专利名称：一种基于荧光共振能量转移的超分辨成像方法
技术领域：
本发明属于超分辨成像技术领域，特别涉及一种基于荧光共振能量转移(FRET，Fluorescence Resonance Energy Transfer)的超分辨成像方法。
背景技术：
现代生命科学中的许多重大研究成果都依赖于显微成像技术的进步，然而很长时间以来人们一直认为光学显微镜能达到的极限分辨率大约为光波长的一半200纳米左右。直到20世纪90年代初，随着光学领域中一系列新技术的出现才打破光学衍射极限，将光学显微镜的分辨率提高到数十纳米。超分辨成像技术的基础主要借助于各种非线性光学效应。1991年康乃尔大学的一个研究组实现了多光子荧光成像技术，成为利用非线性光学效应进行显微成像的一个先驱 性的工作，多光子荧光显微镜实现了光学衍射极限的超越，但是由于多光子荧光激发过程必须采取更长的激发光波长，因此最后所能达到的实际分辨率与单光子激发技术相比反而有所下降。在原理上彻底突破光学衍射极限的远场光学成像技术是1994年由Stefan Hell提出的 STED(stimulated emission depletion microscopy)受激发射损耗显微术。超分辨成像技术的三维分辨率取决于该聚焦激光焦斑内所激发的荧光分子所占据的体积。因此，为了减小荧光激发体积，STED采用了两束组合激光，即一束光被聚焦成正常的衍射极限焦斑，其将焦斑内的荧光分子到激发态；而第二束光则选取在荧光分子的发射波长范围，并被聚焦成一个中心与第一束光的焦斑中心完全重合但却是中空的环状焦斑。由于利用第二束光可以将被第一束激发光激发到激发态上去的荧光分子从激发态淬灭到基态，因此它也被称作淬灭光束。由于淬灭光束的光强分布在焦点处为零，因此从原理上讲，只要淬灭光足够强，则由第一束光激发的荧光分子所占据的体积可以被压缩到极小的范围内，因为在焦点以外这些荧光分子都会被淬灭。另一类超分辨成像技术则基于单分子的精确定位。光学衍射极限的概念对于单个发光点并不适用，这是因为艾里斑的中心可以被非常精确地定位。2006年华裔科学家庄小威提出了随机光学重建显微术(STORM)，通过将相互位置过于靠近而无法被传统光学显微镜同时分辨的荧光标记分子逐个予以分别激发，使各个荧光分子所成的艾里斑像之间不再相互干扰，从而能够对每个独立的荧光分子逐个进行定位。这样，在全部荧光标记分子的定位完成后，一幅超越衍射极限的图像即已形成，随后还有PALM、FPALM等单分子超分辨成像技术。然而现有的超分辨成像技术都需要对现有的荧光显微镜进行大量的改造，成本非常昂贵商品化的Leica STED市场价高达700万人民币，成像软件也非常复杂；ST0RM需要快速的对图片中每个单分子形成的艾里斑进行定位，而完成一张完整的生物样品图片往往要拍成千上万张观测图片。这些在技术及资金上的存在的问题极大地限制了超分辨成像技术的普及和应用。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有的超分辨成像技术都需要对荧光显微镜进行大量的改造，成本非常昂贵，成像软件也非常复杂的缺陷，提供一种基于荧光共振能量转移(FRET)的超分辨成像方法。为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一是一种基于荧光共振能量转移的超分辨成像方法，其中包括以下步骤I)用高FRET效率的荧光探针标记待检样品，所述的高FRET效率的荧光探针标记有FRET分子对，所述的FRET分子对包括第一荧光基团(供体)和第二荧光基团(受体)，第一荧光基团能够向第二荧光基团发生荧光共振能量转移(FRET)；2)采用激发光强度能够使步骤I)所述的FRET分子对发生荧光共振能量转移的激发光阈值，进行激光扫描共聚焦显微镜成像。
