A25噬菌体溶解酶的制作方法-山东亚星游戏官网机床有限公司

专利名称：A25噬菌体溶解酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及从噬菌体A25上分离的一种新的蛋白和核酸，及这些蛋白和核酸的诊断和治疗用途，也涉及它们作为药物组分治疗链球菌感染的用途。这个发明也涉及从噬菌体A25鉴定、分离和克隆特定基因，特别是噬菌体A25细胞裂解酶，称为PlyA，涉及使用这个基因和基因产品帮助诊断A组链球菌感染，及对预防A组链球菌感染的药物和治疗作用。
背景技术：
化脓性链球菌为革兰氏阳性A族链球菌属细菌，人类几种疾病的病原菌，包括咽炎和/或扁桃体炎，皮肤感染(脓疱�。ざ荆げ〉刃问�)，急性风湿热(ARF)，链球菌感染后肾小球肾炎(PSGN)，猩红热(SF)和中毒性休克综合征(TSLS)。急性风湿热是全球引起小儿心脏病的最常见的病因。例如，据估计，在印度，超过600万学龄儿童患有风湿性心脏瓣膜病。在美国，“喉咙痛”是第三大常见�。渲写笤�30%是由儿童化脓性链球菌引起。在美国每年大约有1-2亿美元的医疗费用用于治疗约25-35百万例链球菌咽炎。

发明内容
本发明涉及到噬菌体A25核酸和蛋白序列的分离和说明，以及使用该核酸和蛋白序列的诊断和治疗作用，特别是对A组链球菌。此外，根据已确定一个开放读码框推导出一个多肽。利用现有的序列数据手段，分离的PlyA细胞裂解酶的裂解作为开展诊断和治疗用途。因此，一方面，本发明提供噬菌体A25全长核酸序列的分离方法和序列说明，如SEQ ID N0:1。发明的第二个部分为噬菌体A25多肽全长序列的分离方法和序列说明，如SEQ ID N0:2。下面对序列诊断和治疗效用做详细的说明和描述。本发明的另一个方面提供了致病性链球菌感染的诊断方法。在一个具体实施方式
中，含有A组链球菌细胞的临床样品与本发明所述的PlyA多肽进行预处理。如果样品中存在的A组链球菌细胞，预处理临床样品可以使抗体检测到裂解酶裂解的组分。一种诊断致病性链球菌感染的方法，可包括:a)提供可能含有链球菌的患者样品；b)让样品与PlyA多肽接触；和c)检测样品中的A组链球菌分析物；其中，如果在待测样品中存在A组链球菌分析物，表明主体受链球菌感染。一个实施方式中，PlyA多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的序列相似性大于80%。在另一个实施方式中，PlyA多肽包括SEQID NO:2。本发明可能用到的诊断测试方式，包括酶联免疫吸附检测，横向流动检测，或放射免疫法。在这些方式中，可以直接利用PlyA蛋白和/或针对链球菌抗原制备抗体，并按照试剂盒说明来测试病人样品中是否存在致病性链球菌。酶联免疫吸附试验或放射免疫法的方法对本领域的一般技术人员是熟知的。PlyA可直接用于检测临床样品中的A组链球菌细胞。例如，一个PlyA的结合域被标记，用本领域的一般技术人员熟知的如化学荧光或蛋白质标记，然后被标记的PlyA直接与从主体分离的可能含有致病链球菌的样品共培养。观察到样品中的结合标记物，如荧光，表明主体受到致病性链球菌的感染。在一个进一步的实施方式中，提供了 PlyA在活性测定中的作用如荧光素-荧光素酶检测，以帮助诊断致病性链球菌感染。在这样一个测定方式中，可能含有致病性链球菌的样品直接与PlyA —起培养。如果样品中含有的致病性链球菌，PlyA将与细菌结合，导致细菌的裂解，随后释放通常存在与细菌细胞质的ATP或其他组件，如酶。然后裂解液用荧光素-荧光素酶检测。在另一个实施方式中，可能含有致病性链球菌的样品可直接添加到具有荧光素-荧光素酶的PlyA中,加荧光素-荧光素酶前无需收集细胞裂解液。如果是样品中存在致病性链球菌，裂解的细菌细胞释放的ATP会引发荧光素-荧光素酶系统的阳性反应，从而在反应混合物中产生可检测的光。可以知道，PlyA也可以作为处理或预防细菌感染的用途，这种用途包括施加PlyA的治疗有效剂量。在本发明的一个实施方式中，PlyA作为一个药物组分与适宜的药学载体用于治疗细菌感染，包括致病性A组链球菌感染。包含PlyA的药物组分能治疗哺乳类动物的链球菌感染，包括但不限于人类。一个实施方式提供了用药物组分治疗链球菌咽炎和其他A组链球菌疾病的用途。在一个进一步的实施方式中，提供了本发明在制备治疗细菌感染药物过程中所需的多肽的用途，即，噬菌体A25 PlyA裂解酶，包括有生物活性PlyA片段，突变，变种，类似物或衍生物。在另一个优选的实施方式中，本发明提供本发明中多肽，即，噬菌体A25 PlyA裂解酶，包括片段，突变，变种，类似物或衍生物的用途，用于制备治疗链球菌感染的药剂。本发明的另一个方面涉及用于制备特异的PlyA抗体。在优选的实施方式中，抗体是PlyA或亚基或片段的特异单克隆抗体。在一个进一步的实施方式中，抗体是多克隆抗体，来自小鼠，大鼠，豚鼠，兔子，山羊，绵羊，马，猪，牛，或任何本领域常用的其他制备多克隆抗体的哺乳动物。在另一个实施方式中，抗体可以是嵌合抗体，人源化抗体，单链抗体或片段。在一个进一步的实施方式中一个持续繁殖细胞系产生一种PlyA或亚基或片段特异的单克隆抗体。本发明提供的进一步实施方式中用PlyA或片段的抗体，或用抗体来制备PlyA或片段，标记抗体(如荧光或其他已知的荧光蛋白质或化学品)，耦合到噬菌体蛋白质，用于监测与病人样品中的细菌的特定蛋白结合，帮助检测致病性链球菌。PlyA蛋白可直接被荧光标记，用于检测病人样品中存在的致病性链球菌。本发明的另一个部分提供了预防或治疗细菌感染的方法，包括施加药物治疗有效剂量，药品的有效成分包含一定量的具有治疗效果的PlyA，其序列如SEQ IDNO:2所示。本发明的另一个部分提供的药物组分，包括如SEQ IDNO:2所示有效剂量的PlyA和适宜的药学载体。一个具体实施方式
中，包括设计治疗A组链球菌感染的药物组分。另一个实施方式中设计的药物组分用于治疗局部或全身性，或其他抗生素类药物无效的感染。一个进一步的实施方式中也指出本发明所述的药物组分也可以作为兽药。一个优选的实施方式是用于治疗哺乳动物感染，包括但不限于人类。另一个实施方式为用本发明所述的组分包含本发明中的多肽，即A25噬菌体PlyA裂解酶，包括片段，突变，变种，类似物或衍生物组成，用来净化老化的表面，消除可能由A组链球菌引起的污染。结合下面的附图进行详细说明，能使本发明的其他优点更加明显。

