专利名称：一种毛细管电泳检测蛋白多肽相互作用的方法
技术领域：
本发明涉及生物分析领域，特别涉及一种毛细管电泳检测蛋白多肽相互作用的方法。
背景技术：
主要组织相容性复合体蛋白(MHC)由主要组织相容性复合体编码，广泛存在于脊椎动物细胞表面的一个糖蛋白分子大家族。MHC表面有一沟，可与外来抗原的肽链结合，将其提呈给T细胞引起免疫反应。因此研究MHC与蛋白的相互作用对于研究一些疾病的致病机制非常重要。人类白细胞抗原DQ2蛋白(DQ2)是MHC很重要的一种蛋白。生物分析技术在揭示MHC蛋白和多肽的相互作用中起到了至关重要的作用。目 前研究MHC蛋白与多肽相互作用的方法主要有高效凝胶过滤色谱法(HPSEC) (B. J.McFarland, J. F. Katz, A. J. Sant, et al. J. Mol. Biol. 2005, 350, 170-183),突光偏振法(S. L. De Wall, C. Painter, J. D. Stone, et al. Nat. Chem. Biol. 2006,
2,197-201),核磁共振法(L. Schmitt, J. J. Boniface, Μ. M. Davis, et al. J. Mol.Biol. 1999，286，207-218)等。然而，现在大多数的分析方法只能测量单个多肽和MHC蛋白的结合过程，而无法反应在生物体内的抗原递呈过程的复杂性一细胞内源多肽和外源抗原同时存在的这种竞争关系。毛细管电泳(CE)具有高效、高速、微量、低消耗、操作模式多，分离方法开发容易等优点，由于具备如此多的优点以及分离生物大分子的能力，CE成为近年来发展最迅速的分离分析方法之一。尤其是将荧光检测与毛细管电泳相结合，大大提高了检测限，拓展了毛细管电泳的应用。本试验建立的多肽配体和HLA-DQ2蛋白相互作用的检测方法，克服了已有方法存在的缺陷，可满足大批量检测需要，适用范围较广，有较高的精确性及较好的稳定性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为了克服现有技术对蛋白多肽相互作用检测的不足，本发明提供一种毛细管电泳检测蛋白多肽相互作用的方法。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是一种毛细管电泳检测蛋白多肽相互作用的方法，首先将DQ2与凝血酶混合，切除DQ2上的α I多肽(LQPFPQPELPY，SEQIDN0. I)。将外源多肽I荧光标记后与DQ2混合，然后进行毛细管电泳检测，同时检测蛋白多肽复合物和荧光多肽的出峰时间及荧光强度；将SDQ2_Pep/STotal作为Y轴，以时间为X轴，得到DQ2与多肽结合的曲线。其中SDQ2_Pep是DQ2多肽复合物的荧光峰面积积分，Slotal是整个电泳普通的荧光峰面积积分。本发明方法中所述的毛细管电泳检测中，电泳缓冲液优选为25 mM硼酸缓冲液，PH9.3。所述硼酸缓冲液经O. 22 μ m滤膜过滤。本发明的方法还可以同时检测不同外源多肽及不同外源多肽与DQ2的竞争关系。例如，当外源多肽为两种时，将两种不同荧光分子标记的外源多肽I和外源多肽2与DQ2混合，进行毛细管电泳检测，分别记录两种荧光标记物的荧光变化。将蛋白与多肽混合后，可根据毛细管电泳谱图的变化检测蛋白多肽相互作用。该方法还可以检测两种外源多肽与蛋白相互作用的竞争过程。实验证明，该方法操作简单，检测灵敏度高，所需时间短；可同时检测多个荧光波长，从而减少了误差，提高了检测的准确性。该方法是对传统蛋白多肽相互作用检测技术进行改进，结合多波长荧光检测灵敏度高等优点，建立的一种新的高灵敏蛋白多肽相互作用检测技术。
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。图I DQ2与外源多肽相互作用示意图。
图2毛细管电泳荧光检测DQ2与多肽P印2的相互作用。其中，a是P印2的电泳 谱图；b是DQ2与P印2混合物的电泳谱图，DQ2/Pep2=l: 10 ;c是DQ2与P印2混合物的电泳谱图，002外印2=10:1。激发光源λ ex=490 nm。图3毛细管电泳荧光检测DQ2与多肽P印I的相互作用。其中，a是P印I的电泳谱图山是002与？印1混合物的电泳谱图，002外印2=10:1。激发光源λ ex=490 nm。图4毛细管电泳同时荧光检测两种外源多肽P印2和P印3与DQ2的相互作用。P印2的检测波长为520 nm (检测FAM)，P印3的检测波长为670 nm (检测Cy5),DQ2:Pep2:Pep3=10:1:1,激发光源 λ ex=490 nm。图5毛细管电泳荧光检测P印3多肽与DQ2相互作用的动力学。A，是P印3与DQ2混合后不同时间检测的毛细管电泳谱图是SDQ2_Pep3/ST()tal随时间变化的曲线。
具体实施例方式现在结合附图对本发明作进一步详细的说明。本发明原理如图I所示，下述实施例中具体操作流程如下
I、首先将DQ2与凝血酶混合，切除DQ2上的α I多肽。2、将荧光标记的外源多肽与步骤I中切除了 α I多肽的DQ2混合。3、进行毛细管电泳检测
电泳缓冲液:为25 mM硼酸缓冲液(ρΗ9. 3)；