本发明中，当两个荧光基团——第一荧光基团(供体)和第二荧光基团(受体)之间足够靠近，并且如果第一荧光基团的发射光谱与第二荧光基团的吸收光谱之间有所重叠，则根据 FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer :突光共振能量转移)原理，将允许处于激发态的第一荧光基团将能量交给第二荧光基团，然后无辐射直接跃迁回到基态。根据FRET原理，FRET过程的效率与两个荧光基团之间的间距的6次方成倒数，因此距离越小，FRET过程的效率越高。当第一荧光基团处于激发状态，会将其能量传递给相邻的第二荧光基团，引起第二荧光基团的激发。当第一荧光基团的激发光强度较低时，被辐照的第一荧光基团基本上发生FRET效应而不自发荧光。当激发光的激光强度被提高时，会导致激发光焦斑中心附近的第一荧光基团发生FRET饱和，第一荧光基团就被迫发射荧光。如果选择合适的激光值刚好稍大于引起FRET饱和的激光强度阈值，就能控制激光焦斑中心很小区域内第一荧光基团发光。于是就得到了一个小于衍射极限尺度的发光点，从而获得超越光学衍射极限的分辨能力。本发明中所述的探针是本领域常规的探针，其中所述探针较佳地包括核酸、抗体、蛋白(如酶、受体)、有机小分子(如核苷酸)、无机分子(如钙离子)中的一种或几种，只要这些探针上能够标记第一荧光基团和第二荧光基团即可，并且这些探针能够和目标物质(如待检样本)结合即可。探针和和目标物质的结合是特异性的。本发明所述的探针优选地包括脱氧核糖核苷酸寡聚体，核糖核酸寡聚体和多肽寡聚体中的一种或几种。本发明中所述探针上标记的FRET分子对包括第一荧光基团(供体)和第二荧光基团(受体)，第一荧光基团能够向第二荧光基团发生荧光共振能量转移(FRET)。本发明所述的FRET分子对优选具有较高的FRET效率(优选> 85% )，供体与受体的荧光信号串扰较�。细叩墓┨逵饬孔硬屎徒闲〉挠夤馄孜侍獾腇RET分子对。其中所述的荧光基团为本领域常规的荧光基团。所述荧光基团是指在吸收可见光和紫外光后，能把紫外光转变为波长较长的可见光波而反射出来，呈闪亮的鲜艳色彩。例如，酸性曙红、荧光黄、红汞以及某些分散染料等。所述荧光基团大多是含有苯环或杂环并带有共轭双键的化合物。其中所述FRET分子对为本领域常规的FRET分子对。本发明所述FRET分子对较佳地包括=CFP-YFP(青色荧光蛋白-黄色荧光蛋白)，Cy3-Cy5(菁染料3-5)，Atto488-Atto540, FITC-Rhodamine (异硫氰酸荧光素-罗丹明)，BFP-GFP (蓝色荧光蛋白-绿色荧光蛋白)，Atto488-Atto647N, Atto550_Atto647N，Atto488_Atto590,Atto550-Atto655, Atto590-Atto655, CFP-dsRED (青色荧光蛋白-红色荧光蛋白)，Alexa488_Alexa555(Alexa fluor488-Alexa fluor555) ；Alexa488-Cy3(Alexafluor488-菁染料3)，YFP-TRI TC (黄色荧光蛋白-四甲基罗丹明)和YFP_Cy3 (黄色荧光蛋白-菁染料3)中的一种或几种。本发明FRET分子对优选地包括Cy3-Cy5，Atto488_Atto540, Atto550_Atto647N,Atto488_Atto647N 和 Alexa488_Cy3。本发明中所述的FRET分子对之间的距离较佳地小于10nm，所述的分子对距离更佳地地为2 5nm,距尚优选地为小于2. 5nm。其中所述的高FRET效率的荧光探针的制备方法为本领域常规制备方法。本发明所述的荧光探针制备方法较佳地包括以下步骤首先利用反相微乳液法制备荧光纳米小球，再将该小球与抗体结合即得。其中所述反相微乳液法较佳地包括以下步骤渗透反应表面活性剂的添加量较佳地为2 5%,所述表面活性剂的添加量优选地为2%，所述表面活性剂为本领域常规的表面活性剂，优选地为十二烷基硫酸钠。荧光染料供体和受体的添加量较佳地为4 10%，其添加量优选地为4%，甲苯的添加量较佳地为 4 10%，其添加量优选地为4%，和事先配制好的5 IOml水玻璃溶液放入烧杯中，所述水玻璃模数较佳地为3. I 3. 4，波美度优选地是40，超声混合均匀(超声波功率50W，混合时间I 5分钟)，得到初乳浊液，滴加正戊醇至体系突然透明，即获得微乳液A，其中所述百分比均为质量百分比。聚合反应用I 5mol/L的HCl溶液代替水玻璃溶液，按上述方法制得微乳液B。将微乳液A倒入三口烧瓶中，水浴温度较佳地为30 35°C，优选地为30°C，用蠕动泵将I 5ml微乳液B加入渗透步骤所得的微乳液A中，滴加时间较佳地为40 60min，滴加完毕即得荧光纳米小球溶液。