专利名称：：光度法测定无水葡萄糖细菌内毒素含量的方法
技术领域：
：本发明属于分析化学领域，涉及一种光度法测定无水葡萄糖细菌内毒素含量的方法。
背景技术：
：由于注射引起哺乳动物和热体发热的一类物质，统称为热源，在GMP(药品生产管理规范)条件下生产的注射剂污染的热源就是细菌内毒素。而细菌内毒素是嵌在G—菌细胞壁的脂多糖结构(无毛状物)，能引起哺乳动物和人体发热。所以说，很多的用无水葡萄糖的输液厂家，都很注重糖中细菌内毒素的含量，以便避免人体的输液反应。现国家药典中，只对葡萄糖输液的内毒素含量进行了规定，而对无水葡萄糖原料药没有界定。一般的细菌内毒素的检査法为凝胶法，凝胶法对于试验的温度、时间控制很严格，并且一次只能是有限的试验样品数量，否则在实验的时间和温度控制上就会出现误差。因为细菌内毒素检査的误差限值在50%《入《200%，所以在出检测报告的时候，以最大误差计算，例如我们用灵敏度为0.5EU/mL的鲎试剂作凝胶试验，如果样品在此灵敏度下凝胶，则说明样品的内毒素含量小于1.0EU/mL。样品中的内毒素含量的具体数值不能准确地知道。并且当内毒素的含量小于0.03EU/mL时，用凝胶法容易产生假阳性，使结果出现错误判断，误导生产，给企业造成不必要的损失。
发明内容为解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种利用光度法测定无水葡萄糖细菌内毒素含量的方法，应用该方法，可定量的检测出无水葡萄糖中内毒素的具体含量。本发明所述的光度法测定无水葡萄糖细菌内毒素含量的方法，是一种利用光度法检测鲎试剂与内毒素反应后混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，确定待测无水葡萄糖样品中内毒素的具体含量的方法。利用这一原理，用已知含量的内毒素工作标准品，稀释成不同含量的工作标准品系列，测定出不同内毒素含量标准对应达到预设吸光度对应的时间，绘制出标准曲线。然后在一定条件下测定待测无水葡萄糖样品达到预设值所需要的时间，从而可计算出待测无水葡萄糖样品中内毒素的具体含量。上述细菌内毒素含量测定方法的具体测试步骤如下将无水葡萄糖用细菌内毒素检査用水稀释成5%的溶液，然后加入到盛有0.1ml定量鲎试剂的测试管中，同时做阳性对照液，漩涡混匀后放入内毒素定量测定仪中，仪器自动进行数据采集，通过与原输入的标准曲线对比，计算出无水葡萄糖细菌内毒素含量。本发明测试方法与凝胶法的比较如下<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>具体实施例方式本发明所述检测方法是通过以下试验来建立和确认的。一、标准曲线的制作和考察1、标准曲线的制作首先将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水lmL溶解，在漩涡混合器上混匀15分钟，然后制备成2EU/mL、1EU/mL、0.5EU/mL、0.125EU/mL、0.0325EU/mL备用，然后将复溶好的光度测定法鲎试剂分装到IO支定量分析专用试管中，每管分装O.lmL，接着将内毒素加入定量分析专用试管中，每个浓度做两支平行管，每管加量0.2ml，剩余两管各加入BET用水(细菌内毒素检査用水)0.2ml作为阴性对照。标准曲线的有效性考察<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>结论线性方程LogT=2.9783-0.2621LogC，相关系数Y=-0.9999，标准曲线符合规定。二.待测样品的制备方法和步骤阴性对照液在定量测试管中，加入0.2ml的内毒素检查用水，加入0.1ml的定量鲎试剂，混匀后，用封口膜封好。供试品液将5%的无水葡萄糖溶液0.2ml加入装好鲎试剂的试管中轻轻摇匀，也可在旋涡混合器上轻轻振荡一下，加样时千万要注意不要使溶液产生气泡，否则会影响光电检测，用封口膜将试管口封好。阳性对照无水葡萄糖5%的阳性对照吸取0.15mlBET水、0.15ml2EU/ml的细菌内毒素标准、0.30mllOM无水葡萄糖样品液到一小试管中，混合。然后吸取混合液0.2ml到含有0.1ml鲎试剂的定量小试管中，混合后，用封口膜封好。三.干扰试验1、限度的确定2005年版《中国药典》二部正文葡萄糖注射液L=0.5EU/mL此葡萄糖注射液的浓度为10%，故折算成固体葡萄糖的量为5EU/g，因为水中本身也含有一定量的内毒素，因此确定固体葡萄糖产品的内毒素为2.5EU/g。