专利名称：用物质加减法对质谱判断滞留层析中蛋白指纹的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的生物样品中蛋白质分析方法，具体指用于生物样品分析的蛋白指纹法。本发明还涉及用滞留层析法捕获蛋白质组并采用计算机可读取的条码格式(蛋白指纹)分析的蛋白指纹法。所述的条码格式(蛋白指纹)，其条码带(分子量)意义的确定采用了加减法，即加入或减去某种物质来确定其质谱分子量的意义。蛋白指纹法确定某生物样品在第一和第二(加入或减去某种物质)样品中蛋白指纹差异两种蛋白指纹图的差异条码带肯定了其分子量在生物样品中的临床意义，从而判断每一条码带中单一蛋白指纹的意义。
背景技术：
不论是细胞的正常功能还是病理特性都在一定程度上取决于细胞所表达的蛋白质功能。因此，鉴定细胞内表达的蛋白质的区别，可用于诊断疾�。⒆钪沼糜谝┪锟⒑图膊≈瘟�。而要进行蛋白质表达和功能的差异化分析，要求能够达到分辨细胞内分子的复杂混合物的程度。但细胞内许多物质往往以微量存在，目前用于分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用这些常规手段难以进行定性鉴定和定量分析。
如，一种常用的分子分离方法是凝胶电泳。通常是用凝胶内等电点聚焦先分离蛋白质，再用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳进行第二次分离。结果得到一张根据等电点范围(净电荷)和大小(质量)来区分蛋白质的图。虽然有用，但是该方法存在以下几方面的局限。首先，该方法只提供生物分子的两项特征—质量和等电点(pl)。其次，各维度的分辨率受到凝胶分辨能力的限制。例如，通�：苣亚种柿坎钜煨∮�5％或pl差异的生物分子。第三，凝胶的容量和灵敏度都有限，可能无法检测出少量表达的生物分子。第四，无法观察到分子量低于约10-20kDa的小蛋白或小肽。
又如，临床诊断疾病一般方法是要求特异性地检测出疾病的已知标记。但是，制备特异性结合标记并且能在复杂的混合物中鉴别出标记的试剂需要大量时间，这阻碍了此类诊断方法的发展。
其它分析方法可能克服以上局限之一或几项，但是难以将它们有效组合。例如，分析层析能够根据多种分析物/吸附剂相互作用来分离生物分子，但是作多维度分析却困难而费时。而且，该方法的灵敏度也很有限。
用质谱的方法测定蛋白质是较新的方法。但没有与滞留层析法联合应用时，质谱分析方法只能对蛋白质进行定性分析，无法进行定量分析，尤其在是样品中混合物复杂，蛋白质含量极小的情况下。
蛋白指纹技术最早源于马铃薯/土豆品种鉴定(Desborough S and Peloquin SJ，American Potato Journal.45，220-229；1968 and Desborough S and Peloquin SJ，Theoretical and Applied Genetics.39，43-47；1969)。当时用电泳技术来区别分不同品种土豆。因为不同品种的土豆在电泳下有不同的蛋白指纹组合。由于人体细胞蛋白比土豆要复杂的多，故仅用电泳来鉴别疾病的蛋白指纹远远不能满足临床需要。