图1为A25细胞裂解酶(PlyA) DNA序列和其“推导出”的蛋白质序列。图2链球菌噬菌体中细胞裂解酶PlyA序列(SEQ ID NO:2)与以前披露的细胞裂解酶的比较图。SEQ ID NO:2和此前披露(YP_950557.1，公认的细胞裂解酶(链球菌噬菌体SMP))的细胞裂解酶的序列同源性为80.5% (387/481)。图3(a)组氨酸标记PlyA重组蛋白纯化的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。在大肠杆菌(一种还原酶缺陷型宿主菌XE.coli Origami DE3 (emd bioscience)里表达后,经过组氨酸标记的PlyA在镍-NTA亲和层析柱(Qiagen)纯化，然后通过浓缩和变性后，在4_20%SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行分析。该片段通过分析DNA序列可以预测为52.5KD。图3 (b)为GAS噬菌体A25中的PlyA和PlyC细胞裂解酶活性测定比较分析图。和PlyC的活性分析比较。在8个小时培养后，指数生长后，19615号化脓性链球菌被溶解在KE缓冲溶液(0.1M KPO4, 5mM EDTA, pH 6.7)中，然后被放置在酶标孔中。把经过镍-NTA亲和层析柱(Qiagen)纯化的PlyA和PlyC稀释在KE缓冲溶液中(0.1M KPO4, 5mM EDTA, 3mMBME, pH6.7)，然后再加入到包括有化脓性链球菌底物作为指示试剂的酶标孔中。然后，每间隔6分钟，通过分析底物的混浊度减少来分析PlyA和PlyC的活性.其中底物为在8个小时培养后，指数生长后，被KE缓冲溶液(0.1M KPO4, 5mM EDTA, pH 6.7)清洗的19615号化脓性链球菌，每孔200微升(λ /孔)。样品是溶解在KE缓冲溶液，为每孔10微升(λ /孔)。

图4噬菌体Α25的DNA基因序列图5噬菌体Α25的蛋白序列图6显示了一个横向流动装置，其中rPlyA处理A组链球菌，使其释放完整的A组抗原，启动横向流动装置中的特异的A组抗原检测。详细描述本发明涉及A25噬菌体细胞裂解酶基因的鉴定，测序和分离，A25噬菌体细胞裂解酶基因是在噬菌体生命周期时细菌细胞裂解过程中所需的一个蛋白。本发明还涉及细胞裂解酶溶解某种细菌的方法，这在诊断过程中可用来检测这些细菌。此处所述的实施方式是在以前描述的检测基础上提高检测的灵敏度/特异性。在这个附加的权利要求和说明书中所用到的，“一个”，“一”和“这个”等形式包括多个的含义，除非文中另有明确说明外。例如，“这个方法”的含义是包括一个或多个方法，和/或，这里描述的多个步骤，和/或对阅读本说明等的本领域的技术熟练人士是显而易见的意思理解。除非另有定义，此处使用的所有技术和科学术语都是通用的，对本领域的熟练技术人员来说这些都是熟知的。虽然与这里描述的所有方法和材料的类似或等同物都可以用于本发明的实践或检测，现在所述的是较优选的方法和材料。此处提到的所有出版物的全部被纳入作为本发明的参考。
定义“治疗”，是指根据病人执行药品或实现药品性能的过程，用于预防(防范)或治疗病人的患痛或疾病。此处所用的“抗体”包括完整的分子，也可以是片段，例如Fab和F (ab’)2，能够结合表位的决定因素。该抗体可以是单克�。嗫寺】固澹逗希诵曰虻チ纯固寤蚱�。连接PlyA多肽、亚基或片段的抗体可以用完整二聚体，多肽片段，含有的靶标小肽作为免疫抗原接种到载体分子产生。常用的载体可以化学耦合到包括牛血清白蛋白和球蛋白等多肽。双肽可用于免疫动物(例如小鼠，大鼠或兔子)。一个“治疗有效数量”或“治疗有效剂量”是指从足够到减少的数量或剂量，可预防或改善细菌感染相关的症状。“片段”是指任何一种蛋白质或多肽，其中包括至少5个氨基酸残基(最好，至少有10个氨基酸残基，至少15个氨基酸残基，至少有20个氨基酸残基，至少有25个氨基酸序列酸残基，至少有40个氨基酸残基，至少有50个氨基酸残基，至少有60个氨基酸残基，至少有70个氨基酸残基，至少有80个氨基酸残基，至少有90个氨基酸残基，至少有100个氨基酸残基，至少有125个氨基酸残基，至少有150个氨基酸残基，至少有175个氨基酸残基，至少有200个氨基酸残基，或至少有250个氨基酸残基)的氨基酸序列来自亲本的蛋白质或多肽，或由至少10个碱基对的核苷酸序列(最好至少有20个碱基对的，至少有30个碱基对的，至少有40个碱基对的，至少有50个碱基对的，至少有50个碱基对的，至少有100个碱基对的核酸至少有200个碱基对)来自亲本的核苷酸。任何指定的片段可能具备或不具备亲本核苷酸或蛋白质或多肽的功能。此处所用的“类似”，是指与本发明中所述的具有预期活性和治疗效果的核苷酸、蛋白或多肽一样，具有相同或相似的活性或功能的核苷酸，蛋白质，或多肽，(例如，A组链球菌细胞壁裂解活性，或能帮助诊断、预防或治疗链球菌感染)，但不一定包括与优选实施方式中的序列相同或相似的序列，如SEQ ID NOS:1或2，或具有如SEQ ID NOS:1或2中相同或相似的结构。由于此处所用的核酸或核苷酸序列或蛋白质的氨基酸序列或多肽，如果满足至少下列标准中的一项，则与具有预期活性的核苷酸、核酸或蛋白质或多肽是类似的:(a)核酸，核苷酸，蛋白质或多肽序列与这里所述的具有预期活性的核酸，核苷酸，蛋白质或多肽序列至少有30 % (最好，至少有35 %，至少40 %，至少45 %，至少50 %，至少55 %，至少60 %，至少65 %，至少有70 %，至少75 %，至少有80 %，至少85 %，至少有90 %，至少有95 %或至少99%)相似性；(b)在严格的条件下杂交产生的核苷酸序列编码的多肽是由至少5个氨基酸残基(更多最好的，至少有10氨基酸残基，至少有15个氨基酸残基，至少有20个氨基酸残基，至少有25个氨基酸残基，至少有40个氨基酸残基，至少有50个氨基酸残基，至少有60个氨基酸残基，至少有70个氨基酸残留，至少有80个氨基酸残基，至少有90个氨基酸残基，至少有100个氨基酸残基，至少有125个氨基酸残基，或至少有150个氨基酸残基)组成；或(c)是由核苷酸序列编码的多肽与这里所述的具有治疗效果的核苷酸编码的多肽至少有30%是至少有30% (最好，至少有35%，至少40%，至少45%，至少50%，至少55%，至少60%，至少65%，至少有70%，至少有75%，至少80%，至少85%，至少有90%，至少有95%或至少99%)的相同序列。