专利名称：一种检测产黄曲霉毒素的寄生曲霉的免疫传感器及其制备方法
技术领域：
本发明属于致病真菌快速检测技术领域，具体是基于抗原与抗体反应，用于检测产黄曲霉毒素的曲霉菌的无标记型免疫生物传感器及其制备方法。
背景技术：
黄曲霉毒素是一种剧毒和强致癌物质，为迄今发现的各种真菌毒素中最稳定的一种，1988年即定为I级致癌物，其毒性为氰化钾的10倍、砒霜的68倍。黄曲霉毒素分布范围很广，几乎所有谷物、饲料和各种食品(包括畜产品)都可作为产黄曲霉毒素菌的生长基质，严重�：θ死嗟慕】�。而预防黄曲霉毒素的�：Γ滓跫悄芄豢焖僮既返丶觳獬龉任�、食品等是否受产黄曲霉毒素曲霉菌的污染。目前，产黄曲霉毒素曲霉菌的检测方法主要包括传统鉴别培养基法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、PCR及RT-PCR技术。鉴别培养基法取材方便，但样品预处理复杂、操作过程比较繁琐、检测周期长，敏感度低，费时又费力。ELISA需要特殊的仪器设备，检测步骤较为繁琐、费用高、检测时间长，且易出现假阳性。多重PCR、实时荧光定量 PCR的分子水平的检测方法的发展虽然比传统方法具有优越性，但所需仪器设备昂贵、检测过程复杂、成本较高、对检测环境和操作人员专业技术要求较高、所使用的试剂对人体和环境均有较大的危害，且由于产毒基因的复杂性使此方法特异性欠佳。因此建立一种灵敏、快速、简便、特异性高且经济的检测方法是生产经营企业、质控人员、进出口检商、政府管理部门的迫切需要和食品、环境安全的有力保障。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供了一种用于检测产黄曲霉毒素的寄生曲霉的免疫传感器，是将含巯基的L-半胱氨酸、纳米金和寄生曲霉菌多抗依次修饰到金电极上，得到免疫电化学传感器。优选地，所述的L-半胱氨酸用0. 1-0. 3mol/L醋酸盐缓冲液进行溶解的。优选地，所述的纳米金为10nm-20nm的纳米金颗粒。进一步地，所述的寄生曲霉菌多抗可以购买商品化的产品或自制得到，具体方法见参考文献(Yong and Cousin，2003. Detection of moulds producing af latoxins in maize and peanuts by an immunoassay. International Journal of Food Microbiology 65 (27))，是利用摇床培养制取寄生曲霉菌丝体蛋白免疫原，免疫健康雄性新西兰大白兔而制备的多克隆抗体。更进一步地，所述的的金电极是指直径为2mm且置于Piranha溶液中浸泡IOmin 后，分别用0. 3 μ m、0. 05 μ m的Al2O3抛光粉打磨后，在无水乙醇、超纯水中各超声5min的金电极。本发明还提供了一种上述免疫电化学传感器的制备方法，是将金电极浸没于
3L-半胱氨酸溶液中，保温浸泡。然后，沉积纳米金，2-6°C静置过夜，取出后，用超纯水洗涤、 吹干。电极表面涂滴寄生曲霉菌多抗并孵育。最后滴加脱脂乳-PBS溶液，作为遮蔽试剂进行封闭，用超纯水洗涤干净。 所述L-半胱氨酸溶液浓度为0. 3 % -0. 7 % (m/v)，优选浓度为0. 5 % (m/v)。所述保温浸泡的温度为35_40°C，浸泡3H所述静置过夜温度优选4°C。所述在电极表面涂滴寄生曲霉菌多抗优选为3-15 μ L0所述遮蔽试剂封闭过程优选滴加5%脱脂乳-PBS溶液10 μ L，于37°C反应后用超纯水洗涤干净。本发明所述寄生曲霉菌优选分泌黄曲霉毒素的寄生曲霉GIM3. 395(广东微生物菌种保藏中心 http //www. gimcc. net/)。本发明还提供了一种上述免疫传感器检测产黄曲霉毒素的寄生曲霉的方法，包括以下步骤1)待测样本滴加于免疫传感器的工作电极表面，37°C下孵育30min ；2)免疫传感器置于电解池中，电解池的检测底液为含0. lmol/LKCl的2. 