专利名称：用于生理体液多指标联合检测的半导体芯片及系统的制作方法
用于生理体液多指标联合检测的半导体芯片及系统技术领域：
本发明属于半导体传感器及其检测系统、生物医学检验领域。背景技术：
本发明的理论基础为免疫分析、光寻址电位传感器(light addressablepotentiometric sensors, LAPS)、电化学测试技术。1、生理体液中多指标联合检测生理体液中多指标联合分析是现代临床医学诊断过程的重要环节之一，特别是在肿瘤类疾病的早期筛查、病程鉴定、疗效评估中，具有重要的辅助诊疗价值[1’2’3]。其中的“指标”是指体液中的某种抗原、抗体、酶等生物物质，此类物质的异常表示人体可能潜在某种疾病。免疫分析是实现此类物质检验的理论基�。矗每固�、抗原之间的特异性结合，实现对体液中某项生理指标的检验。然而，免疫响应过程是一个微观过程，为了使检验结果具有可测性，传统的检验方法需要借助于示踪标记物，例如荧光标记^]，电致化学发光标记[5]、化学发光[6]、量子点标记[7]等。传统免疫分析的过程是一种“生物-光-电”的转化过程，检测过程和设备较为复杂，首先需要对探针进行示踪物标记，这是一个复杂且高成本的过程；其次，根据所使用的示踪标记物，需要选择特定波长的激发光源，其目的是使示踪标记物受激后发出待测光；最后，完成点样、洗脱后的被测样本，放入检测设备中，利用光电转换器件及其系统，将检验结果显示在用户终端的电脑上。基于示踪标记物的传统检验系统，操作复杂，且设备成本较尚ο目前来讲，临床上生理体液中多指标联合分析，通常是对各个指标分别独立检测， 然后再综合分析。为实现生理体液中多种生理指标的同时检测，多指标联合检测系统成为研究热点，例如12种肿瘤标志物平行检测系统[1]，就是一种基于化学发光法的多指标联合检测系统。2、LAPS生物敏感机制典型LAPS敏感单元的剖面结构如图1所示，LAPS敏感单元由电解质溶液1、氮化硅层2、二氧化硅层3、ρ型Si衬底4构成，是整个传感器敏感机制的核心部分。LAPS生化敏感机制是半导体光电效应、表面电场效应、以及特异性生化反应三方面共同作用的结果， 简述如下P型Si衬底4下方设有红外光源5，根据半导体材料的光电效应，硅吸收红外波段的光子后，将产生“光生电子空穴对”，这些“光生电子空穴对”在浓度梯度的作用下向硅片上方扩散；P型Si衬底4的上方，从下向上依次为二氧化硅层3、氮化硅层2、电解质溶液1， 由于各种材料功函数的不同，在P型Si衬底4与二氧化硅层3的界面处，将产生空间电荷区；同时，利用电解质溶液1上部插入的参比电极6，可在LAPS施加一定的偏置电压，使得空间电荷区处于多子耗尽的状态；光照时，“光生电子空穴对”向上扩散，当其接近空间电荷层时，光生多子将被吸引进入空间电荷区，并填充其中的耗尽状态，而光生少子则堆积在空间电荷层边缘，形成了对空间电荷层的充电效应；光照停止后，积累在空间电荷层中的载流子就会被释放出来，形成放电效应。这样，当红外光源5，受到光源控制器7的控制，成为具有一定调制频率的光时，上述充、放电效应也将具有周期性；在工作电极8、对电极9之间构成的电路中，就可以测量到相应的电流或电压信号，这个信号就是laps的输出信号，称为光电流或光电压。LAPS的生化敏感机制，来自于对氮化硅层2表面的生物功能化处理，使其表面发生特异性生化反应，反应前后氮化硅层2与电解质溶液1之间的界面阻抗发生改变；当参比电极6上的偏置电压保持不变时，ρ型Si衬底4与二氧化硅层3界面处的有效界面势，将受到特异性生化反应的调制；与此同时，若红外光源5的强度、调制频率均保持不变时，LAPS 的输出信号就成为受这个特异性生化反应调制的生化敏感信号。3、LAPS的测试体系LAPS常采用三电极电化学测试体系，主要由参比电极6、对电极9 (又称辅助电极)、以及制作在P型Si衬底4底部的工作电极8构成。其中参比电极6为测量提供偏置电压，需具有稳定的、已知的电极电位，常采用Ag/AgCl电极、甘汞电极等；对电极9用来与工作电极8构成电流通路，应具有较大的表面积，常用钼黑电极。目前laps三电极测试体系的工作方式有三种te’9a°]恒压模式、恒流模式、恒相位模式。恒电压模式是指，保持参比电极6的电位不变，测量laps的输出信号变化；恒电流模式是指，利用反馈回路使laps的输出信号不变，调节参比电极6的电位，将其变化量作为测量结果；恒相位模式是指，利用反馈回路使laps的输出信号与光源10之间的相位差保持不变，测量参比电极6的电位变化。4、本发明的提出laps阵列型半导体芯片在ph图像传感领域[8]得到较多的研究，为实现生理体液中多指标联合检测，还有两个重要问题需要解决①芯片表面的生物功能化问题；②高密度阵列芯片中的点样问题。针对这些问题，分别从laps和生理体液多指标联合检测两方面，查阅有关文献和专利如下(1)有关laps的文献或专利Ddetection method for pathogenic microorganism withlight-addressable
