专利名称：用于临床局限性前列腺癌患者的基于基因的psa复发预测的制作方法
用于临床局限性前列腺癌患者的基于基因的PSA复发预测
背景技术：
在进行根治性前列腺切除术或用于前列腺癌的其他侵入性治疗前，尽可能地准确了解该程序是否可能是治愈性是有用的。一般地，通过拒绝作出特定预测，或提供总体平均值，或提供主观评价或基于模型将患者指定至确定危险组(例如高危或低危组)，医生可以对患者关于预后信息的请求提供回应。提供最准确的评价几乎始终是适当的回应。因为癌症的病理学分期与手术或治疗后的复发概率相关，所以为了提供最佳可能评价，已付出许多努力来预测前列腺癌患者中的最终病理学分期或结果。为此，已采用许多列线图、算法和标记，其中Kattan列线图是最成功的。优选地，一致性指数用于从考虑的模型/列线图/算法等中选择特定策略。Kattan列线图在US5993388和US6409664中描述，所述两个专利以引用方式并入本文。用于治疗临床局限性前列腺癌的侵入性疗法是根治性前列腺切除术。不幸的是，用根治性前列腺切除术治疗的许多男性后来经历其疾病的进展。从指示复发的血清PSA中的增加开始，该癌症在许多男性中在手术后数月或数年重现。在可检测的PSA前，可能最后经历复发的男性的早期鉴定在考虑另外治疗同时保存生活质量中将是有用的。进一步地，复发可能性的准确估计在临床试验中也将是有用的，以鉴定用于对照组或用于目的研究治疗的候选者。如果治疗将更好地适合这个患者亚组，那么需要在新近诊断的临床局限性前列腺癌的分类中增加的准确度。与在其他癌症中一样，近期已开发了许多表型和预后分子标记和基因标志用于前列腺癌。这些已提供不同种类的侵入性前列腺癌和许多潜在的候选基因标记存在的某些重要了解。单独或与其他工具例如Kattan术后列线图结合的，掺入少量基因标记的表达值的临床可行测试是有用的，以评价PSA复发的危险是期望的。
发明内容
在一个方面，基于基因表达的测定用于提供前列腺癌复发的预后。基于基因表达的测定优选基于少量基因。三种基因概况是优选的。在一个优选的实施方案中，三种基因MYHlKSSBPl和DPT的表达水平提供有关前列腺癌复发的可能性的预后信息。在一个备选实施方案中，可以使用基因例如细丝蛋白C，y, RAS样家族12和细丝蛋白A的表达水平。其他可能的标记组合包括(i)生长停滞特异性l、Smoothelin、Leiomodin I和组蛋白lH3d,和(ii)含Sorbin和SH3结构域I、PDZ和UM结构域7、LIM和衰老细胞抗原样结构域2。基于表达水平的标记的另外有用组合可以容易地选自表2。在另一个方面，基于基因表达水平的测定与临床工具结合使用，所述临床工具是例如基于前列腺癌预后的多重临床指示物的列线图。在一个优选实施方案中，测定三种基因和三种对照基因的表达的测量。优选地，基因测量相对于三种对照基因的平均值进行测量。将这些基因测量连同来自Kattan列线图的预测概率一起掺入统计模型内，以生成反映复发概率或复发危险的评分。这种信息还可以用于测定在根治性前列腺切除术后的PSA水平上升的可能性。这种复发概率可以帮助患者作出关于其在治疗方面的选择的个人化决定。更具体地讲，本发明公开了用于区分在前列腺癌的高复发危险类别中的受试者和在前列腺癌的低复发危险类别中的受试者的分类器。优选的分类器包括分类程序，所述分类程序包括测量选自表2的至少两种诊断标记的表达水平，其中每种表达水平相对于两种或更多种对照标记的表达水平的平均值进行测量。随后将至少两种诊断标记的表达水平与基于Kattan列线图的预测概率组合，以生成同样可以是列线图形式的分类器。此处，Kattan列线图是例如在美国专利6，409, 664和5，993，388中描述的复合测量。Kattan列线图一般基于下组中的两个或更多个成员术前(和激素疗法前，如果接受的话)PSA值、前列腺切除术时的PSA、手术时的主要格里森(primary Gleason)、手术时的次要格里森、前列腺切除术格里森总和、前列腺切除术年份、无疾病月数、手术切缘是否是阳性的、癌症是否在精囊中发现、是否存在囊外延伸、癌症是否在淋巴结中发现(如果有的话，则切除)、放射治疗前PSA、辐射剂量(如果适用)、手术切缘是阳性还是阴性的(如 果适用)、是否存在精囊牵涉(如果适用)、是否存在淋巴结牵涉(如果适用)、是否存在囊外牵涉(如果适用)、是否开出新辅助激素处方、是否开出新辅助放射处方。Kattan列线图还可以是基于下组中的两个或更或多个成员的复合测量治疗前PSA水平、组合的格里森级别、样品格里森总和、临床分期、手术切缘状态、在活组织检查核心中癌症的核心总长度中的前列腺囊侵袭最大限度癌症长度、核心阳性水平百分比、前列腺外延伸、前列腺外延伸水平、细胞凋亡指数、一个或多个核心中的癌症百分比、一个或多个核心中的高级别癌症百分比、总肿瘤体积、癌症的定位区、精囊侵袭的存在、精囊侵袭的类型、p53、Ki-67、p27、DNA倍性状态、淋巴结状态和淋巴管侵袭。用于区分在前列腺癌的高复发危险类别中的受试者和在前列腺癌的低复发危险类别中的受试者的优选分类器要求测量诊断标记MYH11、SSBPl和DPT的表达水平。 优选的对照标记是TUBA、ALASl和ACTGl。备选的优选对照标记因如通过RT-PCR检测的相对稳定的表达水平而选择。用于区分在前列腺癌的高复发危险类别中的受试者和在前列腺癌的低复发危险类别中的受试者的另一优选分类器要求测量选自表2的至少一种诊断标记加上MYH11、SSBPl和DPT的表达水平在另一优选实施方案中，两种或更多种诊断标记选自表2中呈现的标记集合。诊断标记的更多具体集合包括本发明还公开了预测前列腺癌复发的方法。该方法包括步骤(i)测定DPT相对于标准的表达水平；(ii)测定来自表2的至少一种另外标记的表达水平；和(iii)将DPT的表达水平和来自表2的至少一种另外标记的表达水平转化成对应于前列腺癌的复发概率的评分。作为转化DPT的表达水平和来自表2的至少一种另外标记的表达水平的步骤的替代，该方法可以具有将DPT的表达水平和来自表2的至少一种另外标记的表达水平与前列腺癌复发的至少一种另外指示物组合的步骤，以测定复合评分。此类复合评分反映前列腺癌复发的可能性。优选地，在从前列腺切除术、激素疗法、单试剂化学疗法、双试剂化学疗法和用法尼基转移酶抑制剂的治疗中选择至少一种治疗前，测定DPT的表达水平和来自表2的至少一种另外标记的表达水平。