滞留层析法是上世纪90年代开发的一种新的生物分析方法(Singh TK，Fox PF，HealyA.J Dairy Res.62，629-640；1995 and Siegel MM，Tabei K，Bebernitz GA，Baum EZ.J Mass Spectrom.33，264-273；1998)，有人将其用于分子生物学和细胞生物学的研究中。滞留层析中先将待测样品与选定的吸附剂结合，然后检测滞留在吸附剂上的分析物。与常规层析不同，进行滞留层析时无需将分析物先从吸附剂上洗脱，而是直接进行检测。滞留层析与质谱联合应用其优点是能够从复杂的样品混合物中准确地分辨出分析物分子量。并且能够根据分子量大小将生物样品组成按条码格式排列。用滞留层析法可以将血清蛋白排出成千上万条分子量带。但目前人血液中只有289个蛋白分子量可以被临床应用，未见到文献有用滞留层析法进行蛋白指纹鉴定分析并且解读出成千上万条分子量带的方法学(Anderson NL and Anderson NG，Molecular & Cellular Proteomics 1845-867；2002)。
发明内容
本发明的目的是建立一种确定某生物样品在第一和第二样品中蛋白指纹差异存在的意义。包括A)测定生物样品在第一样品中至少一种选择性条件下的第一蛋白指纹图；B)测定生物样品在第二样品中(减去某种物质某种特异性单克隆抗体柱子处理过的，或加入某种物质)相同选择性条件下的第二蛋白指纹图；和C)比较第一和第二蛋白指纹图之间的差异。利用加减物质法来判断两种蛋白指纹图的差异条码带肯定了分析物在样品中的临床意义，从而判断每一条码带中单一蛋白指纹的意义。
本发明采用蛋白指纹法对蛋白质组进行鉴别。
蛋白指纹法是通过鉴别检测特定的蛋白质组用于疾病诊断。蛋白质组学(Proteomics)的定义是研究一组蛋白质在细胞终身表达的变化状态。蛋白质组学的目的之一是鉴定和描述由于不同细胞差异表达的有机生物分子。通过比较表达情况可以鉴定细胞内表达的蛋白质的区别。鉴别出可作为某种疾病标志的蛋白质组，可用于该疾病的诊断及治疗药物的筛选。
本发明所述的鉴别检测蛋白质组的方法是质谱法。
本发明用滞留层析法从复杂的样品混合物中准确地分辨出并捕获到用于检测的蛋白质组。滞留层析法是将样品与用于解吸谱分析的多种吸附剂/洗脱剂组合接触，由此利用其它分离和检测系统所无法达到的高信息分辨能力鉴定在两样品中存在情况不同的分析物(即，两份细胞或组织液提取物中差异表达的蛋白质)。根据吸附剂/洗脱剂组合的化学特性测定包括分子量在内的理化特征的蛋白质。详述本方法如下I吸附剂包含阴离子，阳离子，亲水，疏水或配位共价金属螯合剂作用吸附剂，分离生物化学中的这些方法和由这些方法产生的吸附剂具有捕获生物样品中蛋白质的用途(即阴离子吸附剂捕获阳离子蛋白质，配位共价金属螯合剂上滞留说明多肽分析物内存在组氨酸残基)。更具体的说，可以用阴离子吸附剂捕获生物样品中所有带阳离子的蛋白质，然后用质谱仪去读出分子量(条码带)。
II信息处理在特定洗脱条件下检测被吸附结合的分析物提供了有关样品中分析物及其化学特征的信息。吸附作用在一定程度上取决于吸附剂的结合特性。与吸附剂结合的分析物具有使得结合成为可能性的特性。例如，在特定pH下是阳离子的分子在具有该pH的洗脱条件下将与阴离子吸附剂结合。强阳离子分子只有在很强的洗脱条件下才从吸附剂上洗脱。所以，样品中特定分析物在特定洗脱条件下结合某种吸附剂的确定不仅通过分析物的彼此分离和与不具有结合所需的相应化学特性的分析的分离而分辨了混合物中的分析物，而且鉴定出了具有特定化学特性的一类或单一分析物。采集有关分析物在多种洗脱条件下在一种或多种吸附剂上的滞留信息不仅可详细分辨混合物中的分析物，而且提供有关分析物的化学信息，这些信息本身就可以完成对他们的鉴定。这种数据被称为“滞留数据”。