POTENTIOMETRIC SENSOR ；Inventor :KIM HEE CHAN(KR) ；YUM DO YOUNG(KR) ；Publication info :KR20050110973-2005-11-242)METHOD FOR DETECTING SIGNAL FOR MULTI-CHANNEL LAPS；Inventor :BAESANG KON(KR) ；CHO JIN HO(KR) ；Publication info :KR20030086753-2003-l1-123)Genetically biotinylated recombinant antibody in immunofi1tration assay by light addressablepotentiometrie sensor for identification of Venezuelan equine encephalitis virus ；Inventor :FULT0N R ELAINE (CA) ；NAGATA LESLIE P(CA) ；Publication info :US2004229216-2004_11-184)Genetically biotinylated recombinant antibody in immunofiltration assay by light addressablepotentiometrie sensor for identification of Venezuelan equine encephalitis virus ；Inventor HUffEIGANG(CA) ；NAGATA LESLIE P(CA) ；Publication info :CA2462343-2004-09_255)Improvements in transducer devices with LAPS type structure ；Inventor =DELLA CIANALE0P0LD0；F0RTUNAT0 GUGLIELM0 ；Publication info IT1261339-1996-05-146)三维微结构光寻址电位传感器，发明人韩泾鸿，公开号11689757)多光源寻址电位传感器及并行处理的气体图象测试装置，发明人王平，张钦涛·公开号=2588448)用于检测狗的薄膜光寻址电位传感器及其制备方法，发明人王平，门洪，李毅，许祝安.公开号巧470039)用于检测Hg的薄膜光寻址电位传感器及其制备方法，发明人王平，门洪，李毅，许祝安.公开号巧4700410)Torsten Wagner, Carl Frederik fferne, Ko-ichiro Miyamoto. FPGA-based LAPS device for theflexible design of sensing sites on functional interfaces. Applications and Materials Science,4 844 ~ 849(2010)其中，国外专利中1)、5)和国内专利6)、7)、10)为LAPS器件及其检测技术的发明；3)、4)是在美国和加拿大分别注册的同一专利，其发明点为使用生物素(biotin)使 LAPS表面生物功能化，检测脑炎细菌；7)、8)、9)为LAPS在气体、狗离子、Hg离子检测中的应用。发明专利1)、6)、7)、10)，采用多路激发光源，每一个激发光源与敏感单元对准，特别是10)采用了新型激光阵列作为LAPS中的激发光源；5)主要采用多晶硅作为栅极，是对 LAPS中部分材料的发明创新。(2)生理体液的多指标联合检测是当前的科研热点，文献较多，其中与半导体材料或电学检测相关的文献，有如下几篇11) Label-free biomarker detection from whole blood，Nature Nanotechnology，5(2) :138. (2010).12)Direct label-free electrical immunodetection in human serum using a flow-through-apparatusapproach with integrated field-effect transistors， Biosensors and Bioelectronics 25:1767-1773(2010)13) Label-free capacitive biosensor for sensitive detection of multiple biomarkers using goldinterdigitated