非限制性地，本公开内容还涵盖用于检测至少DPT的表达水平的试剂盒，该试剂盒包括试剂以及包括特异性识别DPT的第一探针和特异性识别选自表2的第二种标记的第二探针的第一探针组。该试剂盒可以包括用于将DPT的表达水平和来自表2的至少一种另外标记的表达水平转换成前列腺癌复发的可能性指示物的装置。该装置可以是列线图的形式。更具体地讲，优选的试剂盒作为下组中的一个或多个成员实现机械装置、图解表示和软件指令，以实现用于提供前列腺癌复发的可能性指示物表示的用户界面。在本发明的再进一步方面，提供含有用于进行来自前列腺肿瘤的三种基因和三种对照基因测量的试剂的试剂盒。提供使得基因测量能够针对三种对照基因的平均值进行标准化的指令(任选作为计算机代码)。将这些测量连同来自列线图的预测概率一起掺入生成复发概率的统计模型内。
图IA显示了使用基于来自157个患者的独立测试系列的结果的C-指数，本文公开的分类器与列线图的比较。分类器的C-指数明显高于列线图的C-指数(O. 77与O. 67比较)。·图IB显示了在关于测试集的5年预测估计值和实际复发概率之间的对应。与理想预测器相比较，该分类器证实跨越关于测试集的预测谱的良好校准，而5年列线图显示在检测更侵入性病例中的较少准确度。图2A显示了关于无PSA复发概率的Kaplan-Meier分析，以示出关于预测的低�：透呶Ｗ橹械氖奔溆隤SA复发中的差异(HR 6. 85,95% Cl = 3. 77至12. 43，P < . 001，)。在5年时，在两个组之间的PSA复发中的绝对差是58% (75%与17%比较)。图2B显示了在图2A中使用的分类器应用于具有格里森评分6或7的患者。图2C显示了在图2A中使用的分类器应用于显示病理学分期pT2或pT3a的患者。图2D显示了在图2A中使用的分类器应用于具有术前PSA浓度彡10ng/mL或10< PSA彡20ng/mL的患者。图2E显示了在图2A中使用的分类器应用于具有阳性或阴性手术切缘的患者。图3显示了当应用这些测试集时，基于每个模型的最高准确度的截止值应用。
具体实施例方式列线图广泛用于预测前列腺癌复发。最广泛使用的列线图是在美国专利6，409, 664和5，993，388中描述的Kattan列线图，所述两个专利整体并入本说明书。对于未接受用于其前列腺癌的手术治疗的那些人，这些列线图掺入下述信息最近的PSA(前列腺特异性抗原)值、主要和次要格里森级别、医生的临床分期评价(使用1992年或1997年国际抗癌联盟(UICC)系统)、推荐的放射疗法(如果适用)、在活组织检查过程中发现的阳性核心数目、在活组织检查过程中发现的阴性核心数目、是否已开出新辅助激素处方、和是否已开出新辅助放射处方。对于执行手术的那些人，因素包括术前(和激素疗法前，如果接受的话)PSA值、前列腺切除术时的PSA、手术时的主要格里森、手术时的次要格里森、前列腺切除术格里森总和、前列腺切除术年份、无疾病月数、手术切缘是否是阳性的、癌症是否在精囊中发现、是否存在囊外延伸、癌症是否在淋巴结中发现(如果有的话，则切除)、放射治疗前PSA、辐射剂量(如果适用)、手术切缘是阳性还是阴性的(如果适用)、是否存在精囊牵涉(如果适用)、是否存在淋巴结牵涉(如果适用)、是否存在囊外牵涉(如果适用)、是否开出新辅助激素处方、是否开出新辅助放射处方。这种信息在电子表格中组合，例如，并且简单统计处理提供用于测定预后的分析。
本发明的方法和试剂盒最优选与这些列线图和它们提供的信息结合使用。本发明的方法和试剂盒还涉及一组基因的检测。优选地，这个组中的基因之一的表达水平相对于对照标记中的至少一种进行测量。更优选地，测量三种基因和三种对照的表达水平。最优选的基因是MYHlI、SSBPl和DPT。最优选的对照是ALASl、TUBA和ACTGl。如实施例中所述，基因MYHll或DPT的更高表达指示比此类过表达不可见的情况更强的剩余无前列腺癌复发的可能性。更高的SSBPl表达水平指示更强的复发可能性。对应于测量其表达水平的基因的核酸序列以及用于测量此类表达水平的序列在本说明书中称为标记。其他目的序列包括用作测定对照的基因，例如ALASUTUBA和ACTG1。标记由用于检测基因表达的任何方法进行检测；优选地，这些是基于扩增的方法例如PCR、其变化和替代方法。最优选地，使用RTPCR。对于特定标记特异性的核酸探针或报道分子优选用于检测肿瘤组织中的标记基因的表达。可以使用其他生物学液体或组织，包括前列腺组织、尿、尿道洗涤物、血液和血液组分例如血清、射精和由其可以预期前列腺蛋白质的其他样品。可以使用含有可检测量的有关多核苷酸的任何样品。一种公开的方法包括使含有标记的靶细胞与结合核酸的试剂接触。靶细胞组分是核酸例如RNA。该试剂优选包括扩增且检测靶序列的此类探针和引物。例如，该试剂可以包括与其自身报道区段组合或键合的引发序列，例如称为Scorpion试剂或Scorpion报道基因且在授予Whitcombe等人的美国专利6，326，145和6，270, 967 (以引用方式整体并入本文)中描述的那些。尽管它们并不相同，但术语“引物”和“引发序列”在本说明书中可用于指引发核酸序列扩增的分子或分子的部分。优选引物能够开始引物延伸产物的合成，该引物延伸产物与多态性位点链基本上互补。引物和/或探针可以使用任何合适的方法包括自动化方法进行制备。有利于合成的环境条件包括存在三磷酸核苷和用于聚合反应的试剂(例如DNA聚合酶)以及适当的温度与pH。引物或引发序列的引发区段优选为单链，以使扩增效率最大化，但也可以为双链。如果为双链，则在用于制备延伸产物之前首先应处理引物，以分离两条链。引物必须足够长，以在存在聚合反应诱发剂的情况下引发延伸产物的合成。优选的引物最优选是八个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。引物的确切长度取决于诸如温度、缓冲液和核苷酸组成之类的因素。寡核苷酸引物最优选含有约12-20个核苷酸，但它们也可以含有更多或更少核苷酸。当互补的核酸链被分离时，不论核酸原来是双链或是单链，分离后的链都适合用作合成另外的核酸链的模板。这种合成在允许引物与模板的杂交发生的条件下进行。通常，合成是在缓冲的水溶液中进行，该缓冲的水溶液优选的PH值为7-9，最优选的pH值为约8。优选将摩尔过量(对于基因组核酸，通常为约108 1，引物模板)的两种寡核苷酸引物加入含有分离的模板链的缓冲液中。当本发明的方法用于诊断应用时，互补链的量可能是未知的，因此无法始终确切知道引物的量相对于互补链的量。然而在实践中，当复杂核酸长链的混合物中含有待扩增序列时，所添加的引物的摩尔量通常超出互补链(模板)的摩尔量。优选采用较大的摩尔过量，以提高该方法的效率。聚合反应试剂可以为会实现引物延伸产物合成的任何化合物或系统，优选为酶。用于这个目的的合适酶包括例如大肠杆菌(E. coli)DNA聚合酶I、大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段、T4 DNA聚合酶、其他可用的DNA聚合酶、聚合酶突变体、逆转录酶及其他酶，包括热稳定的酶(例如在实施足以引起变性的高温后执行引物延伸的那些酶)优选试剂为Taq聚合酶。