将所得溶液C进行透析处理，以备下一步实验所用，透析时间较佳地为8 24小时，优选地为24小时，所用透析袋规格较佳地为10000 14000分子量，其规格优选地为14000分子量。本发明所述荧光纳米小球与抗体结合的方法为本领域常规方法。所述纳米荧光小球与抗体的结合方法较佳地包括以下步骤称取一定体积上述制备的纳米荧光小球溶液C，经PBS缓冲液洗涤后，加入等体积的抗体溶液，在室温下反应，反应时间较佳地为30 60min，经离心、洗涤后得到抗体修饰的荧光纳米粒子，将其溶于PBS缓冲液中4°C保存备用。其中所述的用高FRET效率的荧光探针标记待检样品的方法是本领域常规技术。所述标记方法较佳地包括以下步骤将细胞用所述的高FRET效率的荧光探针进行标记，洗涤充分之后，即可进行激光扫描共聚焦显微镜观察。进行标记的方法是本领域的常规技术，为本领域的技术人员所熟知和掌握。所述标记方法较佳地为通过细胞生物学技术中的免疫组化方法将探针与样品结合，所述免疫组化方法较佳地包括以下步骤封闭，标记一抗，标记二抗，其中所述的二抗是与前述纳米荧光小球相结合的二抗。本发明中步骤2)为采用激发光强度能够使步骤I)所述的FRET分子对发生荧光共振能量转移的激发光阈值，进行激光扫描共聚焦显微镜成像。其中采用的激发光强度是能够使步骤I)所述的FRET分子对发生荧光共振能量转移的激发光阈值。其中所述的能够使步骤I)所述的FRET分子对发生荧光共振能量转移的激发光阈值是指使FRET分子对发生荧光共振能量转移达到FRET饱和的激发光强度，称之为饱和激发光阈值。
本发明通过本领域常规方法检测所述FRET分子对的饱和激发光阈值。其中所述饱和激发光阈值检测方法较佳地包括以下步骤将单独的供体荧光分子和标记着FRET分子对的荧光探针分别置于激光扫描共聚焦显微镜下检测供体荧光分子的荧光随激发光强变化的曲线，比较两个曲线的变化，可以发现在一定的激发光强时FRET探针的供体荧光发生了非线性的光学响应，即在一定激发光阈值附近供体荧光发生了明显的增加，达到了FRET饱和，该激发光阈值即称之为饱和激发光阈值。通过优选的多次试验，获得该FRET分子对的饱和激光阈值。本发明所述FRET分子对的饱和激光阈值优选地为350 450 U W。所述检测方法参考文献为Chen, J. F. &Cheng, Y. Far-field superresolution imaging withdual-dye-doped nanoparticles. Optics Letters34，1831-1833(2009)。其中所述的激光扫描共聚焦显微镜成像的方法是本领域常规技术。在本领域常规的激光扫描共聚焦显微镜下采用常规的操作方法即可实现超分辨成像。其中所述的超分辨 成像方法较佳地为利用现有的普通激光扫描共聚焦显微镜的激光器使本发明的荧光探针实现饱和荧光共振能量转移。本发明所述超分辨成像方法较佳地为选择稍高于饱和阈值的激光强度下进行扫描成像，实现系统的超分辨成像能力。所述激光强度较佳地为高于饱和阈值I. I倍到2倍，所述的激发光强度范围优选地为400 ii W 500 u W。本发明能够在一台普通的激光扫描共聚焦显微镜上实现对生物样品的超分辨成像。本发明所述激光扫描共聚焦显微镜为本领域常规激光扫描共聚焦显微镜系统。所述激光扫描共聚焦显微镜系统是指采用激光为光源，在传统荧光显微镜成像的基础上，附加了激光扫描装置和共轭聚焦装置，通过计算机控制来进行数字化图像采集和处理的光学成像系统。其中所述的激光光源较佳地包括单激光和多激光系统，其中所述激光光源使用的激光器较佳地包括半导体激光器、氩离子激光器、氦氖激光器和UV激光器(紫外激光器)。本发明所述激光扫描共聚焦显微镜生产商和型号较佳地包括ZeSSiLSM700，Leica TCSSP5II，Olypums FV500, Nikon Cl，本发明激光共聚焦显微镜生产厂商和型号优选地为德国徕卡公司，Lecia TCS SP5II。本发明提供的基于饱和荧光共振能量转移的超分辨成像方法可以广泛应用于生物学研究领域。所述的应用较佳地包括对细胞、微生物等生物样品的三维超分辨成像，如检测天然和致癌的融合蛋白、在实体瘤中检测出现的致癌融合蛋白、研究蛋白复合物之间的组分以及各个组分之间的距离和状态；通过研究转录复合物来研究基因调控机理，研究蛋白质复合物引起的转录活化，研究活体细胞及细胞间相互作用。