专利名称：一种高通量提取生物样本中胡萝卜素的方法
技术领域：
本发明涉及类胡萝卜素生产及研究技术领域，具体地说，是一种通过利用固定于高速振荡器上的振荡架，将多组装有有机溶剂，振荡破碎珠和待提取样品的封闭破碎管进行同时振荡。借助于振荡破碎珠的碰撞碾磨效应以及有机溶剂的萃取效应，从而将各破碎管中细胞内所含的类胡萝卜素同时进行溶解抽提，从而实现分析样本的类胡萝卜素高通量快速提取。
背景技术：
胡萝卜素(Carotene)最早由Wackenroder在1831年从胡萝卜中分离出，β-胡萝 卜素的分子式由Willstather在1906年测定，而结构式在1928年-1932年为Zechmeister等确定。胡萝卜素是一种橙色的光合色素，广泛存在于绿色和黄色蔬菜以及水果中，使其带有橙色，并在光合作用中扮演传递能量的角色。胡萝卜素属于属四萜类化合物。在其分子的两端各有一个紫萝酮环，中心断裂可产生两个维生素�。鞘踊拼�(维生素Α)的二聚物且拥有多种结构，最主要的两种是α-胡萝卜素与β-胡萝卜素，此外还有Υ-胡萝卜素、δ -胡萝卜素与ε -胡萝卜素三种。β-胡萝卜素分子式是C4tlH56，分子量约536. 88。由于该化合物分子中具有长的共轭双键生色基团，因而具有光吸收的性质，使其显黄色，在紫外光谱中有三个吸收峰(455nm, 483nm和340nm)。β -胡萝卜素主要有全反式，9-顺式，13-顺式及15-顺式四种形式，其中天然的β_胡萝卜素主要是全反式异构体和少量顺式异构体。这主要是因为在顺式结构中，双键附近的氢原子之间或氢原子和甲基基团之间会产生较大的空间位阻，而造成顺式结构的不稳定。9-顺式-β-胡萝卜素在疏水溶剂中溶解容易，结晶困难，通常以油状物出现，而全反式-β -胡萝卜素结晶较为容易。β -胡萝卜素无臭无味，稀溶液呈橙黄色至黄色，浓度增大时带橙色，因溶剂极性不同可能稍带红色。β_胡萝卜素的结晶为暗红紫色六角棱晶或暗红色菱形片晶。在真空中的熔点为184°C，由于它的分子结构中不存在不对称碳原子，因而不具备旋光性。β-胡萝卜素易溶于二硫化碳、二氯甲烷、苯、甲苯、氯仿、四氯化碳、丙酮、石油醚、己烷和植物油，不溶于水，难溶于醚、丙二醇、甘油、丙二醇、甲醇、乙醇、酸和碱。其在橄榄油和苯中的溶解度均为O. lg/mL，在氯仿中的溶解度为43g/l，高浓度时呈橙红色，低浓度时呈橙色至黄色。β -胡萝卜素在PH值2 7的范围内较稳定，且不受还原性物质的影响，但对光和氧均不稳定，易在光照和加热时发生氧化反应。铁离子会促使其褪色。自1831年Wzckenerler首次成功分离胡萝卜素以来，世界上科学家们对胡萝卜素的研究一直没有停止过。近年来，有关β_胡萝卜素对人体作用的研究异常活跃。β_胡萝卜素有维生素A源之称，是一种重要的人体生理功能活性物质，其在肝脏中可以转变成维生素Α，是维生素A合成的前体[β-胡萝卜素的合成.忻祥法，黄绮玲，俞国强，王慧倩，邵文文，金光卫，中国医药工业杂志，1985. 16(2) :54-55.]。尽管β-胡萝卜素的生物活性机制尚未完全了解，Blumberg在1994年柏林召开的第二届抗氧化剂维生素在预防疾病中的作用的国际会议时已经提出，β_胡萝卜素至少有以下几方面的功能(I) β _胡萝卜素是维生素A的前体，而维生素A是人体必需的微量营养成分；(2)具有免疫功能，能提高人体免疫系统抵抗病原物的能力；(3)具有抗氧化剂的功能，能够淬灭单线态氧，清除体内自由基的影响；(4)能预防癌症，延缓癌症的发展；(5)促进细胞缝间连接交流。目前，胡萝卜素在抗炎、解毒、抗癌、预防心血管疾病、防治白内障和保护肝脏方面的生理作用也已被越来越多地证实，并应用于疾病的预防和治疗[Considerations of the scientificsubstantiation for antioxidant vitamins and beta—carotene in disease prevention. Blumberg, J.，Am J Clin Nutr,1995. 62(6) : 1521S-1526S.]。最近一项通过对4000多名内科医师长达18年的研究表明，长期隔日服用50mg的β-胡萝卜素可以有效的防治男性大脑意识的衰退[Grodstein, F.，J. H. Kang, R. J. Glynn, N. R. Cook, and J. M. Gaziano, A Randomized Trial of Beta Carotene Supplementation and CognitiveFunction in Men The Physicians' Health Study II.Arch Intern Med, 2007. 167(20) :2184_2190]。此外，β -胡萝卜素还可以作为着色和抗氧化添加剂应用于医药、食品、化妆品和动物饲料等行业。
