专利名称：透射电镜和能谱原位识别嗜热四膜虫体内纳米金的方法
技术领域：
本发明属于环境纳米颗粒生物体定位识别及其生物毒性领域。
背景技术：
纳米材料与技术已经得到广泛应用，如含有纳米银的抗菌剂、在医学成像中广泛应用的荧光量子点标示技术等，这些都与现代生活紧密相连。纳米材料与技术是一种新兴的学科，近年来，纳米材料大部分都没有经处理就直接排入到污水中，进而进入河流、海洋等自然水体环境。尽管纳米材料的生物学效应及其环境安全影响正逐渐引起人们的重视，然而原位观察纳米材料进入生物体的方式、纳米材料在新陈代谢中的循环过程以及在食物链中迁移转化、纳米材料在高端生物体的累积等都未有更深入的研究探讨。为了解决上述问题，有报道单独用透射电子显微镜观察生物体里的纳米颗粒P.V.Asharani, et al.Cytotoxicity and Genotoxicity of silver Nanoparticles inHuman Cells.ACS NANO, 2009, 2:279-290，但这种方法不能够直接识别所看到是否就是纳米颗粒成分，往往会被一些微小杂质纳米颗粒所干扰，本发明提供了一种用于透射电镜和能谱原位观察识别生物体内纳米金的方法，其特征在于通过将嗜热四膜虫在含有纳米金的液体培养基里培养一段时间后，经过固定、脱水、渗透和包埋等步骤，最后于超薄切片机下切得50-70纳米厚的超薄切片，捞网晾干，醋酸铀和柠檬酸铅染色后电镜下观察，看到颗�：笥媚芷兹啡�。本发明能够排除其他杂质纳米颗粒的干扰，实现原位观察嗜热四膜虫体内纳米金颗粒，为进一步了解纳米颗粒在生物体内的循环代谢过程和评价其生物毒性提供有效的分析方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种透射电镜和能谱原位识别嗜热四膜虫体内纳米金的方法，以解决现有单 独用透射电镜观察生物体内纳米颗粒方法中存不能排除其他杂质纳米颗粒的干扰问题。本发明的实验流程为:
1、纳米金的合成
45-50mL超纯水中加入lmL(10 g.Γ1)的HAuCl4,加热回流，在剧烈的搅拌下，快速加Λ ImL (71.4 g.1/1)的柠檬酸三钠，继续加热搅拌回流，制备好的纳米金置于4 °C的冰箱
中备用。2、嗜热四膜虫的培养
(1)本发明试验中所用嗜热四膜虫由中科院水生生物所提供；
(2)嗜热四膜虫培养条件为黑暗30°C；
(3)液体培养基:酵母粉2.5 g.ΙΛ胰蛋白胨2.5 g.ΙΛ葡萄糖5 g. Λ FeCl3溶液33ml,蒸懼水1L。3、纳米金处理嗜热四膜虫(1)纳米金胶体溶液使用前超声15分钟，然后加入已灭菌的含20mL的培养基的三角烧瓶中，制成纳米金含量为7.2 mg.L—1的培养基；
(2)将黑暗条件下30°C培养24小时后的嗜热四膜虫接种于步骤(I)纳米金含量为7.2mg.Γ1的培养基中，接种量为1.5%-2.5%，培养24小时。4、嗜热四膜虫的透射电镜制样
a、嗜热四膜虫在纳米金培养基中培养24小时后，2000转/分钟离心5分钟后去上清；
b、2.5%戊二醛固定0.5-1小时；
c、0.1M (ρΗ7.2)磷酸缓冲液清洗三次，每次10-20分钟；
d、0.1%锇酸固定半小时；
f、0.1M (pH7.2)磷酸缓冲液清洗三次，每次10-20分钟；
g、30%、50%、70%、90%梯度酒精脱水各一次，100%酒精脱水两次，每次10_20分钟；
h、树脂渗透两次,每次5-9小时；
1、包埋后70度烘箱聚合8小时以上； j、超薄切片机切片，厚度为50-70纳米；
k、醋酸铀染色10-15分钟，柠檬酸铅染色15-20分钟，晾干。5、嗜热四膜虫纳米颗粒定位观察的电镜及能谱条件
(1)样品放入电镜后，将电镜加速电压升到80-100KV，样品杆倾转11.5-12.5度；
(2)在Mag2模式下观察超薄切片，在2万倍到10万倍下寻找纳米颗粒；
(3)找到纳米颗�：螅缇底坏侥芷啄Ｊ剑纪ü芷资占紫撸奔涑Ｊ栉�25-lOOus，收集一段时间后，通过软件识别谱线图中是否有金的特征峰，如有说明所观察到的纳米颗粒为金纳米颗粒，若无金特征峰，返回观察模式继续寻找，对所观察的颗粒进行能谱谱线收集，直到确认找到的是金纳米颗粒；
(4)根据细胞超微结构知识确认纳米金的亚细胞定位。本发明的优点在于能够排除其他杂质纳米颗粒的干扰，从而确认金纳米颗粒的嗜热四膜虫亚细胞定位。