所述应用实例较佳地包括检测细胞内融合蛋白、分子复合物或细胞器的状态。由于本发明提供的超分辨成像技术不需要破坏细胞完整性，可以在保留细胞形态完整状态下，在单细胞水平上通过流式细胞技术或荧光显微镜对细胞或亚细胞结构进行分析。其中所述亚细胞结构为本领域常规的亚细胞结构。本发明所述亚细胞结构优选地为Hela细胞的微管系统。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。相比于现有技术，本发明的有益效果如下本发明所述基于荧光共振能量转移的超分辨成像方法利用非线性光学效应，能够在没有任何改造的激光共聚焦显微镜上对不同检测对象进行超分辨成像检测分析，所述超分辨成像方法具有快速、简便的优点，该方法充分利用了实验室的现有技术设备，大幅度降低了超分辨成像技术的成本。
以下结合
本发明的特征和有益效果。图I是实施例I制备FRET的探针对激发光的非线性响应图。图2是Cy3_Cy5FRET探针，激光强度在饱和阈值附近时的超分辨成像图。超分辨效果明显，改善现有的共聚焦显微镜分便率3倍，分辨率达65nm。图3是Atto488_Atto540FRET探针超分辨成像图。图4是Atto550_Atto647NFRET探针超分辨成像图。图5是Atto488_Atto647N FRET探针超分辨成像图。
图6是Alexa488_Cy3FRET探针超分辨成像图。其中图2 图6中，图a是激光共聚焦显微镜成像图。图b是SFM显微镜成像图。图c、d分别是a、b中白色框部分的放大图。其中竖线表示比较的区域。其中图e的两条曲线分别是C、d图中竖线部分的荧光强度分布曲线，并且对d图中的荧光曲线进行了高斯拟合得到半高宽即为分辨率。
具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25°C。激光共聚焦显微镜Lecia TCS SP5，德国徕卡公司。Hela细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，其商品序列号为Tch20。突光染料Cy3、Cy5、Atto488、Atto540、Atto550、Atto647N和 Alexa488 购自 takara公司。实施例lCy3_Cy5探针标记的Hela细胞微管的超分辨成像构建高FRET效率的Cy3_Cy5荧光探针采用反相微乳液法制备荧光纳米小球。实验材料硅酸钠溶液(水玻璃)(所述水玻璃模数是3. I，波美度是40)，盐酸(浓度为lmol/L)，十二烷基硫酸钠SDS，甲苯，正戊醇，去离子水(W)，荧光染料Cy3-Cy5。该技术具体步骤包括渗透反应取0. Ig表面活性剂SDS⑶、0. 2g荧光染料(供体Cy3和受体Cy5，供体受体摩尔比I : 2)、0.2ml甲苯和事先配制好的5ml水玻璃溶液放入烧杯中，超声混合均匀(超声波功率50W，混合时间I分钟)，得到初乳浊液，滴加正戊醇至体系突然透明，即获得微乳液A。聚合反应用lmol/L的HCl溶液代替水玻璃溶液，按上述方法制得微乳液B。将5ml渗透反应步骤所得的微乳液A倒入三口烧瓶中，水浴控温为30°C。用蠕动泵将Iml微乳液B加入渗透步骤所得的微乳液A中，45min滴加完毕，得溶液C。将所得溶液C进行24小时透析处理，以备下一步实验所用，所用透析袋规格为14000分子量。用荧光分光光度计分别检测单独供体荧光染料Cy3稀释液(稀释液浓度是100nmol/L)和前述聚合反应所得的溶液C中的荧光染料Cy3的荧光强度；Cy3单独供体的荧光强度是2000，聚合反应后的Cy3荧光强度是30，计算得出在514nm的波长激发下，FRET效率在98%以上，计算方法为
O纳米颗粒的生物修饰称取Iml上述聚合反应制备的纳米荧光粒子溶液C，经Iml的PBS缓冲液洗涤后，加入Iml羊抗鼠IgG多克隆抗体(抗体生产商Abcam，商品序列号ab98711)，在室温下反应30min，经离心、洗涤后得到抗体修饰的荧光纳米粒子，将其溶于PBS缓冲液中4°C保存备用。按照免疫组化染色步骤操作(封闭-一抗-二抗)，将FRET荧光探针标记在Hela细胞微管上。具体步骤如下I :将封闭液(6%胎牛血清)加入固定的Hela细胞，固定的Hela细胞的制备方法为用4% (V/V)的多聚甲醛处理细胞20分钟。在室温下进行封闭I小时，用PBS缓冲液洗漆。