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专利名称：一种羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体基因和其编码多肽及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，更具体地，本发明涉及一种羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体基因和其编码多肽及应用。
背景技术：
阿尔茨海默病(Alzheimer，s disease, AD)患者脑内产生P淀粉样斑块沉积是此病的典型病变。AP 40和AP 42是AD患者脑内P淀粉样斑块的主要成分，二者的差别在于A P 42羧基末端比A P 40多两个，其中A P 42更容易聚集成多个级别的聚合物，是AD的主要致病因子。因此，针对A ￠42的诊断和治疗研究比AP 40更有意义。目前已有人开展AP42特异性抗体的研制，但是还没有获得构象表位的AP 42单 抗。不能特异性识别A ^ 2寡聚体，因此鉴别诊断和治疗的靶点效果不理想，需要有羧基末端特异性识别和结合AP 2寡聚体的单克隆抗体。

发明内容
本发明旨在至少解决上述技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种具有特异性识别和结合A 0 42寡聚体的抗体活性片段、并且与AP 40无交叉反应的基因。根据本发明实施例的羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体基因，包括重链可变区基因和轻链可变区基因，其中，所述重链可变区基因的序列如SEQ ID N0:1所示，所述轻链可变区基因的序列如SEQ ID NO 3所示。根据本发明实施例的羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体基因，由于能够特异性识别A M2寡聚体而区分只相差2个氨基酸的A MO和A M2寡聚体，在免疫治疗实验中，可以避免与AP 40结合，从而降低非特异性识别引起的副反应；根据该基因编码所得的多肽为淀粉样蛋白羧基末端多肽，免疫效果好，小鼠免疫血清效价高，并且其抗原识别能力具有构象特征，可以用于AD早期诊断。另外，根据本发明上述实施例的羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体基因，还可以具有如下附加的技术特征所述重链可变区基因长405bp，所述轻链可变区基因长393bp，两个基因重组后可用于表达特异性识别和结合A ^寡聚体的抗体活性片段。所述重链可变区基因和所述轻链可变区基因是从能够分泌较高活性的鼠源性A3 42寡聚体特异性单抗的杂交瘤细胞株(命名为BJNA，由北京交通大学生命科学与生物工程研究院建立和保存，其免疫原为AP 35-42多肽，其分泌的抗体分子亚型为IgG2a)中克隆的，所述杂交瘤细胞株已经进行保藏，其保藏信息如下培养物名称杂交瘤细胞株BJNA保藏编号CCTCCC201155
保藏单位中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏时间2011年7月I日。其具体操作步骤可以为首先，采用Trizol法提取杂交瘤细胞总RNA，总RNA通过反转录合成cDNA，然后以cDNA为模版，根据抗体(IgG)保守序列设计引物，通过PCR的方法扩增抗体轻重链可变区基因，便可得到所述重链可变区基因和所述轻链可变区基因。通过序列分析表明，所述重链可变区基因和所述轻链可变区基因序列与已经提交的小鼠IgG可变区序列同源性达90%与92%，可以确定所得到的序列为抗体轻链和重链可变区序列，而非其它基因的序列。所得VH和VL基因可编码正确的小鼠抗体可变区。本发明的另一个目的在于提出一种根据上述实施例所述羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体基因编码的多肽，根据所述SEQ ID NO :1编码的多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO :2所示；根据所述SEQ ID NO :3编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO :4所示。 本发明还提出了含有所述羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体基因的细胞系及含有由所述羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体基因编码的多肽的细胞系。