2、干扰试验的浓度的计算按照药品检验指导原则，供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C=X/L=0.0325/2.5=0.13g/ml。3、光度测定法干扰试验溶液的制备<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>A:稀释倍数未超过MVD的供试品溶液浓度为l.Omg/ml或0.5mg/ml，检査结果用ct。B:假如标准曲线中点或靠近中点的一个已知内毒素浓度的0.5EU/ml，且与溶液A有相同稀释倍数的供试液，检查结果用Cs。C:标准曲线的可靠性试验项下描述的，用于制备标准曲线的标准内毒素溶液。D:阴性对照。按所得线性回归方程分别计算供试品溶液和含标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量Q和Cs，再按下式计算试验条件下的回收率(R)。R=(Cs-Ct)/XmX100%当内毒素的回收率在50%200%之间，则认为在该试验条件下供试品溶液不存在干扰作用。4、供试品溶液无水葡萄糖的稀释用细菌内毒素检查用水，将无水葡萄糖稀释成10%的葡萄糖溶液，并将10%的葡萄糖液稀释到2倍原液和4倍原液。5、干扰试验的系列的制备方法取葡萄糖2倍稀释液、4倍稀释液，分别加入六支试管中，每管加0.3ml，，然后分别吸取0.3ml的内毒素标准溶液，浓度为l.OEU/ml加入其中两支试管中，另外吸取0.3ml的检査用水加入其中另外两支试管中，将四支试管混合均匀可得到10%葡萄糖的溶液的2倍、4倍稀释液干扰试验所用的样品溶液6、干扰试验加样方法取分装了O.lml定量鲎试剂的专用试管8支。葡萄糖4倍、8倍稀释液干扰试验各4支，加样量为0，2ml。将样完毕后密封试管，将每支在漩涡混合器上点13秒，然后将试管插入定量检测仪，仪器开始采集数据。7、试验结果记录见下表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>11<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>结论-无水葡萄糖的5%及10%溶液内毒素的回收率接近100%，平行样间的变异系数小于10%，符合试验要求，并由此得知，无水葡萄糖内毒素含量为零。权利要求1、一种光度法测定无水葡萄糖细菌内毒素含量的方法，其特征是一种利用光度法检测鲎试剂与内毒素反应后混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，确定待测无水葡萄糖样品中内毒素的具体含量的方法。利用这一原理，用已知含量的内毒素工作标准品，稀释成不同含量的工作标准品系列，测定出不同内毒素含量标准对应达到预设吸光度对应的时间，绘制出标准曲线。然后在一定条件下测定待测无水葡萄糖样品达到预设值所需要的时间，从而可计算出待测无水葡萄糖样品中内毒素的具体含量。2、如权利要求l所述的细菌内毒素含量的方法，其特征为首先将无水葡萄糖用BET用水稀释成10%的溶液，然后加入到盛有O.lml定量鲎试剂的测试管中，漩涡混匀后放入内毒素定量测定仪中，仪器自动进行数据采集后，通过与原输入的标准曲线对比，定量计算出无水葡萄糖细菌内毒素含量。3、如权利要求1或2所述的细菌内毒素含量的方法，其特征为首先将无水葡萄糖用BET用水稀释成5%的溶液，然后加入到盛有O.lml定量鲎试剂的测试管中，漩涡混匀后放入内毒素定量测定仪中，仪器自动进行数据采集后，通过与原输入的标准曲线对比，定量计算出无水葡萄糖细菌内毒素含量。全文摘要本发明的光度法测定无水葡萄糖细菌内毒素含量的方法，属于分析化学领域，技术方案是利用光度法检测鲎试剂与内毒素反应后混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，确定待测无水葡萄糖样品中内毒素的具体含量的方法。利用这一原理，用已知含量的内毒素工作标准品，稀释成不同含量的工作标准品系列，测定出不同内毒素含量标准对应达到预设吸光度对应的时间，绘制出标准曲线。然后在一定条件下测定待测无水葡萄糖样品达到预设值所需要的时间，从而可计算出待测无水葡萄糖样品中内毒素的具体含量。文档编号G01N33/579GK101387647SQ200810139938公开日2009年3月18日申请日期2008年9月8日优先权日2008年9月8日发明者何玉梅,刘剑侠,张全刚,勇王,岩王,非王,平程申请人:西王集团有限公司
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