β -胡萝卜素根据生产方式不同分为化学合成β -胡萝卜素和天然β _胡萝卜素两大类。其中包括β-胡萝卜素在内的类胡萝卜素广泛存在于生物界中，包括植物、动物、 藻类和微生物等，它们是天然类胡萝卜素的丰富来源。虽然天然β_胡萝卜素生产成本较高，但由于不存在致癌物质，水溶性较好，具有良好的生理活性，且常常与其他类胡萝卜素等抗氧化天然活性产物复合在一起，因此具有很好的抗哮喘、抗染色体畸变和防癌等药理活性。天然β-胡萝卜素目前已被国际癌症研究中心及美国国家癌症研究所认可，并经联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)批准为A类营养食品添加剂。随着人们对天然营养和保健产品认识的不断提高，以及食品安全问题的日益重视(尤其是近年来违法使用瘦肉精、吊白块、苏丹红、三聚氰胺、梓檬黄和邻苯二甲酸酯等人工色素和食品添加剂现象的曝光)，天然色素及安全的食品添加剂(例如，天然色素β-胡萝卜素等)将逐步在市场中占据主导地位。
目前，天然β _胡萝卜素主要可通过植物提取、盐藻法和微生物发酵三种方法生产。其中，微生物发酵法具有生产稳定，受季节、气候、时间和地域因素影响�。芷诮隙蹋柿靠刂葡喽员冉先菀椎扔攀�。另外，通过发酵规模的放大，也较为容易满足目前对天然类胡萝卜素日益增长的市场需求。鉴于以上特点，研究人员对天然分离得到的产β_胡萝卜素微生物进行了系统的比较和研究，并通过诱变筛选和发酵研究，发现了一些极有应用价值的工业微生物菌株。
无论何种来源的天然β-胡萝卜素，其工业生产菌株、藻种以及各类动植物皆经过长期的诱变、杂交、基因工程改造以及筛选工作，从而使得生物来源的组织细胞，能够在工业生产过程中大量积累β_胡萝卜素，以降低生产成本并获得符合预期的市场利润。在以上工业菌株(包括各类微生物、藻种、动植物及相应的细胞系)选育过程中，对培养得到的生物体组织细胞中的β-胡萝卜素进行提取和分析，是目前表征生物体组织细胞生产及积累β_胡萝卜素能力高低的唯一和必须手段。
根据以往文献报道，对各类生物体组织细胞进行破碎并对细胞中的β _胡萝卜素进行提取的方法主要分为物理法和化学法。其原理为借助于各类溶剂体系，直接渗入细胞5中提取(例如，超临界流体)或借助各类物理或化学过程使细胞破裂甚至粉碎后，对细胞内的β-胡萝卜素进行溶解萃取。
孙景茂发明《一种从胡萝卜中提取天然β胡萝卜素的工艺》(公开号CN1092063 ；
公开日1994.09. 14)。它以干燥的胡萝卜为原料，以沸点低于80°C，室温下为液体的有机溶剂为提取剂，以胡萝卜重量与溶剂体积之比为1 I. 5 5，浸取温度为室温，经过罐组逆流浸出器提�。伟迨奖∧ふ舴⑵髡舴⑴ㄋ酰峋В吹樱亟峋В稍锟傻煤�80 % 90%的β-胡萝卜素晶体。
中国科学院武汉病毒研究所的陈涛等人发明了《一种三孢布拉氏霉菌中胡萝卜素的提取方法》(公开号CN1221737 ;
公开日1999. 07. 07)所述方法是采用低沸点的石油系有机溶剂萃取菌中的胡萝卜素。萃取溶剂与菌体积比为I 10 : 1，温度为40°C 70°C， 每次为O. 5小时 I小时,萃取二次,并合并萃取液。
西格弗里德·彼得等人发明了《从含有胡萝卜素的原料中提取胡萝卜素的方法》(国际公布W099. 58611英；
公开日1999· 11. 18 ;公开号CN1297469 ;
公开日
2001.05.30)。该方法主要从含有胡萝卜素的原料中、特别是从生物学来源的脂肪和油中提取胡萝卜素的方法，该方法包括用提取剂利用逆流流程提取所述含有胡萝卜素的原料， 所述提取剂包含选自下列成员的至少一种物质乙腈、N-甲基吡咯烷酮、N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、N，N-二甲基乙酰胺、糠醛、吗啉、4-甲酰基吗啉、4-乙酰基吗啉、4-甲基吗啉、 4-苯基吗啉。
上海化工研究院的童海宝等人发明了《β-胡萝卜素的提取方法》(公开号 CN1331342;公开·日2002. 01. 16)。该方法是将发酵液过滤得到的湿菌丝体，进行离心过滤得到菌丝体。随后，将菌丝体配成10%的水溶液，并利用珠磨机进行细胞破损。破碎后的菌丝体，利用95%的乙醇(或无水乙醇)进行两次逆流脱水。脱水后的滤饼以溶剂油进行三次逆流萃取提取β_胡萝卜素。提取液经结晶、真空干燥后得到β_胡萝卜素晶体。