所述细胞系的培养方法可以为将所述羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体基因的轻链可变区基因和重链可变区基因的核苷酸序列克隆至相应的表达载体，转染/转化相应的受体细胞(包括但不局限于细菌、哺乳动物细胞以及酵母)，可以得到高表达所述抗体基因的细胞系。所述羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体基因表达后所获得的蛋白产物晶体还可以用于制备阿尔茨海默病的治疗药物。其具体操作可以为将羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体基因的轻链可变区基因和重链可变区基因在不同表达体系进行表达，所获得的蛋白或多肽产物纯化后，可制成晶体。该晶体在制备药物时，可作为药物靶点，用于新药的结构设计。基于上述已经克隆到的所述重链可变区基因和轻链可变区基因，可以采用基因重组的方法，构建和表达多种小分子的嵌合抗体、单链抗体以及Fab等基因工程抗体，以用于阿尔茨海默病的诊断、预防和治疗的基础与临床研究和应用，例如可以在制备羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体中应用，在制备阿尔茨海默病诊断试剂中应用，也可以在构建基因工程单克隆抗体表达体系中应用。本发明还提出了多肽表位AP 37-42在制备与筛选羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白寡聚体单克隆抗体中的应用。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。


本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中图I是羧基末端特异性抗淀粉样蛋白单克隆抗体纯化后的重链可变区基因、轻链可变区基因示意图；图2是羧基末端特异性抗淀粉样蛋白单克隆抗体检测的灵敏度示意图；图3是单抗BJNA以及A8分别对A P 40和A P 42寡聚体识别的不同能力示意图4为斑点印记结果示意图；图5为Morris水迷宫检测结果示意图；图6为RT-PCR扩增的羧基末端特异性抗淀粉样蛋白单抗轻、重链可变区基因的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施例方式以下通过具体实施例来进一步描述本发明，下列实施例用于说明目的，而非用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，可按照常见的分子克隆手册所述的条件进行操作。下列实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买所得。实施例I羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体的制备、一、试验材料I、AP (35-42) (MVGGVVIA)(上海生工生物工程有限公司合成)2、A 3 42 肽(DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA)和 A 3 40 肽(DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV)(上海生工生物工程有限公司合成)3、六氟异丙醇(1,1,1,3,3, 3-hexafluoro-2-propannol,HFIP)(购自 Sigma 公司)4、无水二甲基亚砜(DMSO)(购自Sigma公司)5、F12培养基(购自Sigma公司)6、福氏完全佐剂(购自Sigma公司)7、福氏不完全佐剂(购自Sigma公司)8、RPMI 1640 培养液(购自 Sigma 公司)9、PEG 4000 (polyethylene glycol)(购自 Sigma 公司)10、胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司提供)11、HAT (购自 Sigma 公司)12、青链霉素(购自Sigma公司)13、HT (购自 Sigma 公司)14、小鼠IgG同种型鉴定试剂盒(购自Sigma公司)15、降植烧(Pristane)(购自 Sigma 公司)16、BCA试剂盒(美国PIERCE公司生产)二、试验步骤I.免疫原的设计、合成以及检测抗原的制备免疫原的设计与合成取^\0 (35-42)，在氨基端加上I个Cys，然后与KLH定向偶联，得到KLH-AP (35-42)，将其作为免疫原。检测抗原AP寡聚混合物的制备先将AM2肽Img溶于冰预冷的HFIP中，使A 3 42肽单体化，室温，Ih后使HFIP挥发殆尽。然后用DMS020 U I溶解A P 42单体，最后将其置于F12培养基或磷酸盐缓冲体系(体积相应补足Iml)，于4°C温度条件下培养24h，使其自然聚合，获得抗原AP寡聚混合物,并用Western blot检测A 0 42寡聚混合物的制备情况。2.小鼠的免疫接种