合适的酶将有利于核苷酸以正确的方式组合，从而形成与每个基因座核酸链互补的引物延伸产物。通常，合成将在每个引物的3'端开始，并沿着模板链的5'方向继续进行，直到合成结束，产生不同长度的分子。然而，也可能存在在5'端开始合成并在其他方向继续的聚合反应试剂，其方法与上述相同。在本发明的另一个方面，采用表达比率。确定在获得的扩增标记量和扩增的参考标记或扩增的对照标记区量之间的比率可以实现这点。这可以使用定量实时PCR来完成。比率可以插入统计模型内，以测定前列腺癌复发的可能性。本发明的试剂盒可优选这样由多种组分构成，从而使得这些组分都含有至少一种引物或探针或检测分子(如Scorpion报告基因)。在一个实施方案中，该试剂盒包括用于扩增且检测标记区段的试剂。任选地，试剂盒包括样品制备试剂和/或制品(如管)，以从样品中提取核酸。在优选试剂盒中，包括了 RTPCR所需的试剂，例如，对应的PCR引物组、热稳定的聚合酶(如Taq聚合酶)和合适的检测试剂(如水解探针或分子信标)。在任选的优选试剂盒中，检测试剂为Scorpion报告基因或试剂。也可以使用单染料引物或双链DNA特异性荧光染料(例如溴化乙锭)。试剂盒中的额外材料可以包括合适的反应管或小瓶、屏蔽组合物，通常是蜡珠，任选包括镁；必要的缓冲液和试剂，例如dNTP ;对照核酸和/或任何额外的缓冲液、化合物、辅因子、离子组成成分、蛋白质和酶、聚合物等。任选地，试剂盒包括核酸提取试剂和材料。在本发明的优选试剂盒中，提供对具有前列腺样品的患者进行测定的说明书。最优选提供由计算机指令编码的制品用于制备来自Cox比例风险分析或其他统计比较器的预测。将该指令装载到计算机例如通用计算机内，从而使得当基因分析的值和任选的Kattan参数输入程序内时，该计算机提供复发可能性(高与低比较或者数字指示物)作为输出。在本发明的优选试剂盒中，还可以提供列线图的机械实现。此类实现可以使用基于纸的组分或移动机械部分，以允许考虑由列线图使用的个别变量。
具体实施例方式实施例I目的需要复发危险的准确估计值用于具有临床局限性前列腺癌的患者的最佳管理。将列线图和新型分子预测物组合到前列腺特异性抗原(PSA)复发的新预后模型内。这个研究设计为鉴定与具有临床局限性前列腺癌的患者中的PSA复发相关的基因，目的是开发准确的预测分类器，所述预测分类器可容易地应用于目前常规临床实践中，以管理具有局限于器官的疾病的患者。此处，我们报道了临床可行测试的开发，所述临床可行测试掺入可通过RTPCR测量的三种新型基因标记的表达值，和在前列腺癌的临床管理中广泛使用的工具Kattan术后列线图(11)，以评价PSA复发的危险。最后，我们显示与Kattan列线图相比较，这种新分类器提供对于预测在这个低危患者群体中的生物化学复发的改善的准确度。材料和方法分析来自福尔马林固定的、石蜡包埋(FFPE)的局限性前列腺癌患者组织的基因表达概况，以鉴定与PSA复发结合的基因。通过逆转录酶聚合酶链反应(RTPCR)再现所鉴定标记的概况。来自这些基因中的三种的RTPCR概况连同来自Kattan术后列线图的输出一起用于产生PSA复发的预测模 型。结果在变量选择后，建立将三种基因的表达值和术后列线图组合的PSA复发模型。与关于列线图O. 67的C-指数相比较，3基因加上列线图模型在验证集中以O. 77的一致性指数(c-指数)预测5年PSA复发。这个模型鉴定通过列线图未鉴定的处于复发的高危中的患者亚组。结论当针对5年列线图相比较时，这种新的基于基因的分类器具有优良的预测力，以评价具有局限于器官的前列腺癌的患者中的PSA复发危险。这种分类器应提供患者进入高�：偷臀Ｗ槟诘母既贩植悖糜谥瘟凭龆ê透ㄖ俅彩匝�。材料和方法患者和肿瘤样品患者信息得自圣文森校园前列腺癌组(St. Vincent’ s Campus Prostate CancerGroup) (SVCPCG)数据库(人类研究伦理委员会批准(Human Research Ethics CommitteeApproval)H00/088)。从1990年I月到2001年12月，960个患者在雪梨的圣文森医院(StVincent’s Hospital, Sydney)用根治性前列腺切除术(RP)治疗前列腺癌，没有术前治疗。在目前研究在评价的具有临床局限性疾病的316个连续患者亚组是其病理学分期范围从PT2A到pT3A的960的那些患者；对于审查患者的最低限度随访是五年；RP是初步治疗；并且来自RP样品的组织块可以就在基因表达概况分析实验中的使用进行评价。PSA复发的日期定义为在RP后在血清PSA ^ 0. 2ng/mL中的第一次增加的日期。将这些患者随机分成训练集和测试集。测试集单独用于验证目的。取决于变量是连续的、时间至事件的还是类别的，通过t检验、时序和卡方检验来估计在训练集和测试集之间的临床变量分布中的差异。所有统计检验都是双侧的，并且显著性定义为P < 0. 05。基因表汰概况分析将来自每个FFPE组织块的六μ m切片提交给病理学评议(JGK)，并且显微解剖(macrodissected)以确保> 30 %的恶性上皮用于使用高纯度RNA石腊试剂盒(HighPure RNA Paraffin kit)(印第安纳州的印第安纳波利斯市的罗氏诊断公司(RocheDiagnostics, Indianapolis, IN))的总 RNA 提取。用1200基因定制设计的DNA介导的退火、选择、连接和延伸微阵列(DASL)(加利福尼亚州的圣地亚哥市的宜曼达公司(Illumina, San Diego,CA)),对训练系列中的所有总RNA样品执行基因表达概况分析实验(22)。DASL阵列的基因表达概况和设计可以在GEO数据库(登记悬而未决的)中进行评价。基于在前列腺癌中的早期研究，选择三种对照基因ALASl、TUBA 和 ACTGl 用于微阵列和 RTPCR 分析(12，23)。使用存活模式的微阵列显著性分析(SAM)分析用于测量在阵列上的每种基因的预后显著性(24-26)。探针通过检验统计量的绝对值进行排序。通过数据排列计算假发现率。RTPCR测定设计用于顶部排序的预后标记候选物(η = 30)，包括对于增加和降低的探针在最低报道的发现率下的所有基因。在训练样品中在阵列和RTPCR数据之间具有弱皮尔森系数(< O. 4)的基因排除进一步分析。预后模型的构建使用纪念斯隆凯特琳癌症中心(Memorial Sloan Kettering Cancer Centre)在线计算器(http://www. mskcc. org/mskcc/html/10088. cfm),使用术后历史模型对于每个个体计算五年列线图复发评分。