capacitor arrays, Biosensors and Bioelectronics 25 :2318-2323(2010)14)Label-Free Biomarker Sensing in Undiluted Serum with Suspended MicroChannel Resonators, Anal. Chem. 82(5) :1905-1910(2010)15)Label-Free Electrical Detection of Cardiac Biomarker with Complementary Metal-OxideSemiconductor-Compatible Silicon Nanowire Sensor Arrays, Anal. Chem.，81 :6266-6271 (2009)16) Biogenic nanoporous silica — based sensor for enhanced electrochemical detection ofcardiovascular biomarkers proteins， Biosensors and Bioelectronics 252336-2342(2010)其中，12)以场效应晶体管(field-effect transistor,FET)作为敏感器件；11)、 15)以量子线型 Τ阵列为敏感芯片；13)以电容型敏感阵列为敏感元件；14)为基于微悬臂梁型传感器的敏感阵列；16)以天然硅藻作为多孔敏感薄膜，并制备了用于心血管疾病标志蛋白的阻抗型器件。尚未发现，基于LAPS的生理体液多指标联合检测的报道。从现有的专利和文献来看，仅发现幻、4)两项与问题①有关，但这两项专利提出的表面生物功能化方法进限于脑炎细菌，若要实现生理体液中多指标联合检测，仍具有一定局限性；对于问题②，除参考文献[1]指出使用点样机“Cartesian inkjet printer, GT5000 Gantry System”外，这种方法点样成本较高，其它点样方式未见报道。
发明内容本发明目的是解决现有技术存在的上述不足，提供一种用于生理体液多指标联合检测的半导体芯片及其系统。用于生理体液多指标联合检测的半导体芯片及系统，依次包括电解质溶液、参比电极、对电极、工作电极、敏感阵列芯片、光源阵列芯片、电化学工作站、锁相放大器、光源控制器、电脑，敏感阵列芯片由底部至表面依次为，P型Si衬底、二氧化硅层、氮化硅层、左旋多巴敏感薄膜，在P型Si衬底与二氧化硅层之间设有P+-Si区域，相邻P+-Si区域构成敏感阵列芯片的敏感单元、P型Si衬底的底部设有光源腔体，光源阵列芯片的上部设有光源点、 光源阵列控制电极，其特征为，敏感阵列芯片下底面与光源阵列芯片上表面相连，并且光源点嵌入光源腔体内，光源腔体放置于敏感单元中轴线处，工作电极设于敏感阵列芯片上部并穿过氮化硅层、二氧化硅层与P+-Si区域接触，工作电极与锁相放大器的正向输入端相连，参比电极、对电极分别与电化学工作站的参比电极端口、对电极端口相连，电化学工作站的工作电极端口与锁相放大器、地电极相连，光源控制器的输出端口与光源阵列控制电极相连，锁相放大器的频率输出端口与光源控制器的频率控制端口相连，电脑分别与电化学工作站的USB端口、锁相放大器的RS-232端口相连。图2、图3为本发明提出的用于生理体液多指标联合检测的半导体芯片及系统。 光源阵列芯片17位于敏感阵列芯片16的下部，且光源点21嵌入光源腔20内(如图2所示)，光源阵列芯片17中光源点21的寻址、发光功率、调制频率由光源控制器7控制。敏感阵列芯片16内制作有900个敏感单元22，并排列为30行X30列矩阵的形式(如图3所示)，且该矩阵与工作电极8分别制作在敏感阵列芯片16的两个对角端，以保证电气连接远离液态被测环境。参比电极6、对电极9、工作电极8构成三电极测试体系，与锁相放大器 10、电化学工作站11各指定端口相连(如图2所示)。下面对其创新点进行说明芯片表面的生物功能化图2中左旋多巴敏感薄膜19为利用自组装法制作的生物敏感膜。目前半导体生化传感器研究中普遍采用的基于化学试剂的化学交联方法[11’12]，本发明中使用了一种基于左旋多巴的仿生活化新方法，检索文献未见报道。左旋多巴是蛘类黏性蛋白质(MAPs)中的一种双功能氨基酸[13]，是生物分子交联的良好生物启动因子[14’15]，是固态载体(如金属、二氧化硅)上聚合过程的生物启动因子，它可将无机的固态载体转化为易于进行聚合反应的活化固态载体。本发明中利用左旋多巴分子M(如图4所示)作为氮化硅层2的生物启动因子，利用左旋多巴分子M上的羧基基团与待固定抗体分子25结合，从而在敏感阵列芯片 16上制备出左旋多巴敏感膜19。高密度阵列芯片中的点样图2中敏感单元22排列成高密度矩阵形式，为实现高密度阵列的点样，本发明提供相匹配的微流体芯片30及点样系统，如图5、6所示。