取6-8周龄雌性BALB/c小鼠5只。分别用A ^寡聚混合物共进行4次免疫首次按50 u g/只剂量将A ^寡聚混合物与等体积福氏完全佐剂混匀后，腹腔注射。间隔2周后重复注射，使用福氏不完全佐剂，偶联多肽剂量为30 y g/只。间隔2周后重复一次；再间隔两周，用纯抗原50 y g进行脾内加强免疫，3-4d后取脾融合。
3.饲养细胞的制备取6-8周龄BALB/c小鼠，引颈处死，无菌条件下RPMI 1640培养液冲洗腹腔数次，将冲洗液2000rpm，离心IOmin。弃上清，用含20%胎牛血清的RPMI 1640培养液悬浮沉淀，细胞计数，调整细胞浓度为IO5个/ml，加入96孔板中，IOOiU/孔，置于37°C，5% CO2培养
箱中孵育。4.细胞融合取强化免疫3-4d的小鼠，眼球放血后，收集血清，拉颈处死，无菌取出脾脏，制成单细胞悬液后，按10 I的比例将脾细胞与处于对数生长期的Sp2/0细胞(经8-氮鸟嘌呤，即8-Azaguanine,简称8-AG筛选)混合，IOOOrpm离心IOmin,弃上清,轻弹管底使沉淀细胞呈糊状，37°C水浴中加入0.7ml 50% PEG 4000，边加边旋转离心管，使细胞保持混匀状态，Imin加完，37°C水浴中静置90s，立即缓慢加入20ml RPMI 1640液，800rpm离心8min，弃上清，加入含20%胎牛血清、2% HAT、1%青链霉素的1640培养液，轻轻混匀，调整细胞浓度为2X IO6个/ml，加入已备有饲养细胞的96孔板中，IOOiU/孔，置于37°C，5% CO2培养箱中孵育，逐日观察细胞生长情况，I周后补加含20 %胎牛血清、I % HT、I %青链霉素的RPMI 1640培养液，按下列公式计算克隆生长率。克隆生长率(％ )=(细胞克隆生长孔/接种孔)X 100%5.阳性克隆的筛选及亚克隆待细胞克隆长至视野的1/3时(显微镜放大倍数40X)，小心吸取细胞上清液，IOu g/mlA^寡聚混合物为包被抗原，ELISA方法检测上清中的抗体(具体方法及判断标准参照“实施例2间接ELISA实验”)，按下列公式计算克隆阳性率。克隆阳性率(％ )=(抗体阳性孔/检测的细胞克隆生长孔)X 100%采用有限稀释法对抗体分泌阳性的孔进行反复克隆化，至所有单克隆孔上清抗体阳性率为100%。6.杂交瘤细胞株的建立将克隆化的阳性克隆移入24孔板、6孔板和T25细胞培养瓶，扩大培养60_90d并建株。7.羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体的亚类鉴定按照Sigma公司的小鼠IgG同种型鉴定试剂盒操作杂交瘤细胞株分泌羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体的IgG亚类为IgG2a。8.羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体的表位分析使用竞争ELISA法测定单克隆抗体的抗原识别表位将单克隆抗体与浓度梯度的各个肽段(A ^ 35-42，A ^ 36-42，A ^ 37-42)孵育Ih后加入到包被有A ^寡聚体的酶标板上进行间接ELISA检测。结果表明其表位为C端多肽AP 37-42。9.羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体的大量制备及纯化
接种杂交瘤细胞至降植烷预处理的BABL/c小鼠腹腔，I X IO7个杂交瘤细胞/只，7-10天后抽取腹水,使用AKTA explorelOO蛋白层析系统通过Protein A亲和层析柱纯化单克隆抗体，参照图I所示，其中A表示重链可变区基因，B表示轻链可变区基因，M为蛋白质分子量标记(Marker)，L为羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体的重链可变区基因和轻链可变区基因。用BCA试剂盒测定抗体浓度,为3mg/ml。实施例2间接ELISA实验一、试验材料I、酶标板(SUNRISE公司生产)2、HRP标记的羊抗鼠IgG(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)二、试验方法·I、包被取10 U g/ml A P 40及A P 42寡聚混合物分别作为包被抗原，溶于包被缓冲液(pH 9. 6，0. 05mol/L碳酸盐缓冲液)，加入酶标板中，每孔IOOii 1，于4°C温度环境下过夜。2、PBS-T (称取 NaCl 8g, KCl 0. 2g, Na2HPO4 I. 44g, KH2PO4 0. 44g, Tween-20