由于此处所用多肽具有与本发明中优选的实施方式中的多肽具有“类似的结构” 是指与优选实施方式中的多肽具有相似的二维、三维或四维结构的多肽。本领域的技术人员熟知决定多肽的结构的方法，包括但不限于，X射线晶体学，核磁共振和晶体的电子显微镜。“衍生物”是指任何一种蛋白质或多肽，包括通过氨基酸残基替换，删除或增加，或通过一个核酸或核苷酸的替换、删除或突变改变亲本的蛋白质或多肽的氨基酸序列。衍生出的核酸、核苷酸蛋白或多肽拥有与亲本多肽相同或相似的功能。“诊断”，是指诊断，预知，监测，特征，选择患者，其中包括参加临床试验，并确定可能具有特定疾病或临床事件风险的患者或那些最有可能需要特定的治疗服务的患者，或评估或监测病人对特定的治疗服务反应。—个多核苷酸或多肽的“变异”(V)，此处使用的术语，是指多核苷酸和多肽分别不同于参照的多核苷酸或多肽。多聚核苷酸的变异一般都有限，那样参照的核苷酸序列与变异核苷酸序列总的来说在许多地方是相同和密切相关的。核苷酸序列变异所造成的改变也可能会沉默。也就是说，变异可能不会改变由核苷酸编码的氨基酸序列。这些沉默的变异仅限于改变成与参照物核苷酸编码相同的氨基酸序列。或者，在核苷酸序列的变异可能会改变参照核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。这种核苷酸的改变可能导致氨基酸替换，添力口，删除，融合，及参照序列编码的多肽的表达终止。多肽变异一般都有限，因此参照序列与变异序列总的来说在许多地方是相同和密切相关的。例如，由于替换，添加，删除，融合，和终止表达，一个变异多肽和参考多肽氨基酸序列中可能会有一个或多个氨基酸序列不同，这是在任何融合表达中都可能存在或不存在。这些变异可以是氨基酸组成的改变(如不同的等位基因或自然氨基酸序列的变化，例如，作为mRNA或mRNA前处理改变的结果，如选择性剪接或限制性蛋白水解的结果)。此外，改变也可能出现在翻译后修饰差异(如糖基化，酰化，磷酸化，异戊二烯，脂化)。用本发明检测PlyA或检测PlyA存在量或表达量的方法，一种核酸可以与本发明中的核酸，或和它的反向互补序列，或与编码衍生物的核酸序列，或和反向互补核酸在低严格度情况下“杂交”。通过实施方式中的方法，但不限于这种方法，使用的低严格性程序如下(见 Shilo 和 Weinberg, 1981 年，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.78，6789-6792)。含有 DNA 的滤纸在 40°C含有 35% 甲酰胺，5 X SSC 的 50mM Tris_HCl(pH 值 7.5)，5mM EDTA, 0.1% PVP,0.1%聚蔗糖(Ficoll)，1% BSA和500 μ g/ml变性鲑鱼精子DNA的溶液中预处理6小时。杂交在相同的溶液中进行，稍作下列修改:0.02% PVP,0.02%聚蔗糖(Ficoll)，0.2%BSA,100 μ g/ml鲑鱼精子DNA，10% (重量/体积)硫酸葡聚糖，和5_20X IO6CPM 32P标记的探针。滤纸在杂交混合液中40° C孵育18-20小时，然后在含有2X SSC，25mM Tris-HCl (pH7.4)，5mMEDTA和0.1%的SDS的洗涤液中55° C洗涤1.5小时。更换洗涤液后在60° C培养1.5小时。过滤器干燥后放射自显影。如果有必要，滤纸第3次在65-68°C洗涤。重新放射自显影到胶片。本领域熟知的低严格性条件也可以在本发明中采用。(如使用的跨物种杂交)。本发明也提供与PlyA核酸杂交的核酸(例如，一个序列如SEQ IDNO:1所示，或它的反向互补序列，或衍生物及其在高严格度条件下的反向互补核酸序列)。通过样品但不限于样品，设置高严格度条件的程序如下。含有DNA的滤纸在6XSSC 50mM的Tris-HCl (pH
7.5)，ImM 的 EDTA,0.02% 的 PVP, 0.02%聚蔗糖(Ficoll)分离，0.02% BSA 和 500 μ g/ml 变性鲑鱼精子DNA的缓冲液中65°C预杂交8小时到过夜。滤纸中含有100 μ g/ml变性鲑鱼精子DNA和5-20X 106CPM32P-探针的预杂交混合物在65°C杂交48小时。在含有2XSSC，0.01% PVP，0.01%聚蔗糖(Ficoll )，和0.01%的牛血清白蛋白溶液中37°C清洗滤纸I小时。然后在显影前用0.1XSSC 50°C洗45分钟。其他在本领域熟知的高严格度条件都可以用于本发明。本发明也提供与PlyA核酸杂交的核酸(例如，序列如SEQ IDNO:1所示，或它的反向互补序列，或衍生物编码的核酸及其在中等严格度条件下的它的反向互补核酸序列)。如但不限于以下中等严格度程序条件:固定DNA的滤纸在包含6 X SSC，5 XDenhardt’ s溶液，0.5% SDS和100微克/毫升变性鲑鱼精子DNA的溶液中55° C预处理6小时。杂交在包含5-20 X IO6CPM32P标记的探针的同样溶液进行。滤纸在杂交混合液中55° C孵育18-20小时，并在含有I X SSC和0.1 % SDS溶液中60°C洗涤30分钟，洗2次。滤纸吸干后放射自显影。滤纸在含有2 X SSC，0.1 % SDS溶液中37° C洗涤I小时。其他本领域常用的中等严格度条件也适用(例如，SambiOOk等，1989，分子克隆实验手册，第2版，冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港实验出版社，冷泉港，纽约；奥苏贝尔等编辑，最新分子生物学实验室技术手册，1987-1997年。1994-1997年约翰.威利父子公司)。这里所说的“蛋白质”和“多肽”是可以互换使用的。一般描述本发明提供说明A组链球菌特异的噬菌体细胞裂解酶(PlyA)A25的核酸和蛋白序列的方法，特别是对对A组链球菌，以及这些核酸和多肽序列诊断和治疗的用途。本发明提供的PlyA全长核酸序列如SEQ ID N0:1所示。SEQ ID NO:2的序列分析说明:与链球菌属噬菌体中的推断的细胞裂解酶具有80%的同源性(图2)，是SEQ ID NO:2和此前披露的细胞裂解酶间最高序列同源性。通过与其他酶比对，进一步分析噬菌体A25的DNA，发现了四个功能域，两个“CPL-7”功能域被认为与调解底物结合有关。以往的研究表明，细胞裂解酶的治疗能力与单个细胞裂解酶消除链球菌的定殖能力有关(Nelson 等，2001 ，Proc.Nat.Acad.Sc1.USA.98:4107-4112)。本文提供的序列数据可以用来作为开展诊断和治疗用途的工具。设想PlyA可用于治疗或预防细菌感染，也包括执行具有治疗效果的PlyA多肽的有效数量。因此，本发明的另一个部分提供了诊断致病性链球菌感染的方法。在一个具体实施方式