将微流体芯片30紧压在敏感阵列芯片16上表面，且流体沟道31 (如图5所示)与敏感单元22的行或者列重合，其中微流体芯片采用PDMS材料，具有透明性，便于对准操作。这样，通过微流泵沈，就可以向流体沟道内泵入指定抗体分子25的溶液(或者待测生理体液的样液)，从而完成对敏感单元22的点样操作。本发明的优点和积极效果首先，本发明提出的“用于生理体液多指标联合检测的半导体芯片及系统”，既解决了芯片表面的生物功能化问题，与传统的化学交联方法相比具有较好的生物兼容性；也解决了高密度芯片中敏感单元的点样问题。其次，本发明提出的“用于生理体液多指标联合检测的半导体芯片及系统”，是一种无标记的多指标联合检测系统，具有无标记多指标联合检测系统的优势，即摆脱了传统方法对示踪标记过程的依赖，具有快速、灵敏、低成本、高通量的优点[16’17]，是研发 POC(point of care)手持式医学诊疗设备的核心技术。此外，与文献报道的其它无标记检测系统相比，本发明以LAPS作为基本模型，将高密度光源阵列芯片17与敏感阵列芯片16集成于一体，因此具有寻址精度高、点阵密度高、芯片制作工艺简单、集成度高、等优点[8_⑵。
图1为现有技术中典型LAPS敏感单元示意图。图2为用于生理体液多指标联合检测半导体芯片剖面图及系统结构示意图。图3为用于生理体液多指标联合检测半导体芯片立体结构示意图。图4为左旋多巴敏感膜制备过程示意图。图5为用于生理体液多指标联合检测半导体芯片的微点样系统结构示意图。图6为用于生理体液多指标联合检测芯片及系统的PDMS微流体芯片结构示意图。其中1 电解质溶液；2 氮化硅层；3 二氧化硅层；4 :p型Si衬底；5 光源；6 工作电极；7 光源控制器；7-1 光源控制器的输出端口 ；7-2 光源控制器的频率控制端口 ； 8 工作电极；9 对电极；10 锁相放大器；10-1 锁相放大器输入端(正)；10-2 锁相放大器输入端(负)；10-3 锁相放大器辅助频率输出端；10-4 锁相放大器RS-232通讯端口 ； 11 电化学工作站；11-1 电化学工作站参比电极端口 ；11-2 电化学工作站对电极端口 ； 11-3 电化学工作站工作电极端口 ； 11-4 电化学工作站USB端口 ； 12 电脑；13 =USB电缆； 14 :RS-232电缆；15 地电极；16 敏感阵列芯片；17 光源阵列芯片；18 光源阵列控制电极；19 左旋多巴敏感膜；20 光源腔；21 光源点；22 敏感单元；23 :p+_Si区域；24 左旋多巴分子；25 抗体分子；26 微流泵；27 导管；28 流体入口 ；29 流体出口 ；30 微流体芯片；31 微流体沟道。
具体实施方式实施例1本发明提供的用于生理体液多指标联合检测半导体芯片，依次包括左旋多巴敏感膜19、氮化硅层2、二氧化硅层3、ρ型Si衬底4、p+-Si区域23、工作电极8、光源腔20、光源阵列芯片17。采用微米级集成电路工艺，即可完成本发明中半导体芯片的制备，基本工艺顺序为Dp+-Si区域23的制备，所需工艺为湿氧氧化工艺、光刻工艺、扩散工艺、清洗工艺；2) 二氧化硅层3的制备干氧氧化工艺；3)氮化硅层2的制备低压化学气相淀积工艺；4)光源腔20的制备湿法腐蚀工艺5)光源阵列芯片17的固定粘合工艺(可使用硅胶或环氧树脂)6)左旋多巴敏感膜19的制备使用左旋多巴的酸性溶液处理氮化硅层2，使左旋多巴分子对以氢键固定在敏感阵列芯片16的氮化硅层2表面；使用蛋白质抗体25的溶液处理上一步骤后的敏感阵列芯片，使左旋多巴分子M上的羧基与蛋白质抗体25的羟基发生缩水反应，将蛋白质抗体25固定在敏感阵列芯片16表面。参考文献_[1]Zhenghong Sun, Xiaoli Fu, Lu Zhang, Xiaoli Yang, Feizhou Liu, Gengxi Hu. A Protein Chip System forParallel Analysis of Multi-tumor Markers and its Application in Cancer Detection. Anticancer Research 24:1159-1166(2004)[2]Quan Liao,Yu-Pei Zhao,Ying-Chi Yang,Li-Jun Li,Xiao Long and Shao-Mei Han. Combined detection ofserum tumor markers for differential diagnosis of solid lesions located at the pancreatic head. HepatobiliaryPancreat Dis. Int. Vol 6(6) :641-645(2007)[3]Martin Donach,Yinhua