0.05ml,补ddH20至LI,调节pH至7. 2 7. 4)洗板:3次,每次5min。3、封闭加含 0.2% BSA 的 PBS-T，每孔 100 ill。于 37°C 下处理 2h。4、将以PBS-T倍比稀释的羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体，加入96孔板中，每孔100 iil。于37°C下处理2h。同时设阴性对照和阳性对照(分别用SP2/0细胞培养上清或抗体稀释液、单抗AS)。5、PBS-T 洗板3 次，每次 5min。6、加I : 10000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，每孔100 ill。于37°C下处理lh。7、PBS-T 洗板3 次，每次 5min。8、加底物TMB，每孔100 yl，20min后，450nm波长检测A值。三、判断标注阳性判断标准如下(样品孔A值-空白对照A值)/ (阴性对照孔A值-空白对照A值)彡2检测的最大稀释度为该抗体的效价。四、试验结果应用羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体能够特异性识别包被的A3 42寡聚混合物，而不识别AP 40,结果见见表I。最低检测限为30ng/ml,试验结果见图2。表12D7识别A M2的特异性(间接ELISA)
^ ^ ^Ap42包被Ap40包被
^I2平均值I2平均值
2D71.749L751.7495 0.0640.059 0.0615~
阳性对照 1.4711.3951.4331.451.351.4
阴性对照 0.0540.073 0.0635 0.0620.057 0.0595上述结果说明羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体能够特异性识别体外组装的AP 42寡聚混合物，其反应灵敏度较好并且与AP 42无交叉反应。实施例3免疫印迹(Western blot)实验一、试验方法检测抗原AP寡聚混合物的制备如实施例I所示。取5 IOiig样品，5X样品缓冲液，混匀后上样，先以100V电压使蛋白通过浓缩胶。当样品进入分离胶时，调节电压使其恒定在120V。当溴酚蓝泳动至凝胶底部时，结束电泳，取下凝胶，常规用考马斯亮蓝R-250染色法染色；将凝胶和硝酸纤维素膜分别放入装有印迹缓冲液的容器里平衡lOmin，依次在放入滤纸、凝胶、NC膜、滤纸，成“三明治”状，倒入转膜缓冲液，胶面朝负极，NC膜面朝向正极，小心避免并赶去气泡。接通电源，使恒流80mA连续转移2h，切断电源。 转膜结束后,用丽春红S染色液(10X丽春红SC存液配制方法为称取丽春红S2g，三氯乙酸30g,横基水杨酸30g,加水至IOOml ;使用时按照I : 10的比例用去离子水稀释)确定蛋白条带位置，做相应的标记。用封闭液封闭硝酸纤维素膜(称取脱脂奶粉5g，溶于 0. lmol/L PBST (NaCl 8g, KCl 0. 2g, Na2HPO4 I. 44g, KH2PO4 0. 44g, Tween-200. 05ml，补去离子水至lL，pH 7. 2 7. 4) 100ml)，4°C封闭过夜。用封闭液液稀释单抗BJNA，浓度一般为0. 2 I ii g/ml，于4°C孵育12 14h，或于20 37°C孵育2h。用0. lmol/L PBST洗涤硝酸纤维素膜4次，每次5 lOmin。用PBS稀释HRP标记的二抗，稀释度为I : 1000，室温孵育lh。用0. lmol/L PBST洗涤硝酸纤维素膜4次，每次5min。按照PIERCE化学发光试剂盒说明，将A液和B液等体积混合，加在硝酸纤维素膜上，2 5min后，用X光片曝光显影，观察结果。二、试验结果Western Blot结果,纯化的羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体主要识别A 3 2寡聚，与A MO没有交叉反应，结果如图3所示(Native-PAGE后的WB)，其中C表示羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体，D表示单抗AS，I和2表示羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体不识别A P 40 (I)，只识别A P 42⑵；3和4表示单抗AS可以同时识别A3 40(3)和AM2寡聚(4) ；2表示检测抗体为A8 ；3表示检测抗体为6E10。上述结果说明，羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体对仅仅相差2个氨基酸的A P 42寡聚混合物和A P 40具有分辨能力。羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体可以对Native-PAGE分离后的样品，利用Western Blot进行样本的AP 42检测和鉴别。表明羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体的识别具有构象选择特征。实施例4免疫斑点印迹试验一、试验方法I、剪适当大小的NC膜在去离子水中浸泡5min。2、将浸泡过的NC膜在室温中自然晾干30min。3、将 A @ 42 (0. 5mg/mL)和 A MO (0. 5mg/mL)分别点 2 y L 到 NC 膜上，每个样品两