5mmol的铁氰化钾缓冲液；3)设定适宜的扫描参数，进行循环伏安(CV)以及交流阻抗(EIS)测定。实验结果显示随着寄生曲霉菌浓度地增加，其阻抗值增加。定义在封闭之后的免疫工作电极的阻抗值为Rtl,抗原抗体反应后的电极阻抗值为Rx，并计算ARrt = Rx-R0,以 ARet对GIM3. 395的稀释度作图可得到线性曲线。寄生曲霉菌浓度在75-1500cfu/mL范围内具有良好的线性相关，线性相关系数R2 = 0. 99114。最低检测限可达到18cfu/mL。本发明有如下的有益效果由于纳米金颗粒有很好地促进生物电活性分子的电子传递，并易于固定生物分子并能保持其活性，并且由于L-半胱氨酸的作用，抗体有效地固定在修饰金电极表面，并保持了较高的活性。本发明的免疫传感器操作简便、价格低廉、特异性强、灵敏度高、响应时间短，可实现对产毒曲霉菌寄生曲霉GIM3. 395的直接检测，适合基层或现场检测。本发明适用于食品工业、饲料行业和环境保护等领域快速检测出早期产黄曲霉素曲霉菌，以有效地预防黄曲霉毒素的产生。
图1是免疫传感器工作原理示意图；图中(a)自组装L-半胱氨酸单分子层(b)纳米金颗粒吸附(C)产黄曲霉毒素曲霉菌抗体的吸附(d)脱脂乳进行位点封闭(e)抗原抗体特异性结合反应图2是修饰电极不同条件下的循环伏安图；图中(a) L-半胱氨酸修饰后金电极(b)纳米金L-半胱氨酸修饰后金电极(c)抗体/纳米金L-半胱氨酸修饰后金电极(d)脱脂乳封闭后的修饰电极图3是纳米粒子的电子扫描显微镜照片(80000倍)。图4是免疫传感器对不同浓度的寄生曲霉GIM3. 395的EIS响应图中(a) 75cfu/mL (b) 88cfu/mL (c) 167cfu/mL (d) 300cfu/mL (e) 1500cfu/mL(f) 3000cfu/mL (g) 6000cfu/mL (h) 7500cfu/mL (i)lOOOOcfu/mL (j) 15000cfu/ mL (k)30000cfu/mL
具体实施例方式下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程。实施例1步骤一，免疫传感器的构建将裸金电极打磨、清洗后，先浸没于0. 3% -0. 7% (m/ ν)的L-半胱氨酸中，35-40°C保温浸泡3H然后，4°C静置过夜沉积纳米金，取出后，用超纯水洗涤、吹干。电极表面涂滴3-15 μ L自制多抗，37°C孵育lh。最后滴加5%脱脂乳-PBS 溶液10 μ L，作为遮蔽试剂对非特异性吸附位点进行封闭，于37°C反应后用超纯水洗涤干净。未立即使用的电极需用氮气吹干后，置于pH为7. 4的PBS于4°C保存待用。步骤二，免疫传感器对寄生曲霉菌孢子液的检测寄生曲霉菌于^°C，PDA斜面固体培养基上培养5-7天，用IOmL的含0. 05 %吐温的霉菌蒸馏水洗脱孢子，制备孢子悬浮液。调整孢子浓度为1.5X106cfu/mL，后对孢子液进行无菌梯度稀释。将修饰好的免疫电极浸入不同梯度的稀释液中，孢子液抗原与电极上的抗体进行37°C下孵育反应30min，在 0. lmol/LKCl的2. 5mmol的铁氰化钾缓冲液中进行EIS测定。EIS的测试条件初始电位为 0.2￥，振幅0.05￥，频率范围为1 IOOkHz，静置时间为2s，所有测试均在室温下进行。定义在封闭之后的免疫工作电极的阻抗值为Rtl，抗原抗体反应后的电极阻抗值为Rx，并计算 ARrt = Rx-Rtl，以ARrt对标准菌株寄生曲霉的稀释度作图可得到线性曲线，实现对产黄曲霉毒素曲霉寄生曲霉菌孢子液的检测。实施例2自然发酵豆酱实际样品中加标寄生曲霉菌的测定步骤一，自然发酵豆酱样品的处理豆酱样品磨细后灭菌，在无菌操作下取2g豆酱，用1 1000的灭菌超纯水进行稀释，并加入寄生曲霉菌孢子标准品，使其最终浓度为 150-1500cfu/mL。