中，可能含有A组链球菌细胞的临床样品与此处提供PlyA多肽一起预处理。如果样品中存在的A群链球菌细胞，临床样品的预处理裂解了 A组链球菌细胞，使细胞裂解成分可在检测中作为抗体。—种致病性链球菌感染的诊断方法，可包括:a)提供可能含有链球菌的患者样品；b)样品与PlyA多肽接触；和c)检测样品中存在A族链球菌分析物，其中，待测样品中的存在A组链球菌，表明主体感染链球菌。在一个部分，PlyA多肽包括的氨基酸序列与SEQIDNO:2的同源性大于80%，85%，90%，95%，98%，或99%。在另一个部分，PlyA多肽包括SEQ ID NO: 2所述序列。诊断测试格式，包括酶联免疫吸附试验，横向流动检测，或放射免疫法，都可用于本发明。在这些格式，可以直接利用PlyA蛋白或可准备抗体等蛋白质，如试剂盒所示用于以监测病人样品中存在的致病性链球菌。酶联免疫吸附试验或放射免疫法的程序是本领域技术人员熟知的。
本发明的一个部分，提供了致病性链球菌感染的诊断方法。在优选的实施方式中，PlyA或一个片段包含一个结合域，如用化学荧光或蛋白质标记，然后标记的PlyA直接与可能被致病性链球菌感染的主题分离的样品孵育。观察到样品中的荧光表明存在致病性链球菌感染。一个进一步的实施方式中提供PlyA或包含一个结合域的一个片段的用途，在荧光素-荧光素酶检测中帮助诊断致病性链球菌感染。在本实验方式中，可能含有致病性链球菌的样品直接与PlyA或包含一个结合域的一个片段培养。如果样品中含有致病性链球菌，PlyA或包含一个结合域的片段将与细菌结合，导致细菌裂解，释放通常存在细菌细胞质的ATP或其他组件，如酶。然后裂解液用荧光素-荧光素酶检测。在另一个实施方式中，可能含有致病性链球菌的样品可和荧光素-荧光素酶一起直接添加到PlyA或含有一个结合域的片段中，无需在加入荧光素-荧光素酶前收集细胞裂解液。如果样品存在致病性链球菌，从裂解细菌释放的ATP会引发荧光素-荧光素酶系统的阳性反应，导致从反应混合物中释放可检测的光。在本发明的进一步实施方式中，PlyA作为一个药物组分和适宜的药物载体一起用来处理细菌感染，包括有致病性A组链球菌引起的感染。设想包括PlyA的药物组分能治疗哺乳动物的链球菌感染，包括但不限于人类。在进一步实施方式中使用物组分专门治疗组A族链球菌感染，包括链球菌咽炎(“咽喉炎”)，急性风湿热，风湿热，猩红热，急性肾炎，坏死性筋膜炎。一个进一步实施方式，包括PlyA的药物组分用于治疗人类疾病。本发明的另一个部分用于制备特异的PlyA抗体。在优选的实施方式中，抗体是PlyA或亚基或片段的特异单克隆抗体。在一个进一步的实施方式中，抗体是多克隆抗体，来自小鼠，大鼠，豚鼠，兔子，山羊，绵羊，马，猪，牛，或任何本领域常用的其他制备多克隆抗体的哺乳动物。在另一个实施方式中，抗体可以是嵌合抗体，人源化抗体，单链抗体或片段。在一个进一步的实施方式中一个持续繁殖细胞系产生一种PlyA或生物活性亚基或片段特异的单克隆抗体。诊断作用因此，本发明的另一个部分提供了致病性链球菌感染的诊断方法。在一个具体实施方式
中，可能含有A组链球菌细胞的临床样品与此处所述的PlyA多肽预处理。如果样品中存在的A组链球菌，细胞临床样品的预处理裂解了 A组链球菌，使细胞裂解组分作为抗体用于检测。可用于本发明的诊断测试方式，包括酶联免疫吸附检测，横向流动检测，或放射免疫法检测。在这些方式中，可以直接利用PlyA蛋白或需要准备文中所述蛋白质的抗体，如试剂盒中所述的方法来监测病人样品中存在的致病性链球菌。酶联免疫吸附检测法或放射免疫法的程序是本领域的技术人员熟知的。在一个实施方式中，可以用如化学荧光或荧光蛋白标记PlyA的结合域，然后标记的PlyA，直接与可能含有致病性链球菌的样品孵育。观察到样品中的荧光(或其他检测底物结合)表明存在致病性链球菌感染。案例也提供了用PlyA在荧光素-荧光素酶检测中诊断致病性链球菌感染。在本检测方式中，可能含有致病性链球菌的样品可直接与PlyA共培养。如果样品中含有的致病性链球菌，PlyA将与细菌结合，导致细菌的裂解，然后释放ATP或其他通常存在于细菌细胞质的组分，如酶。然后用荧光素-荧光素酶检测裂解液。在进一步实施方式中，可能含有致病性链球菌的样品同时和突光素-突光素酶一起直接添加到PlyA中，无需在添加荧光素-荧光素酶前加收集裂解液。如果是样品中存在致病性链球菌，从裂解细菌释放的ATP会引发荧光素-荧光素酶检测系阳性反应，从反应混合物中产生可检测的光。在进一步实施方式中，被PlyA裂解的链球菌释放出的任何其他细胞质标记物，酶，蛋白质，细胞壁片段，或碳水化合物也可以用本领域其他任何常用检测方法检测。另外，本发明的一个实施方式中，可以用PlyA多肽或亚基或片段的抗体，该抗体被标记后(如用荧光或其他已知的荧光蛋白或化学物)，耦合到噬菌体蛋白，与测病人样品中的特异的细菌蛋白质结合，从而协助致病性链球菌的检测。多肽可直接标记后用于检测病人样品中存在的致病性链球菌。可用于本发明的进一步的诊断测试方式，包括酶联免疫吸附检测或放射免疫法。在这些方式中，可以直接利用PlyA蛋白或准备文中所述蛋白质的抗体，如在试剂盒中所述方法监测病人样品中存在的致病性链球菌。酶联免疫吸附检测法或放射免疫法的程序是本领域的技术人员熟知的。本发明的另一个部分提供致病性链球菌感染的诊断方法，包括:a)收集可能感染链球菌的患者样品；二)样品与荧光标记的PlyA接触；和c)测量与样品结合的荧光多肽的数量，其中有能检测到结合的荧光表明样品中存在链球菌。本发明的另一部分提供了一个检测样品中链球菌的方法，包括:a)收集可能感染链球菌的患者样品山)样品与PlyA共培养；c)收集细胞裂解液，d)细胞裂解液与荧光素-荧光素酶共培养；和e)测量产生的光的强度，其中产生的光强的增加，表明样品中存在的链球菌。本发明的另一部分还提供了一个样品中链球菌的检测方法，包括:a)收集可能感染链球菌的患者样品；b)在样品中加入荧光素-荧光素酶和PlyA ；c)测量产生的光强，其中产生的光强增加，表明样品中存在的链球菌。本发明的另一部分还提供了`产生PlyA或亚基或片段的抗体的方法。抗体可以是多克�。タ寺】固澹逗希嗽椿虻チ戳纯固�。抗体可以在小鼠，大鼠，豚鼠，兔子，山羊，绵羊，马，猪等动物上产生。