为了选择用于多变量模型的变量，使用训练样品通过LI正则化路径算法处理来自RTPCR的候选基因的SCT值以及来自列线图的预测概率(25)。通过使用路径算法交叉验证训练系列以对过度拟合Cox模型的潜力设置不同极限，选择具有 最小误差的标志。通过使用Cox比例风险模型将这些所选变量与训练集拟合，建立用于采纳的最终预测模型。在假阳性和假阴性的代价相等的假定下，选择用于模型的高�：偷臀７植愕慕刂怪担约坝糜诹邢咄嫉慕刂怪�。在这个假定下，选择给出最高训练集准确度的截止值(由正确分类的患者的总数目限定)。预后模型的验证为了估计预测性预后模型就测试集中的实际无复发而言的准确度，由通过Cox比例风险回归估计的预测5年无复发概率和在5年时的实际无复发概率的Kaplan-Meier估计量生成校准曲线(24，27)。通过基于来自训练集的预选截止值将测试集患者分成低�：透呶Ｗ椋ü齂aplan-Meier曲线和风险比率评价最终预后模型在测试集中的表现。所有统计分析在R，版本2. 5. O (www. r-project. org)中进行。患者特征从316个前列腺切除术FFPE组织中分离总RNA，并且由于RNA降解排除20个样品。在训练集和测试集中包括的患者的临床和病理学特征概括于表I中。随访中值是72个月，并且从根治性前列腺切除术到生物化学复发的中值时间在复发的那些人中是34个月。296个患者中的九十八个发展复发，包括在手术5年内发展复发的74个患者。训练系列由138个患者组成，而剩余158个留出用于测试集。在这两个患者集合之间在临床病理学特征中不存在统计学显著差异(表I)。基因表汰和单变量分析通过DASL阵列分析来自138个患者的训练集的RNA样品。SAM算法的排列揭示对于在DASL阵列上的20种基因0%的假发现率。如通过来自SAM分析的评分值排序的前30种基因具有6. 8%的假发现率。这30种基因随后通过RTPCR分析使用相同训练集进行评价。30所选基因中的六种显示在DASL和RTPCR之间小于O. 4的关联，并且因此从进一步分析中去除。通过Cox回归测量每种基因对无复发概率的作用。风险比率定量对于I个标准化CT的每个增量PSA复发的相对危险。对于训练集和测试集记录风险比率和P值(表2)。24种标记中的二十三种(除了标记HIST1H3D外)继续与测试集中的复发具有显著关联。在相同分析中，5年术后列线图也是训练集和测试集中的PSA复发的显著预测物(P值分别为.OOl和.005)。实施例2 对实施例I的RTPCR训练集执行进一步的变量选择，以建立多变量预后分类器。通过LI正则化算法选择四个变量3种基因(DPT、SSBP1和MYH11)和5年列线图。这4个变量随后使用Cox回归分析对训练集建模。分类器验证和存活分析当对157个患者的独立测试系列测试该预后模型时，分类器的C-指数明显高于列线图的C-指数(O. 77与O. 67比较)(图1A)。当对来自相同研究机构的由960个患者组成的连续前列腺癌患者同类者(cohort)测试时，所述患者并不限于局限于器官的疾�。邢咄急硐钟牍嫉难芯�(O. 72的C-指数)一致(图1A)。我们随后使用校准曲线，以测量关于测试集的5年预测估计量与实际复发概率有多接近。与理想预测器相比较，该分类器证 实跨越关于测试集的预测谱的良好校准，而5年列线图显示在检测更侵入性病例中的较少准确度(图1B)。来自测试集的截止值用于将测试集患者置于高危或低危组内。通过基于来自训练集的截止值(所述截止值对训练样品产生最高准确度)将患者分成低�：透呶Ｗ椋杂诓馐约飞蒏aplan-Meier曲线。由测试集的预测的5年无疾病存活以及基于以O. 3、O. 5,0. 7和O. 9的预测概率中的切割(cuts)在5年时的Kaplan-Meier估计量，生成校准曲线。关于无PSA复发概率的Kaplan-Meier分析显示关于预测的低危和高危组中的时间与PSA复发中的高度显著差异(HR 6. 85,95% Cl = 3. 77至12. 43，P < · 001，图2A)。在5年时，在两个组之间的PSA复发中的绝对差是58% (75%与17%比较)。此外，该分类器还代表关于下述患者亚组中的PSA复发的强预后因素格里森评分6或7(图2B)，病理学分期 pT2 或 pT3a(图 2C)，术前 PSA 浓度彡 10ng/mL 或 10 < PSA ( 20ng/mL(图 2D)，和阳性或阴性手术切缘(图2E)。在训练集和测试集中包括的患者的临床和病理学特征概括于表I中。随访中值是72个月。从根治性前列腺切除术到生物化学复发的平均时间和中值时间分别为40个月和34个月。296个患者中的九十八个(33%)发展复发，包括在手术5年内发展复发的74(25% )个患者。
_8] 改良的预后模型的应用为了估计该模型对患者管理的潜在影响，我们比较了使用该分类器与5年术后列线图相比较对测试同类者的预后分层的准确度。我们使用基于每个模型的最高准确度的截止值，且随后将这些应用于测试集(图3)。在157个测试集患者中，由列线图预测为低危的136个具有23. 5%的复发率(32/136)。相比之下，当应用于这个组时，该分类器将14个患者鉴定为具有复发的“高危险”，包括具有已记录的复发的12个患者(86% )。在该分类器对于其赋予“低危”状态的122个患者中，20个患者(16.4%)经历PSA复发。相反地，由列线图预测为“高危”但由分类器预测为“低危”的11个患者无一具有已记录的复发。因而，该分类器对这个系列的前列腺癌患者赋予除由术后列线图提供的那种外的另外预后信息。实施例3 RTPCR测定设计用于候选标记和三种(3)对照基因。多重PCR引物和探针设计用于标记。CT值针对3种对照基因的平均值进行标准化。