2 iJPA 200 U I 一抗(所述抗体为抗微管蛋白单克隆抗体，抗体浓度为10nM，抗体的生产商santa cruz,序列号sc_5286),室温下反应I小时。3 :加入IOOiU 二抗(所述二抗是上述所得交联有纳米荧光颗粒的二抗，多克隆抗体浓度为30nM)，室温下反应I小时。分别检测不同激发光强度下FRET过程饱和前供体的荧光强度变化曲线和FRET过程饱和后的供体荧光强度变化曲线。结果见图I。比较这两个曲线的变化，计算单独供体荧光分子在不同强度的514nm激光照射下的荧光强度与FRET分子对中供体荧光强度的比值，当比值发生变化时则发生FRET饱和现象，获得该探针的非线性光学响应，得FRET饱和的激发光阈值为400 ii W。所述检测方法参考文献Chen，J. F. &Cheng，Y. Far-fieldsuperresolution imaging with dual-dye-doped nanoparticles. Optics Letters 34，1831-1833 (2009)。选取强度为500 u W的激光进行激发开始成像，得到超分辨图像，其分辨率为65nm,如图2所示。实施例2Atto488_Atto540探针标记的Hela细胞微管的超分辨成像构建高FRET效率的Atto488_Atto540荧光探针实验材料硅酸钠溶液(水玻璃)(所述水玻璃模数是3. 2，波美度是40)，盐酸(浓度为lmol/L)，十二烷基硫酸钠SDS，甲苯，正戊醇，去离子水(W)，荧光染料Atto488-Atto540。取0. Ig表面活性剂SDS⑶、() 2g荧光染料(供体Atto488和受体Atto540，供体受体摩尔比I : 2)、0.2ml甲苯和事先配制好的5ml水玻璃溶液放入烧杯中，超声混合均匀(超声波功率50W，混合时间I分钟)，得到初乳浊液，滴加正戊醇至体系突然透明，即获得微乳液A。
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聚合反应用lmol/L的HCl溶液代替水玻璃溶液，按上述方法制得微乳液B。将5ml渗透反应步骤所得的微乳液A倒入三口烧瓶中，水浴控温为30°C。用蠕动泵将Iml微乳液B加入渗透步骤所得的微乳液A中，45min滴加完毕，得溶液C。将所得溶液C进行24小时透析处理，以备下一步实验所用，所用透析袋规格为14000分子量。
用荧光分光光度计分别检测单独供体荧光染料Atto488稀释液(稀释液浓度是IOOnmoI/L)和前述聚合反应所得的溶液C中的荧光染料Atto488的荧光强度；Atto488单独供体的荧光强度是2000，聚合反应后的荧光染料供体的荧光强度是32，计算出出激发光波长是458nm时FRET效率95%以上。纳米颗粒的生物修饰称取Iml上述聚合反应制备的纳米突光粒子溶液C,经Iml的PBS缓冲液洗涤后，加入Iml羊抗鼠IgG多克隆抗体(抗体生产商Abcam，商品序列号ab98711)，在室温下反应30min，经离心、洗涤后得到抗体修饰的荧光纳米粒子，将其溶于PBS缓冲液中4°C保存备用。按照免疫组化染色步骤操作(封闭-一抗-二抗)，将FRET荧光探针标记在Hela细胞微管上。具体步骤如下I :将封闭液(6%胎牛血清)加入固定的Hela细胞，固定的Hela细胞的制备方法为用4% (V/V)的多聚甲醛处理细胞20分钟。在室温下进行封闭I小时，用PBS缓冲液洗漆。 2 iJPA 200 U I 一抗(所述抗体为抗微管蛋白单克隆抗体，抗体浓度为10nM，抗体的生产商santa cruz,序列号sc_5286),室温下反应I小时。3 :加入IOOiU 二抗(所述二抗是上述所得交联有纳米荧光颗粒的二抗，多克隆抗体浓度为30nM)，室温下反应I小时。分别检测激发光波长为458nm时不同强度激发光下FRET过程饱和前供体的荧光强度变化曲线和FRET过程饱和后的供体荧光强度变化曲线，比较这两个曲线的变化，获得该探针的非线性光学响应，计算单独供体荧光分子的荧光强度与FRET分子对中供体荧光强度的比值，当比值发生变化时则发生FRET饱和，从而获得FRET饱和的激发光阈值为400 u W。选取强度为480 u W激光进行激发，开始成像，得到超分辨图像，该图像的分辨率是90nm,如图3所示。