这些抗体可用于鉴定和分离与PlyA结合的链球菌细胞壁的组分。这些抗体其他的用途是调动PlyA到Biacore芯片来开展与链球菌细胞壁结合的PlyA其结合位点的亲和力或动力学研究。本发明的另一个部分是用PlyA裂解感染的链球菌，释放链球菌的DNA。这些释放的DNA，可以用来PCR分析，鉴定链球菌。本发明的一个更具体的实施方式是检测一个样品中的致病性链球菌的方法，包括:a)收集可能被链球菌感染的病人样品；b)把PlyA加入到样品中直到观察到细菌的裂解；c)从裂解细菌中分离DNA; d)利用分离的DNA准备一个可用于分析和鉴定的病人样品中存在链球菌的标记。治疗的用途本发明另一部分也提供利用PlyA多肽(细胞裂解酶)治疗细菌感染或预防体外和体内细菌细胞生长的方法。本发明的功用之一是利用PlyA多肽(细胞裂解酶)治疗由链球菌引起的感染或防止链球菌的生长，尤其是A组链球菌。本发明的另一个作用也可以用PlyA细胞裂解酶作为去污剂。本发明的也提供利用PlyA多肽(细胞裂解酶)治疗细菌感染或预防体外和体内细胞生长的方法。本发明的功能之一是利用PlyA (细胞裂解酶)多肽治疗由链球菌引起的感染或防止链球菌的生长，尤其是A组链球菌。本发明的另一个作用也可以用PlyA细胞裂解酶作为去污剂。在一个进一步的实施方式中通过放置包含有效剂量PlyA和载体的药物组分来释放PlyA到嘴、喉咙或鼻腔，这样可预防或治疗上呼吸道感染。首选的是，PlyA在适宜的有活性的PH值环境。如果一个人与有上呼吸系统疾病的人接触，PlyA将依附在粘膜衬里，防止感染细菌的定殖。应用的方式包括但不限于，直接的，间接的，载体和特殊的手段或任何相结合的方式。PlyA可以通过鼻腔喷雾剂，滴鼻剂，鼻软膏，洗鼻，鼻注射，鼻包装，支气管喷剂和吸入直接应用，或通过使用润喉糖，或通过使用漱口水或漱口水间接使用，或通过药膏涂抹到鼻孔，鼻梁，或在脸上或任何以上组合或其他类似的方法。PlyA剂量的限制的方式，包括但不限于锭剂，粒剂，糖果，注射剂，含片，片剂，粉剂，喷雾剂，液体，软膏，和气雾剂。PlyA做成锭剂，片剂，或含片时可能会添加糖，玉米糖浆，各种染料，非糖甜味剂，香料，任何粘合剂，或上述的组合。同样，任何口香糖的产品可能含有阿拉伯胶，棕榈蜡，柠檬酸，玉米淀粉，食用色素，香料，非糖甜味剂，明胶，葡萄糖，甘油，胶基，虫胶，糖精钠，糖，水，白蜡，纤维素，粘合剂等，及其组合。含片可能还进一步包含蔗糖，玉米淀粉，阿拉伯胶，胶黄蓍胶，茴香脑，亚麻籽，油树脂，矿物油，纤维素，粘合剂，及其组合。在本发明的另一个实施方式中，食糖替代品使用中的葡萄糖，蔗糖或其他糖类。PlyA也可以放在鼻喷雾剂中，这里的鼻喷雾剂是载体。喷鼻剂能长效或长期释放喷雾，制造方法在本领域是熟知的。也可以通过吸入使PlyA能进一步下降到支气管道，包括进入肺部。另一个组分和PlyA的用处是治疗或预防皮肤烧伤和伤口的细菌感染。组分包括有效数量的PlyA和载体来释放PlyA到受伤的皮肤。PlyA的使用方式可以有很多类型和很多载体组合，包括但不限于亲水性液体，酒精类液体，水溶性凝胶,乳液,软膏,疏水性液体底物，矿物油底物，融合的矿物油和凡士林，羊毛脂，脂质体，蛋白质，如血清白蛋白或明胶，纤维素粉和上述的组合。载体的释放方式包括治疗剂包括但不仅限于涂抹，喷雾，缓释片，液体吸收擦，及其组合。PlyA可直接用于绷带上或在其他载体中的一种上。出售的绷带可以使潮湿或干燥，PlyA以冻干形式在绷带上。此方法对治疗烧伤最有效。在一个进一步实施方式中，PlyA的杀菌活性是令人满意的，PlyA可以单独或与一个或多个附加的治疗化合物联合治疗。在优选的实施方式中，PlyA可以治疗人类的细菌感染(例如，减轻症状或延缓发病或减缓发病进展)。一个实施方式是用来治疗链球菌咽炎。一个进一步实施方式说明PlyA细菌裂解酶可用于非人类哺乳动物或人类。可以设想一个实施方式即，PlyA可用于治疗被链球菌感染哺乳动物，包括人类和非人类的哺乳动物，在这种情况下没有谁会继续用抗微生物治疗的传统模式。设想PlyA可用于去污。设想PlyA也可与其他裂解酶或与其他抗生素或抗微生物治疗的形式一起进行治疗。在做人类试验前，PlyA的治疗用途可以用合适的动物模型系统测试，包括但不限于大鼠，小鼠，鸡，牛，马，猴，兔等。在用于人类测试前的活体试验，可以在本领域技术人员熟知的任何的动物模型系统中进行。在一个实施方式中，PlyA在非人类的动物中测试(例如，小鼠，大鼠，猴，兔，豚鼠)，优选的非人类动物模式是能感染链球菌疾病的动物模型。根据这个实施方式，PlyA可用于动物，而在微生物水平上PlyA的效果是在受感染的动物中被确定的。可以从PlyA处理后动物或动物组获得的细菌与用对照核酸或蛋白质处理的动物或动物组获得的细菌进行对比，来鉴定PlyA的效果。另一个实施方式中，调节PlyAs活性的测试化合物可以在受链球菌感染的人类中被鉴定。按照这个实施方式，测试化合物或对照化合物和PlyA —起加入人类，测试化合物要么减少微生物感染的蔓延，要么消除细菌感染或改善病症。治疗和预防性试剂以及他们的用途本发明提供的治疗方法，包括对主体施用有效数量的PlyA。在优选的方式中，PlyA被实质的纯化(例如，实质上不含有限制其活性的、或产生不想要的副作用的物质)。主体最好是动物，包括但不限于如猴子，牛，猪，马，鸡，猫，狗等动物，最好是哺乳动物，最优选的是人类。在一个具体实施方式
中，主体是一个非人类的哺乳动物。在另一个具体实施方式
中，主体是人类哺乳动物。用来施用PlyA的各种已知的给药释放系统，如包封在脂质体、微球或微囊中。导入方法可以在肠内或肠外，包括但不限于皮内，肌肉注射，腹腔，静脉注射，皮下注射，滴鼻，硬膜外，外用和口服。组分可通过任何方便的途径施用，例如通过滴注或推注，通过上皮或粘膜衬里(例如，口腔粘膜，直肠及肠道粘膜等)的吸收，也可以与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身或局部的。此外，本发明的药物组分可以用任何适宜的途径被引进中枢神经系统，包括脑内和鞘内注射，脑室导管可用于脑室注射，例如，连接到一个蓄水池。肺部施用可以通过如吸入器或喷雾器，和制定一个雾化器进行。在一个具体实施方式
中，本发明的药物组分可以按想要的方式局部施用与需要治疗的区域，如局部使用于皮肤，可用任何本领域熟知的方法。本发明的另一个部分提供的药物组合物包括用于治疗细菌性感染的PlyA。此外，在一个进一步实施方式中包括一种药物组分用于局部处理细菌感染。另一个实施方式中可能包括一个药物组分用于处理系统感染，或处理那些其他抗生素的无效的感染。