每种标准化的基因针对DASL信号值进行标绘。将总RNA逆转录15，并且用基因特异性引物预扩增。随后使用ABI PRISMu 7900序列检测系统(美国应用生物系统公司(APPLIED BIOSYSTEMS))定量预扩增的 cDNA。DPT-1232 3096 正向引物GGGTTGGAAGGATTTCCTGAA(SEQ ID NO I)反向引物CCCTGCACTCATTTTCCTTACTG(SEQ ID NO 2)探针5' Fam-3' MGB 标记的探针 TAGAAGACAAACGTTAGCATAC (SEQ ID NO 3)MYHl 1-5893 460 正向引物GCACTCAAGAGCAAGCTCAGAG(SEQ ID NO 4) 反向引物TCGTTTCCTCGCCTGGTG(SEQ ID NO 5)探针5' Fam-3' MGB 标记的探针 AGGAAACTTCGCAGTGAT (SEQ ID NO 6)SSBP1-291 2990 正向引物AGTTTACCAACTGGGTGATGTCAG(SEQ ID NO 7)反向引物5' Fam-3' MGB TTGATATGCCACGTCTCTGAGG(SEQ ID NO 8)标记的探针ATGGCACAGAATATCAG(SEQ ID NO 9)实施例4 还鉴定了另外的实验对象组，虽然它与优选实验对象组相比较是亚最佳的，但凭自身的实力也是有用的。备选实验对象组各自可用作标准的单独实验对象组或与Kattan列线图组合使用，所述Kattan列线图的表现通过备选实验对象组各自得到改善。箭头符号指示对应于模型的C-指数。Altl FLNC+RASL12+MYLK+FLNA+N0M_H5- > O. 71FLNC+RASL12+MYLK+FLNA- > O. 67Alt2 GASI+SMTN+LMODI+HIST1H3D+N0M_H5- > 0. 74GASI+SMTN+LMODI+HISTIH3D- > 0. 71Alt3 S0RBS1+PDLIM7+LIMS2+MT1X+N0M_H5- > 0. 73S0RBS1+PDLIM7+LIMS2+MT1X- > 0. 69实施例5 还鉴定的是用于剩余标记的探针和引物对。它们呈现于表3中。实施例6 还开发了用于MYHl 1、DPT和SSBPl以及ALAS、ACTG和TUBA的备选引物和探针组。与实施例3的引物和探针组相比较，结果至少一致或更佳。他们备选引物和探针是DPT558F TGCAGTGGAAAGGGATCGC(SEQ ID NO 10)DPT640R CCCAGATTTGGTATGTGGCA(SEQ ID NO 11)DPT588P_FAM CATAATGTGCCGGATGACTGAATA (SEQ ID NO 12)MYH 5895F GCACTCAAGAGCAAGCTCAGA(SEQ ID NO 13)MYH 5964R TAGAAGGAACGAAAGAGGTCTC(SEQ ID NO 14)
MYH 5925P_0range CCACAGGAAACTTCGCAGTGAT(SEQ ID NO 15)SSBPl ；281F GGGATAGTGAAGTTTACCAAC(SEQ ID NO 16)SSBPl ；359R TTGATATGCCACGTCTCTGA(SEQ ID NO 17)SSBPl ；312P (ORANGE)CAGTCAAAAGACAACATGGCACAG(SEQ ID NO 18)TUBA 586F TTCGCAAGCTGGCTGA(SEQ ID NO 19)TUBA 666R CATGAGCAGGGAGGTGAA(SEQ ID NO 20)TUBA 639P_Cy5(Quasar)AGCTTTGGTGGGGGAACTGGTTCT(SEQ ID NO 21)ALAS918F CAAGTGTCAGTCTGGTGCA (SEQ ID NO 22) ALAS984R GTTGTTTCAAAGTGTCCATAAC(SEQ ID NO 23)ALAS948P_FAM CTAGGAATGAGTCGCCACCCAC(SEQ ID NO 24)ACTG 862F AGCCTTCCTTCCTGGGTAT(SEQ ID NO 25)ACTG 903R TGATGGAGTTGAAGGTGGT(SEQ ID NO 26)ACTG 882P_Cy5(Quasar)GAATCTTGCGGCATCCACGA(SEQ ID NO 27)讨论:就与诊断批准平台一起测量FFPE组织中的小基因集合表达的能力而言，所公开分类器的相对低水平的复杂性也是重要的。这些显著进展解决了影响在临床诊断设置中成功实现这种预测工具的可能性的某些关键因素。需要极小浓度的衍生自FFPE组织的RNA也促进其对常规病理学样品包括术前经直肠活组织检查的潜在长期适用性。前列腺癌相关基因表达的这种系统评价与PSA复发关联，以便开发具有潜在广泛临床效用的在临床局限性前列腺癌中的复发的基于基因的分类器。使用定制的DASL阵列(允许高流通量基因表达概况分析衍生自FFPE组织的RNA的微阵列平台)鉴定新型基因预测器(22)。这个研究的关键组分是定制的DASL阵列基因集合的设计，所述DASL阵列基因集合基于通过公布数据集的再分析鉴定的基因标记(12，13)、内部基因表达数据(未公布的)、和先前牵涉前列腺癌进展的标记(14，16，17)。这提供了关于在这个研究中最显著的那30种基因的独立验证程度。通过RTPCR进一步验证在基因表达阵列分析中与PSA复发关联的24种基因标记，以产生优选的3-基因标志(DPT、MYH11和SSBP1)，当与建立的列线图组合时，所述优选的3-基因标志导致PSA复发的新分类器。随后在独立的患者组中验证这种分类器。DPT和MYHll是新型前列腺癌预后标记，而SSBPl先前已与侵入性前列腺癌相关(17)ο这种新分类器的价值超过用于前列腺癌复发的广泛使用的列线图的评价显示该新分类器鉴定具有复发的低危险和高危险的患者，具有比单独的术后列线图大得多的准确度(9)。此处呈现的分类器也能够将基于常规临床病理学参数的临床相关亚组内的患者分层为高�：偷臀８捶⒆�。值得注意的是，分层具有格里森6和7癌症的患者的能力代表超过目前方法的在预测准确度中的显著进展。PSA复发作为前列腺癌的显著终点的用途存在争议，因为仅一小部分经历复发的患者进展至临床显著疾病。这些关系将得到更明确地确定，因为这个同类者随着关于转移和死于PrCa的数据而趋于完善(matures)。然而，明确的是当大多数医生和患者考虑进一步的治疗选项时，上升的前列腺切除术后PSA的检测是主要决定点(5)。在这个背景下，使用5年列线图估计这种分类器的潜在影响是有效的，因为大多数前列腺切除术后的生物化学复发在5年内出现。