实施例3Atto550_Atto647N探针标记的Hela细胞微管的超分辨成像构建高FRET效率的Atto550_Atto647N荧光探针实验材料硅酸钠溶液(水玻璃)(所述水玻璃模数是3. 3，波美度是40)，盐酸(浓度为lmol/L)，十二烷基硫酸钠SDS，甲苯，正戊醇，去离子水(W)，荧光染料Atto550-Atto647No渗透反应取0. Ig表面活性剂SDS(S)、0.2g荧光染料(供体Atto550和受体Atto647N，供体受体摩尔比I : 2)、0. 2ml甲苯和事先配制好的5ml水玻璃溶液放入烧杯中，超声混合均匀(超声波功率50W，混合时间I分钟)，得到初乳浊液，滴加正戊醇至体系突然透明，即获得微乳液A。聚合反应用lmol/L的HCl溶液代替水玻璃溶液，按上述方法制得微乳液B。将5ml渗透反应步骤所得的微乳液A倒入三口烧瓶中，水浴控温为30°C。用蠕动泵将Iml微乳液B加入渗透步骤所得的微乳液A中，45min滴加完毕，得溶液C。将所得溶液C进行24小时透析处理，以备下一步实验所用，所用透析袋规格为14000分子量。用荧光分光光度计分别检测单独供体荧光染料Atto550稀释液(稀释液浓度是100nmol/L)和前述聚合反应所得的溶液C中的荧光染料Atto550的荧光强度；Atto550单独供体的荧光强度是3000，聚合反应后的荧光染料Atto550供体的荧光强度是50，计算出激发光波长是514nm时FRET效率95%以上。纳米颗粒的生物修饰称取Iml上述聚合反应制备的纳米荧光粒子溶液C，经Iml的PBS缓冲液洗涤后，加入Iml羊抗鼠IgG多克隆抗体(抗体生产商Abcam，商品序列号ab98711)，在室温下反应30min，经离心、洗涤后得到抗体修饰的荧光纳米粒子，将其溶于PBS缓冲液中4°C保存备用。按照免疫组化染色步骤操作(封闭-一抗-二抗)，将FRET荧光探针标记在Hela细胞微管上。具体步骤如下I :将封闭液(6%胎牛血清)加入固定的Hela细胞，固定的Hela细胞的制备方法为用4% (V/V)的多聚甲醛处理细胞20分钟。在室温下封闭I小时，用PBS缓冲液洗涤。2 iJPA 200 U I 一抗(所述抗体为抗微管蛋白单克隆抗体，抗体浓度为10nM，抗体的生产商santa cruz,序列号sc_5286),室温下反应I小时。
3 :加入IOOiU 二抗(所述二抗是上述所得交联有纳米荧光颗粒的二抗，多克隆抗体浓度为30nM)，室温下反应I小时。分别检测激发光波长是514nm时不同激发光强度下FRET过程饱和前供体的荧光强度变化曲线和FRET过程饱和后的供体荧光强度变化曲线，比较这两个曲线的变化，获得该探针的非线性光学响应，计算单独供体荧光分子的荧光强度与FRET分子对中供体荧光强度的比值，当比值发生变化时则发生FRET饱和，从而获得FRET饱和的激发光阈值450 u W。选取激光强度500 u W的激光进行激发，开始成像，得到超分辨图像，其分辨率是88nm,如图4所示。实施例4Atto488_Atto647N探针标记的Hela细胞微管的超分辨成像构建高FRET效率Atto488_Atto647N荧光探针实验材料硅酸钠溶液(水玻璃)(所述水玻璃模数是3. 4，波美度是40)，盐酸(浓度为lmol/L)，十二烷基硫酸钠SDS，甲苯，正戊醇，去离子水(W)，荧光染料Atto488-Atto647No渗透反应取0. Ig表面活性剂SDS(S)、0.2g荧光染料(供体Atto488和受体Atto647N，供体受体摩尔比I : 2)、0. 2ml甲苯和事先配制好的5ml水玻璃溶液放入烧杯中，超声混合均匀(超声波功率50W，混合时间I分钟)，得到初乳浊液，滴加正戊醇至体系突然透明，即获得微乳液A。聚合反应用lmol/L的HCl溶液代替水玻璃溶液，按上述方法制得微乳液B。将5ml渗透反应步骤所得的微乳液A倒入三口烧瓶中，水浴控温为30°C。用蠕动泵将Iml微乳液B加入渗透步骤所得的微乳液A中，45min滴加完毕，得溶液C。将所得溶液C进行24小时透析处理，以备下一步实验所用，所用透析袋规格为14000分子量。用荧光分光光度计分别检测单独供体荧光染料Atto488稀释液(稀释液浓度是IOOnmoI/L)和前述聚合反应所得的溶液C中的荧光染料Atto488的荧光强度；Atto488单独供体的荧光强度是2500，发生FRET聚合反应后的供体的荧光强度是50。