用可编程计算机分析滞留试验得出的数据是最简单的。计算机程序一般包括一个储存编码的可读介质。某计算机编码进入存储，其中包含了基质阵列上各种征点的位置，该处的吸附和用来洗涤吸附剂的洗脱条件。程序于是可用这些信息鉴定出阵列上确定某选择性的一组特征。计算机还包括这样的编码，它们接受来自探针上特定可定址位置的不同分子量的信号强度数据。这些数据指示所测分析物的数量，可能包括所测各分析物的信号强度和测得的分子量。
计算机还具有处理数据的编码。实施例之一中，处理方法涉及形成一个分析物识别特征概况。例如，可将据分子量测得的特定分析物的滞留数据根据特定的结合特性(例如与阴离子吸附剂)分类。收集到的数据提供某特定分析物化学特征的概况。滞留特性反映分析物功能，后者继而反映结构。例如，根据不同pH洗脱条件下在多种阳离子和阴离子吸附剂上的滞留水平数据所揭示的信息可以得出某蛋白质的等电点。这进而反映出该蛋白质内离子氨基酸的大致数量。所以，计算机可能包含将结合信息转化结构信息的编码。而且，对分析物的二次处理(例如翻译后修饰)改变识别特征，这可以由结合或质量差异反映出来。
得出的数据即蛋白指纹，它可以各种格式显示。一种格式中，信号强度显示成分子量的函数图。另一种格式又称“条码格式”，其中，信号强度沿着线性轴以暗度强度值显示，得出外观类似商场上所用条码带读取商品名称。
III滞留层析分离方法的组合—差异蛋白质展示实施例对该方法进行了详细的描述。生物样品通常包含数以百千计的蛋白质。人们可能希望准确分辨出样品中的每一种靶蛋白。第一步，用多种选择性条件建立靶分析物的滞留图。例如，阴离子吸附剂。
举例，如用阴离子吸附剂，可以将某种pH值状况下的血清中所有带正点的蛋白质捕获至吸附剂上。然后用质谱读出各自的分子量，按分子量大小排列出条码格式。计算机将记住这种条码格式。第二步，将这份血清通过一个单克隆抗体柱子(如抗胰岛素或抗生长激素)，胰岛素或生长激素被捕获并留在柱子上。然后，用上述同样方法去分析，就可以产生没有胰岛素或生长激素的条码格式。
通过分析两种条码格式差异，计算机能够知道某种条码带(分子量)是来自于胰岛素或生长激素。
本发明利用这种方法学，可无限量地解读每种条码带中的肽类、蛋白质或小分子(如血清药物)指纹的意义。
这种方法学可以比目前所有生化诊断手段(ELISA，免疫荧光法)更有优势。
IV鉴定生物材料间差异表达的分析物的方法本发明的另一方面内容提供了鉴定在两种以上样品中差异表达的有机生物分子，特别是蛋白质的方法。“差异表达”指两样品间分析物量或质上的差异。这些差异可能缘于蛋白质表达的任一阶段，该方法利用了滞留层析的超常分辨能力和灵敏度。首先，使用同一组分辨率高、可比较的分析物数量多的制备条件。
然后，比较识别图以鉴定被两组吸附剂差异保留的分析物。差异滞留包括定量滞留。这提示表达的正调控或负调控。差异滞留还包括分析物质的差异。例如，蛋白质翻译后修饰的不同会造成识别图的不同，检测时表现为结合特性差异(例如，如果蛋白质被糖基化与凝集素结合将不同)或质量差异(例如翻译后切割的不同)。这种分析也可以用可编程计算机进行。
本发明提供一种统一的操作系统，用于蛋白质功能，细胞功能和生物整体功能的发现和诊断。
更具体的说，根据分析物在至少两种不同选择条件下吸附固定相的能力(例如阴离子/阳离子，疏水性/亲水性，或特异性生物分子识别作用)在至少两种不同的第一维度上分离分析物。然后，用解吸谱(例如激光解吸质谱)根据质量在第二维度上分离分析物，进一步检测已分离的分析物。分析物所吸附的性质提供了分析物的物理化学信息。
在实施例中，所述的方法包括I)分析物与确切位置上的第一选择性条件(吸附剂)接触，使得分析物被吸附剂保留。II)在第一选择性条件下用解吸谱检测滞留的分析物。III)检测步骤包括用激光解吸质谱测定分析物的质量。