重要的是当针对前列腺癌中的分子表型和预后的其他公布标志和基因标记加以考虑时，这种新分类器作为决定工具的影响(12-20)。这个研究是独特的，特别开发用于帮助预测在具有临床局限性疾病的前列腺癌患者中的复发危险，因为这些患者代表在美国>80%的新近诊断的 前列腺癌病例。虽然公布的标志和基因标记已从代表病理学分期谱的患者同类者中鉴定，但这个研究中的训练和测试同类者限于局限于器官的前列腺癌。在预测工具的开发中使用的患者组与预期靶组之间具有一致性的重要性通过与先前报道相比较的5年列线图在临床局限性患者的这个同类者中的相对低表现得到强化。根据进一步分析，这可能是由于在这个研究中仅评价局限于器官的病例的局限性。当对来自相同研究机构的连续前列腺癌患者同类者测试时，所述患者并不限于局限于器官的疾�。邢咄急硐钟胂惹把芯恳恢�(9，11)。该分类器的相对低水平的复杂性也是重要的。伴随测量FFPE组织中的小基因集合表达的能力和批准用于在存档样品中的诊断测试的平台的使用，它是显著的进展，因为它解决了影响在临床诊断设置中成功实现这种预测工具的可能性的某些关键因素。要求低浓度的衍生自FFPE组织的RNA也促进其对常规病理学样品包括术前经直肠活组织检查的潜在长期适用性。现在需要在手术和术前活组织检查的外部同类者中的进一步验证，包括在活组织检查中重复基因选择，以证实这种分类器在术前设置中的更广泛适用性。用于局限性前列腺癌的准确预测分类器的实现具有对于早期前列腺癌的患者管理的重要牵涉。具有局限性疾病和高危特征的患者很可能获益于辅助疗法，包括激素、辐射和全身治疗，并且该利益应在治疗试验中加以估计(7，28，29)。采用此类试剂的早期临床试验在激素抗拒性设置中正在进行，但最终可以在局限性前列腺癌中作为辅助疗法进行测试
(30)。这些研究的本质是准确鉴定高危患者，以确保同类的患者组8。相反地，具有复发低危险的患者的改善鉴定将减少这样的患者的数目，由于通过PSA筛选鉴定的增加数目的无痛癌症，所述患者暴露于治疗的发病率。最后，用于局限性前列腺癌的改良预后模型的开发具有利于更佳治疗决定的潜力，或者放弃无痛疾病的治疗，或者为具有复发高危险的男性提供辅助化学疗法。本公开内容中的所有参考文献由于其所有相关教导在此以引用方式并入本文。参考文献:I. Ries LAG, Melbert D, Krapcho M等人SEER Cancer Statistics Review (SEER癌症统计评述)，1975-2005。马里兰州的贝塞斯达国家癌症研究所(Bethesda，MD :National Cancer Institute)，张贴至 SEER 网站，20082. Jemal A, Siegel R, Ward E 等人Cancer statistics (癌症统计)，2008。CACancer J Clin (临床医师癌症杂志)2008 ;58 :71。3. Cooperberg MR, Moul Jff 和 Carrol PR The changing face of prostatecancer (前列腺癌的改头换面)。J Clin Oncol (临床肿瘤学杂志)2005 ;23 :8146。4. Wilt TJ SPCG-4 a needed START to PIVOTal data to promote and ProtecTevidence-based prostate cancer care (需要 START 至 PIVOTal 数据以促进且保护基于证据的前列腺癌护理)。J Natl Cancer Inst (国立癌症研究所杂志)2008 ;100 :1123。5. Scardino PT Localized prostate cancer is rarely a fatal disease (局限性前列腺癌很少是不治之症)。Nat Clin Pract Urol (自然临床诊疗泌尿学)2008 ;5 :1。
6. Kumar S，Shelley M，Harrison C 等人Neo-adjuvant and adjuvant hormonetherapy for localised and locally advanced prostate cancer(用于局限f生矛口局部晚期前列腺癌的新辅助和辅助激素疗法)。Cochrane Database Syst Rev(考克兰系统评价数据库)2006 :CD006019。7. Van der Kwast THiBolla M,Van Poppel H等人！Identification of patientswith prostate cancer who benefit from immediate postoperative radiotherapy (获益于立即术后放射治疗的前列腺癌患者的鉴定)E0RTC 22911. J Clin Oncol (临床肿瘤学杂志)2007 ；25 4178o8. Shariat SF，Karakiewicz PI, Suardi N等人Comparison of nomograms withother methods for predicting outcomes in prostate cancer a critical analysisof the literature(列线图与用于预测前列腺癌中的结果的其他方法的比较文献的关键分析)。Clin Cancer Res (临床癌症研究)2008 ; 14 :4400。9. Graefen M, Karakiewicz PI，Cagiannos I 等人Validation study of theaccuracy of a postoperative nomogram for recurrence after radical prostatectomyfor localized prostate cancer(用于局限性前列腺癌的根治性前列腺切除术后复发的术后列线图准确度的验证研究)。J Clin Oncol (临床肿瘤学杂志)2002 ;20:951。10. Stephenson AJ, Scardino PT，Eastham JA 等人Postoperative nomogrampredicting the 10-year probability of prostate cancer recurrence after radicalpiOstatectomy (预测在根治性前列腺切除术后的10年前列腺癌复发概率的术后列线图)。J Clin Oncol (临床肿瘤学杂志)2005 ;23:7005。11. Kattan MW，Wheeler TM 和 Scardino PT !Postoperative nomogram fordisease recurrence after radical prostatectomy for prostate cancer (用于前列腺癌的根治性前列腺切除术后的疾病复发的术后列线图)。J Clin 0ncol(临床肿瘤学杂志)1999 ；17 1499o12. Glinsky GViGlinskii AB，Stephenson AJ等人Gene expression profilingpredicts clinical outcome of prostate cancer(基因表达概况分析预测前列腺癌的临床结果)。J Clin Invest (临床研究杂志)2004 ;113:913。