计算出激发光波长为458nm时FRET效率90%以上。纳米颗粒的生物修饰称取Iml上述聚合反应制备的纳米荧光粒子溶液C，经Iml的PBS缓冲液洗涤后，加入Iml羊抗鼠IgG多克隆抗体(抗体生产商Abcam，商品序列号ab98711)，在室温下反应30min，经离心、洗涤后得到抗体修饰的荧光纳米粒子，将其溶于PBS缓冲液中4°C保存备用。按照免疫组化染色步骤操作(封闭-一抗-二抗)，将FRET荧光探针标记在Hela细胞微管上。具体步骤如下I :将封闭液(6%胎牛血清)加入固定的Hela细胞，固定的Hela细胞的制备方法为用4% (V/V)的多聚甲醛处理细胞20分钟。在室温下进行封闭I小时，用PBS缓冲液洗漆。2 iJPA 200 U I 一抗(所述抗体为抗微管蛋白单克隆抗体，抗体浓度为10nM，抗体的生产商santa cruz,序列号sc_5286),室温下反应I小时。3 :加入IOOiU 二抗(所述的二抗是上述所得交联有纳米荧光颗粒的二抗，多克隆抗体浓度为30nM)，室温下反应I小时。分别检测激发光波长为458nm时不同激发光强度下FRET过程饱和前供体的荧 光强度变化曲线和FRET过程饱和后的供体荧光强度变化曲线，比较这两个曲线的变化，获得该探针的非线性光学响应，计算单独供体荧光分子的荧光强度与FRET分子对中供体荧光强度的比值，当比值发生变化时则发生FRET饱和，从而获得FRET饱和的激发光阈值为350 u W。选取强度为400 u W的激光进行激发，开始成像，得到超分辨图像，其分辨率是69nm,如图5所示。实施例5Alexa488-Cy3探针标记的Hela细胞微管的超分辨成像构建高FRET效率的Alexa488_Cy3荧光探针实验材料硅酸钠溶液(水玻璃)(所述水玻璃模数是3. 4，波美度是40)，盐酸(浓度为lmol/L)，十二烷基硫酸钠SDS’甲苯，正戊醇，去离子水(W)，荧光染料Alexa488-Cy3。渗透反应取0. Ig表面活性剂SDS(S)、0.2g荧光染料(供体Alexa488和受体Cy3，供体受体摩尔比I : 2)、0.2ml甲苯和事先配制好的5ml水玻璃溶液放入烧杯中，超声混合均匀(超声波功率50W，混合时间I分钟)，得到初乳浊液，滴加正戊醇至体系突然透明，即获得微乳液A。聚合反应用lmol/L的HCl溶液代替水玻璃溶液，按上述方法制得微乳液B。将5ml渗透反应步骤所得的微乳液A倒入三口烧瓶中，水浴控温为30°C。用蠕动泵将Iml微乳液B加入渗透步骤所得的微乳液A中，45min滴加完毕，得溶液C。将所得溶液C进行24小时透析处理，以备下一步实验所用，所用透析袋规格为13000分子量。用荧光分光光度计分别检测单独供体荧光染料Alexa488稀释液(稀释液浓度是IOOnmoI/L)和前述聚合反应所得的溶液C中的荧光染料Alexa488的荧光强度；Alexa488单独供体的荧光强度是2500，发生FRET时供体的荧光强度是50，计算出激发光波长为458nm时FRET效率90%以上。纳米颗粒的生物修饰称取Iml上述聚合反应制备的纳米荧光粒子溶液C，经Iml的PBS缓冲液洗涤后，加入Iml羊抗鼠IgG多克隆抗体(抗体生产商Abcam，商品序列号ab98711)，在室温下反应30min，经离心、洗涤后得到抗体修饰的荧光纳米粒子，将其溶于PBS缓冲液中4 °C保存备用。按照免疫组化染色步骤操作(封闭-一抗-二抗)，将FRET荧光探针标记在Hela细胞微管上。具体步骤如下I :将封闭液(6%胎牛血清)加入固定的Hela细胞，固定的Hela细胞的制备方法为用4% (V/V)的多聚甲醛处理细胞20分钟。在室温下进行封闭I小时，用PBS缓冲液洗漆。2 :加入200iil —抗(所述抗体为抗微管蛋白单克隆抗体，抗体浓度为10nM，抗体的生产商santa cruz,序列号sc_5286),室温下反应I小时。3 :加入IOOiU 二抗(所述二抗是上述所得交联有纳米荧光颗粒的二抗，多克隆抗体浓度为30nM)，室温下反应I小时。分别检测激发光波长为458nm时不同强度下FRET过程饱和前供体的荧光强度变化曲线和FRET过程饱和后的供体荧光强度变化曲线，比较这两个曲线的变化，获得该探针的非线性光学响应，主要是通过计算单独供体荧光分子的荧光强度与FRET分子对中供体荧光强度的比值，当比值发生变化时则发生FRET饱和，从而获得FRET饱和的激发光阈值400 u W。选取强度为450 u W的激光进行激发，开始成像，得到超分辨图像，其分辨率为125nm,如图6所示。