图1是实验所制备的纳米金颗粒图。图中纳米金颗粒的直径集中在13纳米左右。图2是嗜热四膜虫体内纳米金及其能谱图。其中(A)是不经过纳米金处理的对照组嗜热四膜虫结构图；(B)是(A)的能谱图，显示没有金峰出现；(C)是纳米金处理后的嗜热四膜虫及体内纳米金颗粒图；(D)是(C)中箭头所指处纳米金颗粒能谱图，显示有金峰，证明箭头所指黑色颗粒确实为纳米金。图3是纳米金颗粒在嗜热四膜虫体内外的定位情况图。其中，(A)和(B)显示四膜虫口沟部位有纳米金；(C)显示在嗜热四膜虫食物泡内存在纳米金；(D)显示纳米金存在于四膜虫细胞膜外侧。
具体实施例方式1、纳米金的合成 48mL超纯水中加入lmL(10 g.Γ1)的HAuCl4，加热回流，在剧烈的搅拌下，快速加入ImL (71.4 g-L-1)的柠檬酸三钠，继续加热搅拌回流，制备好的纳米金置于4 °C的冰箱中备用。2、四膜虫的培养及纳米金处理
配制液体培养基:酵母粉2.5 g.L'胰蛋白胨2.5 g.L'葡萄糖5 g.L' FeCl3溶液33ml，蒸馏水1L，灭菌后待用。接种400uL嗜热四膜虫到含20ml液体培养基的三角瓶中，30°C黑暗下培养24小时后，从中取400uL重新接种到含20ml液体培养基的另一三角瓶中，并加入1.5ml步骤I合成的纳米金，使得培养基中纳米金的终浓度为7.2 mg.黑暗条件下培养24小时。3、嗜热四膜虫的透射电镜制样
将纳米金培养基中培养24小时后的嗜热四膜虫2000转/分钟离心5分钟后去上清；
2.5%戊二醛固定I小时；0.1M (ρΗ7.2)磷酸缓冲液清洗三次，每次15分钟；0.1%锇酸固定半小时；0.1Μ(ρΗ7.2)磷酸缓冲液清洗三次，每次15分钟；30%、50%、70%、90%梯度酒精脱水各一次，100%酒精脱水两次，每次15分钟；树脂渗透两次，每次7小时；包埋后70°C烘箱聚合8小时；超薄切片机切片，厚度为70纳米；醋酸铀染色13分钟，柠檬酸铅染色18分钟，晾干。4、嗜热四膜虫纳米金识别的电镜及能谱条件
(1)样品放入电镜后，将电镜加速电压升到100KV，样品杆倾转12.0度；
(2)在Mag2模式下观察超薄切片，在5万倍下寻找纳米颗粒；
(3)找到纳米颗�：螅缇底坏侥芷啄Ｊ剑纪ü芷资占紫撸奔涑Ｊ栉�25us，收集一段时间后，通过软件识别谱线图中是否有金的特征峰，如有说明所观察到的纳米颗粒为金纳米颗粒，若无金特征峰，返回观察模式继续寻找，对所观察的颗粒进行能谱谱线收集，直到确认找到的是金纳米颗粒；
(4)根据细胞超微结构知识确认纳米金的亚细胞定位。
权利要求
1.透射电镜和能谱原位识别嗜热四膜虫体内纳米金的方法，其特征在于:利用透射电镜和能谱，观察纳米金在嗜热四膜虫体内的定位。
2.按照权利要求1所述的透射电镜和能谱原位识别嗜热四膜虫体内纳米金的方法，其特征在于观察的生物为嗜热四膜虫，纳米颗粒为金，其粒径为13纳米。
3.按照权利I所述的透射电镜和能谱原位识别嗜热四膜虫体内纳米金的方法，其特征在于实验流程为: (1)合成纳米金并用其处理处于对数期的嗜热四膜虫24小时； (2)通过常规生物电镜制样方法对嗜热四膜虫进行固定、脱水、包埋、切片、染色； (3)用透射电镜和能谱识别纳米金在嗜热四膜虫体内的定位。
4.按照权利要求1所述的透射电镜和能谱原位识别嗜热四膜虫体内纳米金的方法，其特征在于透射电镜和能谱的参数设置为: (1)透射电镜加速电压为80-100KV； (2)样品杆倾斜角度为11.5-12.5度； (3)能谱时间常数为25-100us。
全文摘要
本发明提供了一种用于透射电镜和能谱原位识别嗜热四膜虫体内纳米金的方法，其特征在于通过将嗜热四膜虫在含有纳米金的液体培养基里培养一段时间后，经过固定、脱水、渗透和包埋等步骤，最后以超薄切片机下切得50-70纳米厚超薄切片，捞网晾干，醋酸铀和柠檬酸铅染色后电镜下观察，看到颗�：笥媚芷兹啡希痉⒚髂芄慌懦渌又誓擅卓帕５母扇牛迪衷还鄄焓热人哪こ嫣迥谀擅捉鹂帕＃徊搅私饽擅卓帕Ｔ谏锾迥诘难反还毯推兰燮渖锒拘蕴峁┯行У姆治龇椒�。
文档编号G01N23/02GK103163162SQ20111041507
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月14日 优先权日2011年12月14日
发明者徐斌, 张洪武, 史俊朋, 马春艳, 沈江珊, 石建稳, 刘兴强 申请人:中国科学院城市环境研究所
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