个重复。4、将点样后的NC膜稍干后，浸在5%脱脂牛奶封闭液中，4°C封闭过夜。5、将NC膜与用5 %脱脂牛奶稀释的第一抗体(纯化后的羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体)，室温孵育2h，然后TBST缓冲液洗膜3次，每次3min。
6、将膜与用5%脱脂牛奶稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG(l 5000)室温孵育lh，TBST缓冲液洗膜3次，每次5min。7、在暗室中配制化学发光底物(按I : I混合底物液)。将发光底物均匀地加到NC膜上，将NC膜用保鲜膜包好后放入暗盒使底片曝光，将曝光后的底片放入显影液中显影后再放入定影液中定影。二、试验结果在免疫斑点印迹实验里，纯化的羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体主要识别AP 2寡聚，与AP 40没有交叉反应，见图4，表明羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体特异性识别NC膜上A M2，而不识别A MO。
上述结果说明，羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体对吸附在NC膜上的仅仅相差2个氨基酸的A 3 42寡聚混合物和A 3 40具有分辨能力。提示羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体的识别具有构象选择特征。实施例5Morris水迷宫检测试验一、试验目的本试验目的是为了检测羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体对快速老化痴呆模型小鼠的治疗作用。二、试验动物双转基因小鼠APPswe/PSl AE9，购自中国医学科学院实验动物研究所，委托北京大学医学部医学实验动物中心饲养。分组情况如下按照注射药物不同分为羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体治疗组(简称BJNA治疗组)、小鼠非特异性IgG注射组和APPswe/PSl A E9空白对照组，每组12只。三、试验方法以羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体腹腔注射6月龄雄性APPswe/PSl A E9小鼠(400 u g/只)，每周I次，治疗4周以后，进行Morris水迷宫检测(所述试验在军事医学科学院疾病预防控制所毒理学评价研究中心完成)。其具体试验步骤为I、设计特制的水迷宫主要由一圆柱型水池和一个可移动位置的平台组成。水池高70cm,直径80cm,平台直径8cm,水池上空通过一个数字摄相机与计算机相连接。2、预先在水池中注入清水，水深15cm，池壁及池底均为黑色，使池水变为不透明的黑色，平台表面为黑色，使小鼠不能看到，水面高出平台表面0. 5cm。3、水温控制在22±0. 5°C，在水池上标定相同一点作为每次实验小鼠的入水点。每个象限对应的侧壁上粘贴不同形状的标志。平台置于离入水点较远的象限中间，实验过程保持平台位置不变。4、每次实验在隔音的房间内进行，水池，光源，鼠笼等实验室各物件的位置保持不变。5、治疗结束后第3天开始训练，如果动物在60s内找到平台，让其在平台上停留20s，如果动物没有找到平台，将其放在平台上使其停留20s。6、每次实验以60s为限，纪录每次各组动物能够到达平台的小鼠只数。若设定时间内未找到平台，计算机停止跟踪，记录时间为60s。
7、于治疗结束后4、5、6、7、8天继续学习和测试，分别记做第0、1、2、3、和4天，记录每组小鼠找到平台的潜伏期。四、试验结果BJNA治疗组学习记忆改善情况明显优于小鼠非特异性IgG注射组和APPswe/PSl AE9空白对照组，潜伏期有明显差异，试验结果见图5(横坐标为潜伏期，单位是秒(S)，纵坐标为测试的时间,单位是天d),其中，E表示BJNA治疗组，F表示小鼠非特异性IgG注射组，G表示APPswe/PSl A E9空白对照组。上述结果表明，羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体有改善APPswe/PSl A E9模型小鼠学习记忆能力的作用。