并配置一个不含寄生曲霉菌孢子的豆酱的空白对照。步骤二，免疫传感器的构建将裸金电极打磨、清洗后，先浸没于0.5% (m/v)的 L-半胱氨酸中，37°C保温浸泡证。然后，4°C静置过夜沉积纳米金，取出后，用超纯水洗涤、 吹干。电极表面涂滴1(^1^自制多抗，371孵育111。最后滴加5%脱脂乳-PBS溶液10 μ L， 作为遮蔽试剂对非特异性吸附位点进行封闭，于37°C反应后用超纯水洗涤干净。未立即使用的电极需用氮气吹干后，置于pH为7. 4的PBS于4°C保存待用。步骤三，自然发酵豆酱实际样品中加标寄生曲霉菌GIM3. 395的测定将修饰好的免疫电极浸入不同加标豆酱样品液中，加标抗原与电极上的抗体进行37°C下孵育反应 30min，在0. lmol/L KCl的2. 5mmol的铁氰化钾缓冲液中进行EIS测定。查工作曲线得到曲霉菌浓度，计算回收率，回收率结果如表1。表1为免疫传感器自然发酵豆酱实际样品中寄生曲霉菌加标回收率及误差结果。
权利要求
1.一种检测产黄曲霉毒素的寄生曲霉菌的免疫生物传感器，其特征在于，是将含巯基的L-半胱氨酸、纳米金、寄生曲霉菌多抗依次修饰到金电极上得到的生物传感器。
2.根据权利要求1所述传感器，其特征在于，所述的L-半胱氨酸用0.1-0.3mol/L醋酸盐缓冲液进行溶解，L-半胱氨酸溶液浓度为0. 3%-0. 7%。
3.根据权利要求1所述传感器，其特征在于，所述的纳米金为10nm-20 nm的纳米金颗粒。
4.根据权利要求1所述传感器，其特征在于，所述的的金电极是指直径为2mm且置于 Piranha溶液中浸泡10 min后，分别用0. 3 μ m、0 . 05 μ m的Al2O3抛光粉打磨后，在无水乙醇、超纯水中各超声5min的金电极。
5.一种检测寄生曲霉菌免疫生物传感器的制备方法，其特征在于，将金电极浸没于 L-半胱氨酸溶液中，保温浸泡；沉积纳米金，2-6°C静置过夜，取出后，用超纯水洗涤、吹干； 电极表面涂滴寄生曲霉菌多抗并孵育；滴加脱脂乳-PBS溶液，作为遮蔽试剂进行封闭，用超纯水洗涤干净。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，具体方法如下将金电极浸没于0.5%的 L-半胱氨酸溶液中，37°C保温浸泡5 h;然后，沉积纳米金，4°C静置过夜，取出后，用超纯水洗涤、吹干；电极表面涂滴IOyL自制多抗，37°C孵育Ih;最后滴加5%脱脂乳-PBS溶液 10 μ L，作为遮蔽试剂进行封闭，于37°C反应后用超纯水洗涤干净。
7.—种权利要求1所述传感器的应用，其特征在于，包括以下步骤1)待测样本滴于如权利要求1所述免疫传感器的工作电极表面，37°C下孵育30min；2)免疫传感器置于电解池中，电解池的测试液为含0.lmol/LKCl的2. 5mmol的铁氰化钾缓冲液；3)设定适宜的扫描参数，进行循环伏安以及交流阻抗测定。
全文摘要
本发明公开了一种检测产黄曲霉毒素的寄生曲霉菌的免疫生物传感器及其制备方法，通过将纳米金、L-半胱氨酸、寄生曲霉菌多抗自组装修饰到金电极上得到。它将纳米金的化学放大功能与免疫传感器的特异性相结合，融合两者的优点，使其同时具备免疫反应的特异性和电化学分析的快速性和灵敏性，能准确地进行低含量的产黄曲霉毒素的寄生曲霉菌的检测。
文档编号G01N33/569GK102520168SQ20111038172
公开日2012年6月27日 申请日期2011年11月25日 优先权日2011年11月25日
发明者吴龙云, 孙秀兰, 张银志, 晏丽, 王淼, 赵建新 申请人:江南大学
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