洗脱条件的差异在于pH，缓冲能力，离子强度，水结构特征，除垢剂种类，除垢剂强度，疏水性或介电常数。
本发明提供一种确定某分析物在第一和第二品中是否存在差异(例如差异表达)的方法。该方法可以用于通过差异蛋白质展示来检测差异蛋白表达的组合方法。该方法包括A)测定分析物在第一样品中至少一种选择性条件下的第一滞留图；B)测定分析物在第二样品中相同选择性条件下的第二滞留图；和C)比较第一和第二滞留图之间的差异。两滞留图的差异肯定了分析物在第一和第二样品中的差异存在的意义。
实施例之一是测定某种蛋白指纹在生物样品中的意义。
滞留层析及蛋白指纹方法的具体操作步骤以下是用本发明提供的滞留层析及蛋白指纹方法的一个操作方案实例。
1.样品处理将生物样品稀释在溶液中。视需要离心澄清样品。
2.上样将样品点样在基质(包括阴离子、阳离子、亲水、疏水或配位共价金属螯合剂)一个位点上。
3.洗涤用结合溶剂洗涤。在样品完全干燥前将第一份2μL洗涤溶液加到该位点。洗涤溶液在位点上至少停留15秒。用移液管吸进几次。彻底清除第一份洗涤溶液，用第二份2μL洗涤液重复以上步骤。
用水彻底洗涤整个阵列。
自然干燥吸附剂支持物。
加0.5μL吸能分子SINAPINIC酸(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸的制备的标准溶液)。
自然干燥吸附剂支持物。
用激光解吸/离子化飞行时间质谱仪用氮激光仪(337nm)和80cm飞行管分析阵列分析滞留与各位点的蛋白质。用计算机分析数据进行数据重叠展示。
蛋白指纹图谱的重大意义在于定期监测人体活动或血液中蛋白指纹的动态变化状态。
本发明提供的方法的特点为(1)准确滞留层析的一个特点是能够从复杂的样品混合物中准确地分辨出分析物。滞留层析中检测的是滞留在吸附剂上的分析物。所以，滞留层析可提供有关滞留分析物化学或结构特征的直接信息。
滞留层析与常规层析存在以下区别。首先，滞留层析中检测的是滞留在吸附剂上的分析物。在常规层析中，分析物先从吸附剂上洗脱，然后进行检测。用常规层析方法常常检测不出吸附剂上洗脱下的分析物。第二，滞留层析与解吸质谱检测相结合提供了毫微微摩尔级的优良灵敏以及极高的分辨率。第三，在一定程度上，因为允许直接检测分析物，滞留层析提供了用多种不同选择性条件迅速分析滞留物的能力，由此提供多样品中分析物的快速维度的描述。第四，吸附剂可以于预先确定的排列，可定址位置附着于基质上。这就能够对在不同洗脱条件下接触不同吸附位置(即，“亲合性位置”或“位点”)的分析物进行并行处理。
蛋白质是由氨基酸组成的而氨基酸的平均质量为100Da。质谱直接分析有很强的准确性，一般误差率只有0.01％-0.1％。例如，检测出7030Da及7110Da被配位共价金属螯合剂表面的基质所捕捉的蛋白，由于质谱差率只有0.01％-0.1％，蛋白7030Da及7110Da不可能是同一种蛋白质。因此，蛋白指纹法可分辨蛋白质。
(2)方便本方法将蛋白质分成了几大类，即阴离子、阳离子、亲水、疏水或配位共价金属螯合剂作用蛋白。这样，可用质谱仪直接进行分析。
(3)快捷用本发明提供的蛋白指纹法进行疾病诊断时，无需对蛋白质进行测序。本发明采用了计算机“条码格式”，信号强度沿着线性轴以暗度强度值显示。此强度可以用扫描仪记录并用分析软件自动分析对比强弱，从而有助于临床复杂的诊断，如可用此“蛋白指纹”或条码格式进行医学分析。
具体实施例方式