13. Henshall SM，Afar DE, Hiller J 等人Survival analysis of genome-widegene expression profiles of prostate cancers identifies new prognostic targetsof disease relapse (前列腺癌的全基因组基因表达概况的存活分析鉴定疾病再复发的新预后祀)。Cancer Res (癌症研究)2003 ；63 :4196。14. Lapointe J，Li CiHiggins JP等人Gene expression profiling identifiesclinically relevant subtypes of prostate cancer(基因表达概况分析鉴定前列腺癌的临床相关亚型)。Proc Natl Acad Sci U S A (美国国家科学院院刊)2004 ;101 :811。15. Nakagawa T，Kollmeyer TM，Morlan BW 等人A tissue biomarker panelpredicting systemic progression after PSA recurrence post-definitive prostatecancer therapy (预测在决定性前列腺癌治疗后的PSA复发后的全身进展的组织生物标记实验对象组)。PloS ONE (公共科学图书馆-综合)2008;3:e2318。16. Singh DiFebbo PG,Ross K等人Gene expression correlates of clinicalprostate cancer behavior (临床前列腺癌行为的基因表达关联)。Cancer Cell (癌细胞)2002 ；1 :203。17. Yu YP, Landsittel D，Jing L 等人Gene expression alterations inprostate cancer predicting tumor aggression and preceding development ofmalignancy(在前列腺癌中预测癌症侵入和恶性肿瘤的先前发展的基因表达改变)DJ ClinOncol (临床肿瘤学杂志)2004 ；22 :2790。18. Setlur S，Mertz K，Hoshida Y 等人Estrogen-dependent signaling in amolecularly distinct subclass of aggressive prostate cancer(侵入性前列腺癌的分子不同亚类中的雌激素依赖性发信号Natl Cancer Inst (国立癌症研究所杂志)2008 ;100 :815019. Henshall S，Horvath L，Quinn D 等人Zinc_alpha2-glycoproteinexpression as a predictor of metastatic prostate cancer following radicalprostatectomy (锌-a 2_糖蛋白表达作为根治性前列腺切除术后的转移性前列腺癌的预 测物)。J Natl Cancer Inst (国立癌症研究所杂志)2006 ;98 :1420。20. Mucci LiPawitan Y,Demichelis F等人Testing a multigene signature ofprostate cancer death in the Swedish Watchful Waiting Cohort (在瑞典观察等待同类者中测试前列腺癌死亡的多基因标志)。Cancer Epidemiol Biomarker Prev (癌症流行病学、生物标志及预防)2008 ；17 1682o21.Quinn DI, Henshall SM 和 Sutherland RL Molecular markers of prostatecancer outcome (前列腺癌结果的分子标记)。Eur J Cancer (欧洲癌症杂志)2005 ；41 858。22. Bibikova M, Talantov D，Chudin E 等人Quantitative gene expressionprofiling in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues using universal beadairays (使用通用珠阵列在福尔马林固定的、石蜡包埋组织中的定量基因表达概况分析)。Am J Pathol(美国病理学杂志)2004;165:1799。23. Ohl F，Jung M，Xu C 等人Gene expression studies in prostate cancertissue which reference gene should be selected for normalization (前列腺癌组织中的基因表达研究应选择何种参考基因用于标准化？)J Mol Med(分子医学杂志)2005 ；83 1014o24. Harrell Jr FE !Regression modeling strategies with applications tolinear models, logistic regression，and survival analysis (回归建模策略应用于线性模型、逻辑回归和存活分析)。纽约施普林格纽约分公司(New York :Springer_VerlagNew York),200125. Park MY和Hastie T L1 regularization path algorithm for generalizedlinear models (用于广义线性模型的LI正则化路径算法)。J R Stat Soc=SeriesB (Statistical Methodology)(英国皇家统计杂志B 辑(统计方法学))2007 ；69 :659。26.Tusher VG，Tibshirani R和Chu G !Significance analysis of microarraysapplied to the ionizing radiation response (应用于电离福射应答的微阵列的显著性分析)。Proc Natl Acad Sci U S A (美国国家科学院院刊)2001 ;98 :5116。