Yu,Grazia Artioli,Giuseppe Banna, Weiwei Feng, Robert C.Bast, Zhen Zhang, MariaO. Nicoletto. Combined use of biomarkers for detection of ovarian cancer in high-risk women. Tumor Biol. 31 :209-215(2010)[4] J. H. Lee, H. K. Choi, J. H. Chang J. H. Lee, H. K. Choi, J. Ho Chang. Optimization of biotin labeling ofantibodies using mouse IgG and goat anti-mouse IgG-conjugated fluorescent beads and their application ascapture probes on protein chip. Journal of Immunological Methods,vol. 362,pp. 38-42(2010)[5]Ying Xu, Ping Dong, XiaoYan Zhang, PinGang He and YuZhi Fang, "Solid-state electrochemiluminescenceprotein biosensor with aptamer substitution strategy, "Science China Chemistry,vol. 54,no. 7,pp. 1109-1115. (2011)[6]M. T. Hossain, T. Shibata, T. Kabashima, M. Kai, "Aptamer-Mediated Chemiluminescence Detection of PrionProtein on a Membrane Using Trimethoxyphen ylglyoxal, "Analytical Sciences, vol. 26, no. 6,pp.645-647. (2010)[7] J. Liu, Q. Huang, X.Wang, Q. Yang, H. Chen, "Applications of Quantum Dots in Biological Analysis andBiomedical Diagnosis, "Progress in Chemistry,vol. 22, no. 6，pp.1068-1076. (2010)[8]Nakao M, Yoshinobu T, Iwasaki H. Scanning-laser-beam semiconductor pH-imaging sensor. Sensors andActuators B ;20 :119-123(1994)
[9]Tatsuo Yoshinobu, Holger Ecken, Arshak Poghossian, Anette Simonis, Hiroshi IwasakiiHans LuthiMichael J. Schoning. Constant-Current-Mode LAPS (CLAPS) for the Detection of Penicillin. Electroanalysis, 13 :733-736 (2001)[10]Ko-ichiro Miyamoto, Torsten Wagner, Shuhei Mimura， Shin ' ichiro Kanoh, Tatsuo Yoshinobu， MichaelJ. Schoning. Constant-phase-mode operation of the light-addressable potentiometric sensor. Procedia Chemistryl :1487-1490 (2009)[ 11 ] A. Sibbald，A. K. Covington, R. F. Carter. Simultaneous On-Line Measurement of Blood K+，Ca2+，Na+，andpH with a Four-Function Chem FET Integrated-Circuit Sensor. CLIN. CHEM. 30(1) :135-137(1984)[12]顾丽波，韩泾鸿，崔大付，张虹.甲胎蛋白光寻址电位式传感器的研究.