实施例1 生物样品中蛋白指纹图谱差异表达区分意义(1)实验方法一、材料1.标本来源10例正常人血清，8例肺炎病人的血清。
2.试剂Protein A and G、人标准血清、人生长激素、胰岛素(分子量5807Da)、抗胰岛素抗体、抗人血清淀粉样蛋白A抗体、乙腈、三氟乙酸、SINAPINIC酸(Sinapinicacid)、CHAPS、Urea、NaAC、Tris-HCl均购自Sigma公司或赠送。
3.质量控制A.人标准血清(Sigma)，加入人生长激素(Sigma)，调制人生长激素在标准人血清中的浓度为50ng/ml。B.质谱激光能量调控每次测试前，用上述人标准血清，将人生长激素的峰值为50％时的激光能量设为标准值。
二、方法1.样品的收集全血采集后吸取血清，置于-80℃保存；-80℃冰箱中取出血清样品，置冰盒上融解；以10,000转/分，4℃离心2分钟；取上清液。
2.样品的准备A每个阴离子吸附剂支持物点需要血清3μl，将血清用2倍体积U9缓冲液(9M Urea，2％CHAPS，50mMTris-HCl，pH9.0)稀释(例如3μl血清用6μl U9缓冲液稀释)。将样品充分混匀。将9μl上述变性后样品加入111μl相应的结合缓冲液(50mM NaAC，pH4.0)，使得血清的总稀释倍数达到约40倍。将处理好的血清样品40μl上样到阴离子吸附剂上。
3.样品的准备B先将1种抗体结合至一个Protein A柱子(Column)上(一个柱子1种抗体)，然后将血清样品样本加载到柱子中并在室温条件下轻微震荡0.5小时。取上清液。每个芯片点需要血清3μl，将血清用2倍体积U9缓冲液(9M Urea，2％CHAPS，50mMTris-HCl，pH9.0)稀释(例如3μl血清用6μl U9缓冲液稀释)。将样品充分混匀。将9μl上述变性后样品加入111μl相应的结合缓冲液(50mM NaAC，pH4.0)，使得血清的总稀释倍数达到约40倍。将处理好的血清样品40μl上样到阴离子吸附剂上。
4.样品检测上样，在吸附剂支持物中加入40μl处理好的样品，置振荡器，400-600转/分，4℃震荡1小时。甩出样品，每孔加入200μl的结合缓冲液(50mM NaAc，pH4.0)，室温置振荡器400-600转/分，震荡5分钟，甩去孔中液体，再次加入结合缓冲液200μl，重复操作一次。每孔加入200μl HPLC水，立刻甩出。取出吸附剂支持物后，待干后，样品加入0.5μl的SINAPINIC酸(5mg/mL 50％乙腈；0.5％三氟乙酸)，任其自然干燥。
5.质谱中，就会生成飞行时间质谱。外部使用多肽分子质量标准来校正质量精确性。
(2)实验结果分析10例正常人血清中蛋白质的组成。
先用加入法在正常人血清中加入胰岛素(Insulin)，我们可以看到5807分子量的物质增加(
图1，A)。这证明胰岛素的分子量5807Da，即见箭头所示的条码带为胰岛素。
然后用减法将上述血清通过抗胰岛素的柱子(Anti-Insulin Immunoassay，图1)，我们看到5807Da分子量的条码带消失了(图1，B)这也证明5807Da条码带是胰岛素。
分析8例肺炎病人的血清，已知该血清中血清淀粉样蛋白A(Serum Amyloid A，SAA)增加。假设我们不知道血清淀粉样蛋白A(SAA)已知条码带位置(图2，A)。血清通过抗血清淀粉样蛋白A(抗SAA)的柱子(Anti-SAA Immunoassay，图2)后，我们可以发现箭头下11.5kDa的条码带消失了(图2，B)。这证明11.5kDa条码带是血清淀粉样蛋白A(SAA)。