毛细管为未涂层毛细管(内径75 μ m，长度60 cm，有效长度35 cm)。电泳检测进样电压12 KV，进样10 S，然后停止加压。分离电压18 KV，分离10min，可同时检测多个通道的荧光强度，收集、分析得到相应的检测结果。4、将SDQ2_Pep/ST()tal作为Y轴，以时间为X轴，得到DQ2与多肽结合的曲线。其中SDQ2-Pep是DQ2多肽复合物的荧光峰面积积分，Slotal是整个电泳普通的荧光峰面积积分。DQ2可通过现有技术获得，例如可按照文献的方法制备(/办？ Chem Soc 2006;128: 1859-1867)。也可以通过下述方法得到2升High-Five细胞(浓度为2_2. 5 r IO6个/毫升)首先用杆状病毒感染(感染复数MOI为3-5)，4天后离心30分钟收集上清液。可溶性DQ2分子通过蛋白A-琼脂糖凝胶柱纯化，并用pHll. 5的缓冲液(含有50mM 二乙胺，O. 15M NaCl和2M Tris)洗脱。实施例I
实例中使用的仪器及操作条件如下
所用毛细管电泳为基于荧光显微镜自搭毛细管电泳系统，高压电源为上�：宋锢硌芯克挥夤馄滓俏Ｑ蠊庋E65000 ;自制显微镜接口，将显微镜标准口的荧光通过光纤导入光谱仪。采用电压进样，进样电压12 KV，进样时间为10 S，电泳电压为18 KV，电泳10 min。图2为用毛细管电泳荧光检测DQ2与多肽P印2的相互作用。P印2序列为MATPLLMQALPMGALPQ (SEQ ID NO. 3)，用羧基荧光素(FAM)标记；实验结果表明，DQ2与多肽P印2的相互作用后在约500 s产生一个新的荧光峰，而多肽的峰明显减弱，因此该方法可以用来检测DQ2与多肽的相互作用。 实施例2
实验条件同实施例1，区别在用毛细管电泳检测外源多肽P印I与DQ2的相互作用，外源多肽P印I序列为FAM-PVSKMRMATPLLMQA(SEQ ID NO. 2)，用FAM标记。检测结果如图3所示，DQ2与多肽P印I的相互作用后产生一个新的荧光峰，证明外源多肽P印I可以与DQ2相
互作用。实施例3
实验条件同实施例1，区别在用毛细管电泳同时检测两种外源多肽P印2和P印3与DQ2的相互作用，外源多肽P印2用FAM标记；外源多肽P印3序列为LQLQPFPQPELPYPQPELPY(SEQID NO. 4),用近红外菁类染料(Cy5)标记。如图4所示。实验结果表明，在同一光源激发下，可同时检测两种外源多肽与DQ2的相互作用。实施例4
实验条件同实施例1，区别在用毛细管电泳检测P印3多肽(用Cy5标记)与DQ2相互作用的动力学，如图5所示。实验结果表明，DQ2与Pep3复合物的电泳峰(图5A，约520 S)，随时间的增加而逐渐增加。因此可通过毛细管电泳检测DQ2与外源多肽的结合过程。通过上述四个实施例可以看出，本发明的一种毛细管电泳检测蛋白多肽相互作用的方法可以实现蛋白多肽相互作用检测，并且灵敏度高，操作方便，结果准确。以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
权利要求
1.一种毛细管电泳检测蛋白多肽相互作用的方法，其特征在于包括以下步骤先将DQ2与凝血酶混合，切除DQ2上的α I多肽；再与经荧光标记的外源多肽混合得混合物，然后对混合物进行毛细管电泳荧光检测，同时检测混合物中DQ2-多肽复合物和外源多肽的出峰时间及荧光强度，得出DQ2与外源多肽结合的曲线。
2.如权利要求I所述的一种毛细管电泳检测蛋白多肽相互作用的方法，其特征在于所述外源多肽为两种或两种以上，不同的外源多肽分别用不同的荧光分子标记，进行毛细管电泳检测，分别记录不同荧光标记物的荧光变化。
3.如权利要求I所述的一种毛细管电泳检测蛋白多肽相互作用的方法，其特征在于所述的毛细管电泳检测中，电泳缓冲液为25 mM硼酸缓冲液，ρΗ9. 3。
4.如权利要求3所述的一种毛细管电泳检测蛋白多肽相互作用的方法，其特征在于所述硼酸缓冲液经O. 22 μ m滤膜过滤。
5.如权利要求I所述的一种毛细管电泳检测蛋白多肽相互作用的方法，其特征在于所述的外源多肽为DQ2的抗原多肽P印I和/或和/或；所述P印I、Pep2和P印3的序列分别如SEQ ID NO. 1-3所示。
全文摘要
本发明涉及一种毛细管电泳检测蛋白多肽相互作用的方法，属于生物分析领域。首先将DQ2与凝血酶混合，切除DQ2上的αI多肽(LQPFPQPELPY)。将外源多肽荧光标记后与DQ2混合，然后进行毛细管电泳检测，同时检测蛋白多肽复合物和荧光多肽的出峰时间及荧光强度。该方法还可以同时检测两种外源多肽与蛋白相互作用的竞争过程。实验证明，该方法操作简单，检测灵敏度高，所需时间短。该方法是对传统蛋白多肽相互作用检测技术进行改进，结合多波长荧光检测灵敏度高等优点，建立的一种新的高灵敏蛋白多肽相互作用检测技术。
文档编号G01N21/64GK102890074SQ20121039008
公开日2013年1月23日 申请日期2012年10月15日 优先权日2012年10月15日
发明者王建浩, 邱琳, 蒋鹏举, 王车礼, 夏江 申请人:常州大学
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