分析化学，33(1) :17-12(2005)[13]Xiaowu Fan，Lijun Lin, Jeffrey L. Dalsin, Phillip B. Messersmith. Biomimetic Anchor for Surface-InitiatedPolymerization from Metal Substrates. J. Am. Chem. Soc. 127 (45)，pp 15843-15847 (2005)[14]Raphae ” 1 Barbey, Laurent Lavanant, Dusko Paripovic, Nicolas Schu.. wer，Caroline Sugnaux, Stefano Tugulu，Harm—Anton KloLPolymer Brushes via Surface-Initiated Controlled Radical Polymerization. Chem. Rev. 109， 5437-5527(2009)[15]Hari Shankar Biswas, Jagannath Datta,D. P. Chowdhury,A. V. R. ReddyiUday Chand Ghosh，ArvindKumar Srivastava, Nihar Ranjan Ray. Covalent Immobilization of Protein onto a functionalizedHydrogenated Diamond-like Carbon Substrate. Langmuir 26(22) :17413-17418(2010)[16] Jay Huiyi Chua, Ru-Ern Chee，Ajay Agarwal，She Mein Wong, Guo-Jun Zhang， Label-Free ElectricalDetection of Cardiac Biomarker with Complementary Metal-Oxide Semiconductor-Compatible SiliconNanowire Sensor Arrays,Anal. Chem., 81 :6266-6271. (2009)[17]Eric Stern，Aleksandar Vacic，Nitin K. Rajan, Jason M. Criscione, Jason Park，Bojan R. Ilic，David J. Mooney, Mark A. Reed, Tarek M. Fahmy, Label-free biomarker detection from whole blood. Nature Nanotechnol，5(2) :138-149. (2010)
权利要求
1.用于生理体液多指标联合检测的半导体芯片及系统，依次包括电解质溶液、参比电极、对电极、工作电极、敏感阵列芯片、光源阵列芯片、电化学工作站、锁相放大器、光源控制器、电脑，敏感阵列芯片由底部至表面依次为，P型Si衬底、二氧化硅层、氮化硅层、左旋多巴敏感薄膜，在P型Si衬底与二氧化硅层之间设有P+-Si区域，相邻P+-Si区域构成敏感阵列芯片的敏感单元、P型Si衬底的底部设有光源腔体，光源阵列芯片的上部设有光源点、光源阵列控制电极，其特征为，敏感阵列芯片下底面与光源阵列芯片上表面相连，并且光源点嵌入光源腔体内，光源腔体放置于敏感单元中轴线处，工作电极设于敏感阵列芯片上部并穿过氮化硅层、二氧化硅层与P+-Si区域接触，工作电极与锁相放大器的正向输入端相连， 参比电极、对电极分别与电化学工作站的参比电极端口、对电极端口相连，电化学工作站的工作电极端口与锁相放大器、地电极相连，光源控制器的输出端口与光源阵列控制电极相连，锁相放大器的频率输出端口与光源控制器的频率控制端口相连，电脑分别与电化学工作站的USB端口、锁相放大器的RS-232端口相连。
全文摘要
用于生理体液多指标联合检测的半导体芯片及系统，属于半导体传感器及其检测系统和生物医学检验领域。本发明利用免疫分析、半导体器件物理及其工艺，实现多种生理指标的无标记联合检测，并具有寻址功能。其中，在p型Si衬底的下表面制作有光源腔，二氧化硅层和氮化硅层由下至上依次位于p型Si衬底上；氮化硅层上表面制备有左旋多巴敏感膜；光源阵列芯片上的光源点嵌入光源腔内部，实现光源点与敏感单元的对准，具有高精度光寻址的优点；芯片的测控系统包括，电化学工作站、锁相放大器、光源控制器、电脑。本发明的半导体芯片及系统，其点样过程采用微流体技术，有利于降低点样成本；检测过程具有无标记的特点，可将生理体液的多种被测生理指标转化为工作电极与对电极之间的电信号，并实时采集与记录；同时，由于采用了左旋多巴敏感膜，具有较好的生物兼容性。
文档编号G01N33/561GK102360009SQ20111020600
公开日2012年2月22日 申请日期2011年7月22日 优先权日2011年7月22日
发明者贾芸芳 申请人:南开大学
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
