腺癌为预后不良的I期肺腺癌。
文档编号G01N33/53GK102947446SQ20118001542
公开日2013年2月27日 申请日期2011年3月29日 优先权日2010年3月30日
发明者本田一文, 山田哲司, 野吕林太郎, 广桥说雄 申请人:日本健康科学财团
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