这些组分包括具有治疗有效数量成分，和适宜的药学载体。在一个具体的实施方式中，“适宜的药学上的”是指由联邦监管机构或州政府，或在美国药典或其他普遍公认的药典中列出的机构批准可在动物身上使用，尤其是人类。“载体”是指药物施用时的稀释剂，助剂，辅料，或运输载体。这些药物载体可以是无菌的液体，例如水和油，包括石油，动物，植物或合成油，如花生油，大豆油，矿物油，香油等。药物组合用于静脉注射时水是优选的载体。盐溶液和糖水和甘油溶液也可以被作为液体载体，特别是注射溶液。合适的药用辅料，包括淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，明胶，麦芽，大米，面粉，粉笔，硅胶，硬脂酸钠，甘油单硬脂酸酯，滑石，氯化钠，脱脂奶粉，甘油，丙二醇，乙二醇，水，乙醇等等。组分，如果需要，也可以含有少量的润湿或乳化剂，或PH缓冲剂。这些成分可以以溶液，混悬剂，乳剂，片剂，丸剂，胶囊剂，散剂，缓释制剂等形式。组分也可以制定为栓剂，用传统的粘合剂和载体，如甘油三酯。口服制剂可以包括标准载体，如甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素，碳酸镁等。在E.W.Martin的“雷明顿的医药科学”中描述适合制药载体的例子。这些组分将包含治疗有效数量的噬菌体A25核酸或PlyA的，最好是纯化过的形式，和适量的载体，用来为主体提供正确的施用方式。药物形式需要适合施用的方式。在优选的实施方式中，药剂组分是按照适宜人类静脉注射药剂组成的例行程序制作的。通常情况下，静脉注射的成分是在无菌水液体缓冲液。在必要的情况下，成分可能还包括一种溶剂和局部麻醉剂，如利多卡因，以减轻注射部位疼痛。一般来说，成分单独或以单位剂型形式混合在一起，例如，干冻粉或无水装在密封的容器如安瓿或sachette，表明活性剂的数量。药物组分通过输液施用，它可以用包含无菌医药级水和盐的输液瓶来配置。药物组分可以通过注射施用，成分可以在施用前，小瓶注射用无菌水或盐可以用于与药剂成分混合。治疗细菌感染疾病的PlyA的有效剂量是由前面描述的标准的临床技术标准确定的，此外，可采用体外实验帮助确定最佳剂量范围。规定使用的精确剂量依赖于给药途径，疾病或失调症状的严重性，并应根据医生和每个科目的具体情况判定。然而，合适的静脉注射剂量范围一般约20-500微克活性化合物每公斤体重。适合鼻腔给药剂量范围一般约
0.01皮克/每公斤体重到I毫克/公斤体重。有效剂量可以从体外或动物模型试验系统的剂量反应曲线推断。本发明还提供了一个医药包或制药工具包，包括一个或多个容器装有一个或多个本发明的药物组合物。这样的容器可以作为一种标识，以政府机构规定的生产规范、使用或销售药品或生物产品的形式，这种标识也反映了(a)被生产、使用或销售人类药物的机构批准(b)使用说明，或两者兼而有之。在一个具体实施方式
中，本发明的药物组合可以非�：玫挠糜谠谛枰瘟频木植课恢茫纾ü幌抻谠谑质豕讨芯植抗嘧ⅲ植孔⑸洌脊艿姆绞降既耄蛑踩耄饫锼档闹踩肟梢允嵌嗫祝嵌嗫谆蚪鹤次镏剩ぃ鐂ialastic膜，纤维或高分子材料如 Elvax (即 Ruan 等，1992 年，Proc Natl Acad Sci USA, 89:10872-10876)。在一个实施方式中，药物施用可以通过直接注射雾化吸入。在另一种实施方式中,PlyA可以被释放到泡囊,特别是脂质体。(见Langer (1990)科学249:1527-1533; Treat等，脂质体的传染性疾病和癌症的治疗，Lopez-Berestein andFidler(eds.), Liss, N ew York, pp.353-365(1989);Lopez-Berestein, ibid., pp.317-327;同上.)在另一个实施方式中PlyA可以释放在受控的释放系统中。在一个实施方式中，需要一个泵(见 Langer, supra; Sefton (1987) CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201;Buchwaldet al.(1980) Surgery 88: 507 ; Saudek et al.(1989) N.Engl.J.Med.321: 574) 在另一个实施方式中需要用到聚合材料(Medical Applications of ControlledRelease,Langer and Wise(eds.), CRC Pres., Boca Raton,Fla.(1974) ;ControlledDrug Bioavailability, Drug Product Design and Performance,Smolen andBa 11 (eds.), Wiley, N.Y.(1984) ; Ranger and Peppas, J.(1983) Macromol.Sc1.Rev.Macromol.Chem.23:61;see also Levy et al.(1985)Science 228:190;During etal.(1989)Ann.Neurol.25:351;Howard et al.(1989)J.Neurosurg.71:105)。在另一个实施方式中，一个受控制的释放系统放在治疗靶标附近如导气管，从而减少药量，仅为系统用量的一部分(见 e.g., Goodson, in Medical Applications of ControlledRelease (1984) supra, vol.2, pp.115-138)。另一个种可控释放系统在 Langer (1990,Science 249:1527-1533)的综述中有提到。实施例例1.rA 25细胞裂解酶蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化为了在异宗大肠杆菌中帮助表达/纯化的S.pyogenes曬菌体A25的细胞裂解酶，细胞裂解酶基因一般通过基因改造后插入pET25a等C末端有His标记融合蛋白的表达载体。结果A25终止密码子被删除。融合蛋白被允许在假定A25细胞裂解酶的起始密码子编码蛋氨酸残基处起始表达。His标记蛋白允许用N1-NTA层析树脂(Aiagen)来纯化蛋白。