27. Team RDC R a language and environment for statistical computing (R 用于统计计算的语言和环境)。Vienna :R Foundation for Statistical Computing(维也纳R基金会统计计算)，200728.Joniau S 和 Van Poppel H Localized prostate cancer :can we betterdefine who is at risk of unfavourable outcome (局限性前列腺癌我们能否更好地确定谁处于不利结果的危险中？)BJU International (英国国际泌尿学杂志)2008 ；101 S5029. Bolla M，van Poppel H，Collette L 等人Postoperative radiotherapyafter radical prostatectomy a randomised controlled trial (E0RTC trial 22911) (在根治性前列腺切除术后的术后放射治疗随机化对照试验(E0RTC试验22911))。Lancet (柳叶刀)2005 ；366 :572。30. Mazhar D 和 Waxman J Early chemotherapy in prostate cancer (前列腺癌中的早期化学疗法)。Nat Clin Pract Urol(自然临床诊疗泌尿学)2008 ;5 :486。表I.测试和训练同类者的患者特征
训练同类者测试同类者
特征(患者数目=J38 )(患者数目=) P值 年龄，岁数
<605856 .50f
>6080102 格里森评分<65775 .17*
76472
8-101710
未知OI临床分期
Tl5667 75*
权利要求
1.一种用于区分在前列腺癌的高复发危险类别中的受试者和在前列腺癌的低复发危险类别中的受试者的分类器，所述分类器包括 至少两种诊断标记的各自表达水平，每种表达水平相对于两种或更多种对照标记的平均水平进行测量；和 基于Kattan列线图的预测概率，其与所述至少两种诊断标记的表达水平组合，以将受试者指定至前列腺癌的高复发危险类别和前列腺癌的低复发危险类别之一。
2.根据权利要求I所述的分类器，其中所述Kattan列线图是基于下组中的两个或更多个成员的复合测量术前(和激素疗法前，如果接受过该疗法的话)PSA值、前列腺切除术时的PSA、手术时的主要格里森、手术时的次要格里森、前列腺切除术格里森总和、前列腺切除术年份、无疾病月数、手术切缘是否是阳性的、癌症是否在精囊中发现、是否存在包膜外延伸、癌症是否在淋巴结中发现(若有被取出)、放射治疗前PSA、福射剂量(如果适用)、手术切缘是阳性还是阴性的(如果适用)、是否存在精囊牵涉(如果适用)、是否存在淋巴结牵涉(如果适用)、是否存在包膜外牵涉(如果适用)、是否开出新辅助激素处方、是否开出新辅助放射处方。
3.根据权利要求I所述的分类器，其中所述Kattan列线图是基于下组中的两个或更多个成员的复合测量治疗前PSA水平、组合的格里森级别、样品格里森总和、临床分期、手术切缘状态、在活组织检查核心中癌症的核心总长度中的前列腺包膜侵袭最大癌症长度、核心阳性水平百分比、前列腺外延伸、前列腺外延伸水平、细胞凋亡指数、一个或多个核心中的癌症百分比、一个或多个核心中的高级别癌症百分比、总肿瘤体积、癌症的定位区、精囊侵袭的存在情况、精囊侵袭的类型、p53、Ki-67、p27、DNA倍性状态、淋巴结状态和淋巴管侵袭。
4.根据权利要求I所述的分类器，其包括诊断标记MYHlI、SSBPl和DPT。
5.根据权利要求2所述的分类器，其除MYH11、SSBP1和DPT外还包括选自表2的除组蛋白I H3d外的诊断标记。
6.根据权利要求I所述的分类器，其中所述对照标记是TUBA、ALASl和ACTG1。
7.根据权利要求I所述的分类器，其中所述诊断标记选自表2中呈现的除组蛋白IH3d外的标记集合。
8.根据权利要求I所述的分类器，其中对照标记针对如通过RT-PCR检测的相对稳定的表达水平而选择。
9.一种预测前列腺癌复发的方法，其包括测定相对于标准的DPT表达水平；测定来自表2的至少一种另外标记的表达水平；和将所述DPT的表达水平和来自表2的除组蛋白I H3d外的至少一种另外标记的表达水平转化成对应于前列腺癌的复发概率的评分。
10.根据权利要求9所述的方法，作为转化步骤的备�。浣徊桨ń鯠PT的表达水平和来自表2的除组蛋白I H3d外的至少一种另外标记的表达水平与前列腺癌复发的至少一种另外指示物组合的步骤，以测定复合评分。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述复合评分反映前列腺癌复发的可能性。
12.根据权利要求9所述的方法，其中在选自前列腺切除术、激素疗法、单试剂化学疗法、双试剂化学疗法和用法尼基转移酶抑制剂的治疗中的至少一种治疗前，测定所述DPT的表达水平和来自表2的除组蛋白I H3d外的至少一种另外标记的表达水平。
13.一种用于检测至少DPT的表达水平的试剂盒，所述试剂盒包括试剂以及第一探针组，其包括特异性识别DPT的第一探针和特异性识别选自表2的除组蛋白I H3d外的第二标记的第二探针。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其还包括装置，所述装置用于将所述DPT的表达水平和来自表2的除组蛋白I H3d外的至少一种另外标记的表达水平转换成前列腺癌复发可能性的指示物。
15.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述装置是列线图。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，其中所述列线图作为下组中的一个或多个成员实现机械装置、图示和软件指令，以实现用于提供前列腺癌复发可能性指示物的表示的用户界面。
全文摘要
本发明公开了使用优选的三基因分类器的表达水平用于测定前列腺癌复发的可能性的方法、装置和试剂盒。所述方法、装置和试剂盒可以不依赖于目前在使用中的许多列线图而使用，或用于改善此类列线图的总体表现。
文档编号G01N33/48GK102939534SQ201180017903
公开日2013年2月20日 申请日期2011年3月31日 优先权日2010年4月2日
发明者D.塔兰托夫, T.杰特克, Y.张, Y.王, J.F.帕尔马 申请人:维里德克斯有限责任公司
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