实施例6羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体可变区基因的克隆取处于对数生长期的BJNA杂交瘤细胞(5 X IO6)，采用Trizol试剂法提取杂交瘤细胞株的总RNA，取少量进行紫外分光光度计定量及I %甲醛变性琼脂糖凝胶电泳。利用RT-PCR的方法扩增抗AP寡聚体羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体基因的轻、重链可变区基因。分别跟据小鼠I gG轻链和重链保守序列设计引物。根据试剂盒说明书以总RNA为模板,通过随机引物,使用SuperScrip II反转录酶合成cDNA第一链。反转录反应方案为总RNA5 ii g,随机引物IOOn mol/L,补加无Rnase水至18 ii L,70°C孵育IOmin后立即置冰浴上；继续向反应液中加入IOXbuffer 2. 5 u L, 25m mo I/LMgCl22. 5u L, IOm mol/L dNTP I y L，42°C孵育 Imin 后加入 I y L 200U/ u L SuperScrip II反转录酶，42°C反应50min，70°C孵育lOmin。反转录完毕后加入RNase水解RNA，使产物中只含有cDNA第一链。分别用以 HF atgggactccaggcttcaatttagttttcctt 与 HR cagtggatagaccgatggggg和 LFatgaagattgcctgttaggctgttggtgctg 与 LR actggatggtgggaagatgg 两对弓 I 物以 cDNA 第一链为模板扩增抗体轻链和重链(VL、VH)可变区基因。扩增产物VH(约406bp)和VL (约393bp)经琼脂糖凝胶(I. 5% )电泳鉴定，电泳图谱如图6所述，图中M为DL-2000DNA分子量Marker，I为羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体重链可变区基因，2为羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体轻链可变区基因。用PCR产物纯化试剂盒(Omega公司生产)回收纯化后，将目的片段克隆至T载体，测序分析，分析结果如序列表SEQ ID NO 1 SEQ ID NO 4所示。其中，PCR扩增反应按照常规方法进行以上述产物为模板，分别用重链和轻链引物扩增抗体轻、重链可变区基因。反应体系为cDNA 5iiL，上下游引物(lOmmol/L)各
Iu L, 10m mol/L dNTP 2 u L, IOXbuffer 5 y L，补加双蒸水至 50 y L，Ex Taq DNA 聚合酶
I.25 yl，加水至50 yl，混匀，瞬时离心后，置PCR仪内反应。PCR反应条件为95预变性5min,循环参数为94变性40s，55退火40s，72延伸lmin，共30个循环，最后72延伸15min。目的片段T载体克隆测序方案如下将PCR产物以试剂盒(Omega公司生产)纯化回收后，连入PMD18-T载体。连接反应体系为pMD18-T载体I yl，PCR产物纯化重链(或轻链)4 ill，连接缓冲液5 ill，混匀后置4°C过夜，转化大肠杆菌DH5 a，筛选重组克隆并测序。下面具体描述根据本发明的羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体基因的应用。
具体地，所述羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体轻、重链可变区基因可在制备用于诊断、预防和治疗AD的试剂(盒)及药物中应用。以本发明所述的羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体轻、重链可变区基因重构成一定形式的蛋白药物，可以直接用于AD的诊断及免疫治疗。以本发明所涉及的羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体轻、重链可变区基因编码的多肽，可重组成的新型抗体主要有下列几种形式(I)嵌合抗体是用鼠MAb的V区与人IgG的C区连接而成为人-鼠嵌合抗体。由于其完整地保存了鼠MAb的特异性和亲和力，同时降低了 HAMA等不良反应，故在免疫治疗中显示出良好的效果；(2)人源化抗体针对可变区基因结构的人源化改造，包括CDR移植、表面氨基酸残基修饰、骨架区交换、定位保留和表位导向选择等，从而不但降低了可变区的鼠源性同时又保持了鼠MAb的特异性和亲和力； (3)小分子抗体主要有由VH-CHl和VL-CHl组成的Fab抗体、用一条多肽(Gly4Ser) 3接头连接VH基因和VL基因而成的单链抗体、由VH和VL以非共价键结合而成Fv片段抗体、由VH或VL —个功能结构域组成的单域抗体、由单个CDR构成的最小识别单位等;(4)多价微型抗体主要有双链抗体(ScFv)2、FleX微型抗体、LD微型抗体、F(ab’)