该改造的片段首先在非表达载体繁殖，经过DNA确认后，再转移到pET25a载体。为了表达，用含有50微克/ml氨苄青霉素的Terrific Broth培养基在37 °C250rpm过夜振荡培养含PET21A LysNX的大肠杆菌Origami (Novagen)至稳定期。翌日，菌株接种到含有50微克/ml氨苄青霉素的Terrific Broth培养基至0D550nm=0.15。在370C 250rpm振荡培养至0D550nm达到0.6，然后通过加入IPTG至ImM诱导表达rA25细胞裂解酶。继续在30° C，250RPM振荡培养3小时。在2至8° C 7700XG离心15分钟收集细胞。弃上清，沉淀用抽提液洗涤3遍(0.3M氯化钠，NaP0450mM, IOmM咪唑，pH值8.0)，然后在2至8° C 6000XG离心10分钟。弃上清，如上所述洗涤2次以上。第三清洗后，弃上清，沉淀储存于-20° C备用。为了超声破碎，用含有ImM PM SF的1/40细菌菌液体积的预冷抽提缓冲液重悬冷冻的细胞沉淀。细胞悬液在冰上用布兰森Sonifier450超声，共7个周期(一个周期为4分钟脉冲，占空比 30%，设置输出脉冲3)。完全超声破碎后，悬浮液在2-8° CIO, 000XG离心25分钟。根据生产说明，倒出上清与N1-NTA树脂SUPERFLOW (QIAGEN)混合用来大量纯化。混合液在4° C轻轻振荡2小时。柱子用提取缓冲液预洗一次。混合物上柱，用洗涤缓冲液(0.3M氯化钠，50MM财04;，和20mm咪唑，pH值8.0)洗净，rA25用洗脱缓冲液(0.3M氯化钠，NaP0450MM和250MM咪唑，pH值8.0)洗脱。洗脱液在KEB缓冲液中透析(KEB:0.1MKP04，EDTA的5丽，3丽β-ME公司，pH值6.7)，透析后，从导管中流出的洗脱液变澄清，然后浓缩至约10mg/ml。通过SDS-PAGE判断纯度。例2.rPlyA处理A组链球菌释放A抗原,启动特异检测A组抗原横向流动检测。经过处理后，A组链球菌用于特异检测A组抗原的横向流设备。715:78图6的结果如下所示:泳道1:无产物；泳道2:5 微克的 rPlyA/08.08 ；泳道3:15 微克的 rPlyA/D ；泳道4:5微克的rPlyA/08.08，没有A组链球菌；泳道5:泳道2的重复；本实验结果表明，rPlyA能在本测试形式中检测A组链球菌。以前没有出版物报道A组特异噬菌体中具有适宜的细胞裂解酶有此用途。可采用重组rPlyA来促成这类实验；利用天然的细胞裂解酶需要相当多的复杂的蛋白质纯化，这将不适于工厂化生产。例3.噬菌体A25中的细胞裂解酶基因细胞裂解酶基因包含在噬菌体A25的基因中，其DNA序列尚未披露。为了识别和分离细胞裂解酶基因，进行了许多实验包括标准的重组DNA、PCR和比较基因组学等。完整的1446bpDNA序列被确定。然后编码的细胞裂解酶作为重组蛋白在大肠杆菌中的表达，纯化得到。纯化的细胞裂解酶进行生化功能评估，具有快速溶解活体A组链球菌被确定。然后用A组链球菌对其性能进行了体外免疫诊断评估测试。例4.实验分离抗菌素 DNA (618:61)O Qiagen QIAamp 小量试剂盒.
用Qiagen QIAamp小量试剂盒纯化的澄清的A25噬菌体上请液中提取DNA。上请液用DNaseI (20g/ml)处理15分钟，然后在18000Xg离心5分钟。上请液中加入EDTA至20mM，然后用与Qiagen溶液等体积的50ug/ml的蛋白酶K在56° C处理10分钟。然后按照说明书纯化DNA。O HindIII 酶切(618:62)纯化的A25噬菌体DNA用限制性内切酶HindIII酶切，酶切后DNA用琼脂糖凝胶电泳分析，用报道过的相似方法(Pomrenke和Ferretti)检测4、10和17Kb的片段。〇克隆HindIII酶切片段；DNA部分测序来自A25的HindIII酶切片段与载体Pucl9DNA重组后在大肠杆菌中繁殖。DNA序列终止由互补到PUC19的引物侧翼序列决定。例5.A25细胞裂解酶的体外杀菌活性。细胞裂解酶活性通过修改过的浊度还原法确定的(Fischetti VA等，1971，5月IH ;133 (5): 1105-17)。A组链球菌菌株12204在Todd-Hewitt培养基生长到静止期或对数期时，离心并用含有0.005M EDTA pH 6.70.05M磷酸盐缓冲液洗一次。洗过的细胞重悬浮在同样的缓冲液中至0D600 (分光光度计)约为0.3。细胞裂解酶活性测定在室温有盖微孔板中进行。氯仿敏感的A组链球菌菌株12204适宜作为噬菌体细胞裂解酶活性测定的材料。根据已报道的方法稍作修改准备细胞壁(Hill JE and Lff Wannamaker 1981J.Bact.145:696)。在L3肉汤培养物中加入5% (体积/体积)氯仿在37°C振荡培养3个小时。细胞悬液缓慢从氯仿中倒出，细胞沉淀用含有0.005M EDTA和3mM 2-巯基乙醇(pH值6.7)的0.1M磷酸盐缓冲液重悬。裂解的细胞悬液调整到分光光度计浓度约0.2用于细胞裂解酶活性测定。细胞裂解酶裂解细胞测定在37°C微孔板进行。用如上所述的浊度测定法来检测其他细菌对A25细胞裂解酶的裂解敏感性。对下列细菌没有检测到的裂解活性:金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，奈瑟氏菌属。rA25的细胞裂解酶活性也可以用A组链球菌的ICT设备检测，ICT设备依赖于裂解酶的能力来快速裂解A组链球菌从而提取可被ICT检测的足够多的抗体信息的设备。例6.实验已确定来自不同的噬菌体的细胞裂解酶基因序列(它们之间的相似程度不一)。从A25基因组中找到一个基因，该基因编码一个蛋白质，该蛋白质与已测序的一个细胞裂解酶非常相似，方便识别。在公共互联网数据库中许多这些序列都是可以得到的。目前主要的阻碍是还未报道这些噬菌体DNA基因组序列。克服这个阻碍的策略是分离所有噬菌体基因组的片段，来确定它们的DNA序列。然后在另一种噬菌体的Internet数据库搜索比对相关序列。假定A25噬菌体的序列顺序与那个噬菌体的相同，然后根据一般(如限制性内切酶图谱)途径来鉴定的可能片段如细胞裂解酶基因。