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。本发明得到中国科学院科研装备项目实施方案基金支持，基金号28Y2010027。
权利要求
1.一种基于荧光共振能量转移的超分辨成像方法，其特征在于，包括以下步骤 1)用高FRET效率的荧光探针标记待检样品，所述的高FRET效率的荧光探针标记有FRET分子对，所述的FRET分子对包括第一荧光基团(供体)和第二荧光基团(受体)，第一荧光基团能够向第二荧光基团发生荧光共振能量转移(FRET)； 2)采用激发光强度能够使步骤I)所述的FRET分子对发生荧光共振能量转移的激发光阈值，进行激光扫描共聚焦显微镜成像。
2.如权利要求I所述的超分辨成像方法，其特征在于，所述的探针选自核酸、抗体、蛋白质分子、有机小分子和无机分子中的一种或几种。
3.如权利要求I所述的超分辨成像方法，其特征在于，所述的FRET分子对具有>85%FRET效率。
4.如权利要求I所述的超分辨成像方法，其特征在于，所述的FRET分子对包括CFP-YFP， Cy3-Cy5, Atto488_Atto540， FITC-Rhodamine, BFP-GFP, FITC-EITC，Atto488-Atto647N, Atto550-Atto647N, Atto488-Atto590, Atto550-Atto655,Atto590-Atto655, CFP-dsRED，Alexa488_Alexa555，Alexa488-Cy3, YFP-TRITC 和 YFP_Cy3中的一种或几种。
5.如权利要求I所述的超分辨成像方法，其特征在于，所述的FRET分子对之间的距离小于10nm。
6.如权利要求I所述的超分辨成像方法，其特征在于，所述的能够使步骤2)所述的FRET分子对发生荧光共振能量转移的激发光阈值是指使FRET分子对发生荧光共振能量转移达到FRET饱和的激发光强度，称之为饱和激发光阈值。
7.如权利要求I所述的超分辨成像方法，其特征在于，通过以下方法获得所述FRET分子对的饱和激发光阈值将单独的供体荧光分子和标记着FRET分子对的荧光探针置于激光扫描共聚焦显微镜下检测供体荧光分子的荧光随激发光强变化的曲线，比较两个曲线的变化，发现在一定的激发光强时FRET探针的供体荧光发生了非线性的光学响应，即在一定激发光阈值附近供体荧光发生了明显的增加，达到了 FRET饱和，该激发光阈值即为饱和激发光阈值。
8.如权利要求I所述的超分辨成像方法，其特征在于，步骤((2)所述的激发光强度稍高于饱和阈值，激光强度是400 μ W 500 μ W。
9.如权利要求I所述的超分辨成像方法，其特征在于，所述的激光共聚焦显微镜包括采用激光做光源的显微镜系统。
10.如权利要求9所述的超分辨成像方法，其特征在于，所述的激光扫描共聚焦显微镜包括 Zessi LSM700, Leica TCS SP5II, Olypums FV500 或 NikonCl。
全文摘要
本发明公开了一种基于荧光共振能量转移的超分辨成像方法，所述超分辨成像方法包括以下步骤1)用高FRET效率的荧光探针标记待检样品，所述的高FRET效率的荧光探针标记有FRET分子对，所述的FRET分子对包括第一荧光基团(供体)和第二荧光基团(受体)，第一荧光基团能够向第二荧光基团发生荧光共振能量转移(FRET)；2)采用激发光强度能够使步骤1)所述的FRET分子对发生荧光共振能量转移的激发光阈值，进行激光扫描共聚焦显微镜成像。本发明所述基于饱和荧光共振能量转移的超分辨技术能够在一台普通的激光共聚焦显微镜上实现对生物样品的超分辨成像，该方法分辨率高。
文档编号G01N21/64GK102830101SQ20121028830
公开日2012年12月19日 申请日期2012年8月14日 优先权日2012年8月14日
发明者樊春海, 黄庆, 程亚, 陈建芳, 邓素辉, 梁乐 申请人:中国科学院上海应用物理研究所
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