2、F(ab’)3、(ScFv)4等。由于有多价抗原结合位点，亲和力高，分子大小适中，在肾脏中的清除率较慢的特点而具有较高的临床应用价值；(5)双特异性抗体是一类具有双重特异性和双重功能的抗体，又称双功能抗体；(6)重组抗体融合蛋白把Fab或Fv等基因片段，与非抗体的核酸或酶等其它生物功能分子连接形成的具有靶特定的生物活性重组蛋白；(7)噬菌体抗体把Ig的V区基因与丝状噬菌体DNA上基因III或基因VIII连接经转染宿主菌后，使其在膜表面外壳蛋白表达Fab或ScFv的融合蛋白产物，通过对此产物多轮相关抗原的亲和吸附，从中筛选出所需的特异性抗体。以本发明所涉及的羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体轻、重链可变区基因编码的多肽，以及重构成一定形式的抗体，进行各种酶、生物素、荧光(Cy3、Cy5等)等标记。在上述试验的基础上，可以利用合成或原核表达的AP及寡聚化的AP作为标准抗原样品，建立夹心ELISA法分析最适的包被抗体及浓度，最适的生物素化的检测抗体及浓度，同时以辣根过氧化物酶标记的亲和素和TMB为检测系统，获得可溶性A3 42寡聚体夹心ELISA分析方法，建立AD早期诊断方法的实验室标准。以上述由羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体轻、重链可变区基因编码的多肽重组或衍生的抗体分子可以组装成AD以及AD相关疾病诊断试剂盒。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
权利要求
1.一种羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体基因，其特征在于，包括重链可变区基因和轻链可变区基因，其中，所述重链可变区基因的序列如SEQ ID NO :1所示，所述轻链可变区基因的序列如SEQ ID NO 3所不。
2.根据权利要求I所述的羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体基因，其特征在于，所述重链可变区基因长405bp，所述轻链可变区基因长393bp。
3.根据权利要求I所述羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体基因编码的多肽，其特征在于，根据所述SEQ ID NO: I编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示；根据所述SEQ ID NO : 3编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO :4所示。
4.含有权利要求I所述的基因的细胞系。
5.含有权利要求3所述的多肽的细胞系。
6.根据权利要求I所述的基因或权利要求3所述的多肽在制备羧基末端特异的抗人淀 粉样蛋白单克隆抗体中的应用。
7.根据权利要求I所述的基因或权利要求3所述的多肽在制备阿尔茨海默病诊断试剂中的应用。
8.根据权利要求I所述的基因或权利要求3所述的多肽在制备阿尔茨海默病治疗药物中的应用。
9.根据权利要求I所述的基因或权利要求3所述的多肽在构建基因工程单克隆抗体表达体系中的应用。
10.多肽表位AP37-42在制备与筛选羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白寡聚体单克隆抗体中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种羧基末端特异的抗人淀粉样蛋白单克隆抗体基因和其编码多肽及应用，所述基因包括重链可变区基因和轻链可变区基因，其中，所述重链可变区基因的序列如SEQ ID N01所示，所述轻链可变区基因的序列如SEQ ID N03所示。根据本发明的基因，由于能够特异性识别Aβ42寡聚体而区分只相差2个氨基酸的Aβ40和Aβ42寡聚体，在免疫治疗实验中，可以避免与Aβ40结合，从而降低非特异性识别引起的副反应；根据该基因编码所得的多肽为淀粉样蛋白羧基末端多肽，免疫效果好，小鼠免疫血清效价高，并且其抗原识别能力具有构象特征，可以用于AD早期诊断。
文档编号G01N33/68GK102719443SQ20121013338
公开日2012年10月10日 申请日期2012年4月28日 优先权日2012年4月28日
发明者何金生, 张娜, 张莹, 洪涛 申请人:北京交通大学