在Pomrenke ME和Ferretti JJ.测定的链球菌A25和Cl的噬菌体基因组物理图谱中，(基本微生物学杂志，6，395-39829 (1989))据报道噬菌体A25的DNA已经被分离，已经确定了几个限制性内切酶(EcoRI，Aval，HindIII)疑是酶切位点。基于这一分析，噬菌体基因组的大小可能有34600个碱基对。当我们用这些酶酶切纯化的A25噬菌体DNA时，仅有HinddIII酶切方式与报道类似。我们继续用分子克隆分离这些DNA片段，如重组DNA方法(rDNA)。然后，我们用这些片段中的部分DNA来鉴定上面列出的互联网数据库中的相关噬菌体pUC19载体中的质粒PA25H4包含一个4KB的酶切片段。4kb片段的末端测序，随后BLAST分析，结果说明两端的最佳配比(_ 70% )是肺炎链球菌噬菌体MM11998 (入序列号# DQ113772)，其完整的基因组序列已被确定。一个结果是，比对的一端为MM11998坐标20959的“次要衣壳”的蛋白质。另一个结果是，比对为MM11998坐标25205的“卷尺”蛋白质基因中。而且在MM11998的两端位点的距离也是4Kb，基于这大于4KB的相似性，推测噬菌体A25的基因组与丽11998的基因组类似。在噬菌体丽11998中，细胞裂解酶基因接近于终点的“右边”，从而指导获得相应的rDNA的研究方向。假定(基于Pomrenke和法拉)噬菌体A25的右末端也是HindIII的IOKB酶切片段的末端。这个片段在大肠杆菌中的载体PUC19的扩繁后，像质粒PA25H10—样，如上所述方法获得这个片段的末端基因序列。DNA序列的一端被确认有HindIII的酶切位点的一端，与插入PA25H4末端的“卷尺”基因同源。因此，在噬菌体A25基因组中，在pA25H4中的IOKBHindIII酶切片段与4KB片段毗邻。然而，DNA序列的另一个末端不是含噬菌体末端的细胞裂解酶基因，而是另一个HindIII酶切位点。BLAST这个片段，与MMl 1998没有任何同源性。然而，最好的同源性，虽然弱，是与GAS原噬菌体中穴蛋白前面的区域。因为大多数噬菌体基因组的穴蛋白与细胞裂解酶基因毗邻，因此制定了分离可能小，可能为DNA末端区域的毗邻序列的方法。由于在推测的噬菌体A25末端附近有一个意想不到的HindIII酶切位点(Pomrenke和法拉没有预测到)，筛选能切开pA25H10中的IOKB片段的候选酶，用分子克隆方法分析酶噬菌体的末端片段。限制性内切酶NheI被选定，可能会酶切产生约2KB适宜大小的末端片段。当噬菌体A25的NheI酶切片段的克隆后，质粒pNhe7被鉴定。pNhe7的DNA序列说明这个片段的一个末端是已经在PA25H10中的预期片段。然而，不幸的是，这个片段的另一端是另一个NheI酶切位点，而不是噬菌体末端。但这部分包含了可能的细胞裂解酶基因(根据BLAST分析)的一部分，编码一个130个氨基酸残基的N-端。为了分离A25细胞裂解酶基因的其余部分，使用了 “PCR-步行”方法。在此方法中，假设与目标片段毗邻的片段继续与相关的同源基因同源。从同源片段的最保守区域设计引物(BLAST分析)，假定该同源片段也将包含同样多的毗邻区域的DNA。另一个引物源自已经分离的片段序列。BLAST分析A25细胞裂解酶的N-末端，发现最保守的同源物为SpyM3_1096连锁位点，在化脓性链球菌的基因组MGAS315 (补充1139031..1140245序列号# AE014074.1)中编码一个假定的细胞裂解酶基因。BLAST分析SpyM3_1096的C-端区域，发现其细胞裂解酶基因的下游有一个区域在几个其他GAS原噬菌体中相应位置是保守的。那么在噬菌体A25中该区域也是保守的，因此根据该保守区域设计PCR引物。用这个引物和真正的A25细胞裂解酶基因引物(来自pNhe7中的序列)对噬菌体A25进行了 PCR (降温)。PCR产物在质粒的pEl中扩繁。对质粒pEl进行DNA测序发现，它包含A25细胞裂解酶基因序列的毗邻序列，但不是细胞裂解酶基因的末端序列。因此，对pEl中的A25细胞裂解酶基因中的片段进行BLAST分析后，继续用步行的PCR方法来扩增。与这个细胞裂解酶基因大片段最具有同源性的基因为链球菌噬菌体SMP的细胞裂解酶基因(序列号# ABK91888.1)。因此BLAST分析SMP细胞裂解酶基因C-末端序列和保守区域的侧翼序列，用SMP细胞裂解酶基因的侧翼序列直接设计引物来扩增A25细胞裂解酶基因的其余部分，结果证明这非常有用。用质粒PC扩繁包含A25完整的细胞裂解酶基因的PCR产物。最后源自噬菌体基因组的完整的细胞裂解酶基因经过酶切后被完整的克隆鉴定。已报道的细胞裂解酶基因序列也用这个分子克隆验证。`
权利要求
1.一个被分离的多肽包括与SEQ IDNO:2相似性大于80%的氨基酸序列，其中，该多肽具有细胞壁裂解活性。
2.一个被分离的核酸包括，与SEQ ID NO:1的序列相似性大于80%的核酸序列，该核酸序列编码一个具有细胞壁裂解活性的多肽。
3.诊断致病性链球菌感染的方法，包括:a)提供可能含有A组链球菌的病人样品；b)样品与有效数量的PlyA多肽接触，裂解可能存在样品在中的A组链球菌；c)检测样品中A组链球菌分析物的存在与否，其中，样品中存在A组链球菌分析物说明主体存在链球菌感染。
4.根据权利要求3的方法，其中，PlyA多肽包含一种氨基酸序列，其与SEQID N0:2的序列同源性大于80%。
5.根据权利要求4的方法，其中，PlyA多肽包含SEQID NO:2序列。
6.诊断致病性链球菌感染的方法，包括:a)提供可能含有A组链球菌感染的病人样品；b)样品与PlyA多肽接触；c)检测是否存在与PlyA多肽结合的Ply底物，其中，如果存在，那么检测结合可以表明在样品中存在链球菌感染。
7.根据权利要求6的方法，其中，PlyA多肽包含一个氨基酸序列，与SEQID N0:2的序列相似性大于80%ο
8.根据权利要求7的方法，其中，PlyA多肽包含SEQID N0:2的序列。
全文摘要
本发明涉及一个噬菌体A25的细胞裂解酶基因的鉴定、测序和分离的方法。该基因表达一个用来裂解噬菌体生命周期中细菌细胞的蛋白质。本发明也进一步说明了用裂解酶裂解某种细菌的方法，该方法在检测这些细菌的诊断过程的实例中也非常有用。
文档编号G01N33/50GK103080307SQ201180005501
公开日2013年5月1日申请日期2011年1月25日优先权日2010年1月25日
发明者B·蒙梅罗, W·J·帕林, N·图卡特申请人:美艾利尔斯卡保罗有限公司

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A25噬菌体溶解酶的制作方法