(3)结论用滞留层析法捕获生物样品、进行质谱分析的蛋白指纹法—可用计算机读取的条码格式(蛋白指纹)。本发明提供确定某生物样品在第一和第二样品中差异存在的意义。包括A)测定生物样品在第一样品中至少一种选择性条件下的第一蛋白指纹图；B)测定生物样品在第二样品中(加入某种物质；或减去某种物质某种特异性单克隆抗体柱子处理过的)相同选择性条件下的第二蛋白指纹图；和C)比较第一和第二蛋白指纹图之间的差异。两种蛋白指纹图的差异条码带肯定了分析物在样品中的临床意义，从而判断每一条码带中单一蛋白指纹的意义。在理论上，当特异性抗体量无限地增加，所测定蛋白指纹条码带中单一蛋白指纹的意义可以相应增大。另可以将某种蛋白质从抗体柱子上还原，然后将这种蛋白质用胰蛋白酶切成多肽指纹或做N-端氨基酸序列分析以鉴定蛋白质分子序列，即最精确鉴别(金标准)。
权利要求
1.一种用滞留层析法捕获生物样品中蛋白质组的蛋白质分析方法，其特征是采用蛋白指纹法对生物样品中蛋白质组进行鉴别检测。
2.权利要求1所述的蛋白质分析方法，其中所述的鉴别检测蛋白质组的方法是质谱法。分析所得数据的形式是可用计算机读取的条码格式(蛋白指纹)—蛋白指纹法，其质谱分析范围为0～500kDa。每一条码带代表一种分子量，其颜色深浅代表蛋白质量多与少。
3.权利要求2所述的条码格式(蛋白指纹)，其条码带(分子量)意义的确定采用了加减法，即加入或减去某种物质来确定其质谱分子量的意义。蛋白指纹法确定某生物样品在第一和第二(加入或减去某种物质)样品中蛋白指纹差异两种蛋白指纹图的差异条码带肯定了其分子量在生物样品中的临床意义，从而判断每一条码带中单一蛋白指纹的意义。
4.权利要求1所述的蛋白质分析方法，其中所述的蛋白指纹(条码格式或质谱分子量的函数图)可以被编程计算机存储和用软件分析。
5.权利要求1所述的蛋白质分析方法，在滞留层析法中所用的吸附剂包括阴离子、阳离子、亲水、疏水或配位共价金属螯合剂作用吸附剂。
6.权利要求1中滞留层析法所用吸附剂的支持物可以是金属片，玻璃片，陶瓷片，陶瓷珠，磁性微粒或多聚体。
7.权利要求3所述的加减法中，减去某种物质所用的抗体吸附表面物质是任何能与抗体选择性或特异性结合的物质，如蛋白A和G(Protein A and Protein G)柱子。
8.权利要求7中抗体吸附表面物质是用于捕获抗原标记的单克隆或多克隆抗体。可以无限量地增加抗体组来达到无限量地检测多个或多种蛋白指纹。
9.权利要求1所述生物样品来源于血液，体液，分泌物，细胞溶解物，组织溶解物和器官溶解物。生物样品可以来自动物与植物。
10.权利要求1所述蛋白指纹图谱在定期监测生物样品中蛋白指纹动态变化的用途。
全文摘要
本发明涉及一种用滞留层析法捕获生物样品中蛋白质组，然后用质谱法进行分析的蛋白指纹法。分析所得蛋白质分子量的形式是可用计算机读取的条码格式(蛋白指纹)。本发明提供一种确定某生物样品中质谱条码格式的意义。所述的条码格式(蛋白指纹)，其条码带(分子量)意义的确定采用了加减法—即加入或减去某种物质来确定其质谱分子量的意义。本发明的方法可用于正常人与病人的蛋白指纹条码带的鉴定。蛋白指纹图谱的重大意义在于定期监测人体活动或血液中蛋白指纹的动态变化。本方法准确、方便且快捷。
文档编号G01N30/86GK1661367SQ20041000443
公开日2005年8月31日 申请日期2004年2月23日 优先权日2004年2月23日
发明者许洋 申请人:许洋
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