中国科学院武汉病毒研究所的童骁等人发明了《胡萝卜素的提取方法》(公开号 CN1363554 ;
公开日2002. 08. 14)。该发明利用石油有机溶剂在40°C 70°C萃取三孢布拉氏霉菌菌体中的胡萝卜素30min/次 60min/次。共反复萃取两次，合并得到萃取液。所得萃取液用适量的碱在40°C 60°C进行精炼中和其中的游离脂肪酸，得到的萃取液用清水或盐水洗涤至中性，得到中性萃取液，然后再将萃取液经浓缩、结晶、脱胶和脱溶可得到胡萝卜素晶体和油溶品。
中国农业大学的孙君社等人发明公开了《一种提取β_胡萝卜素的方法》(公开号CN1683334 ;
公开日2005. 10. 19)。该方法利用蛋白酶和果胶酶对胡萝卜原料于40°C酶解28小时。酶解后的原料离心分离脱水，并以JY99-III型超声波连续破碎机进行细胞破壁lOmin，得到胡萝卜原料固形物。利用丙酮和正己烷(I I. I)混合有机溶剂，对固形物原料于萃取罐中在68°C和260rpm搅拌转速下，回流萃取18小时,得到β -胡萝卜素粗制品。所述有机溶剂为丙酮，正己烷，乙酸乙酯和甲醇中的任意一种或任两种组合。通过对萃取后得到的β-胡萝卜素粗制品有机溶液，进行超临界二氧化碳流体萃�。玫溅�-胡萝卜素。
上海化工研究院的乌云高娃等人发明了《一种天然β-胡萝卜素的提取方法》(公开号CN101070555 ;
公开日2007. 11. 14)。该方法将发酵液过滤得到的三孢布拉霉菌湿菌CN 102914462 A书明说4/10 页体，利用物理和化学方法对细胞壁进行破壁处理后，将吸附介质如磁铁矿等与破碎裂解液充分混合一段时间。利用过滤法，将吸附有β_胡萝卜素的吸附介质进行分离并干燥。用环己烷溶剂提取吸附在吸附介质表面上的脂溶性天然β-胡萝卜素，提取过β-胡萝卜素的吸附介质可重复利用。工艺简单、成本较低。
乔维汉等人发明了《一种天然β-胡萝卜素的提取方法》(公开号CN101768099A ；
公开日2010.07.07)。该方法系将胡萝卜粉碎打浆，并在萃取罐中加入互不相溶的混合溶剂(甲醇和正己烷或乙腈和正庚烷)，于45°C 50°C、800W 900W超声波辅助下搅拌萃取 30min,并静止分层。以新鲜正己烷对下层的浆料多次重复萃取操作，并合并每次萃取产生的上层正己烷溶液。合并后的萃取液经液液分配后脱溶得到β-胡萝卜素油状物，经重结晶得到β_胡萝卜素晶体。
刘沛则发明了一种《胡萝卜素的提取工艺》(公开号CN102060742A;
公开日
2011. 05. 18)。该工艺主要利用其工艺步骤为取样品香甘薯，放入组织捣碎机中打碎成糊状物，并加入体积比为I : 9 I : I的丙酮-石油醚混合溶液，在超声波清洗器中提取 5min 30min，离心分离出上清液，静置分层，弃除下层液体，重复提取2 6次，并合并提取液。
另有文献报道，生物样品中的胡萝卜素主要通过丙酮-甲醇，以及丙酮-石油醚等混合溶剂，经多次浸取抽提之后得到；且浸取抽提过程，通常还需要辅以超声或者人工研磨 [Takaichi, S. ,Characterization of carotenes in a combination of a Cl8HPLCc olumn with isocratic elution and absorption spectra with a photodiode—array detector. Photosynth Research,2000.65 93~99 ；Choudhari, S. and R. Singhal, Mediaoptimization for the production of beta—carotene by Blakeslea trispora A statisticalapproach. Bioresour Technol,2008. 99(4) :722_730]。
根据以上已经公开报道的专利和文献信息分析可知，目前各种利用物理和化学法破碎组织细胞提取β-胡萝卜素的专利技术，其发明的主要目标主要面对大规模的工业生产过程。这些技术的主要特点为所需装置较大且昂贵；处理物料多，但每次的损耗以及所需的样品量较大；过程较为复杂(需要样本的预处理，以及需要多次对同一个样品进行反复提取处理)；所需溶剂量较大；提取过程常常需要加热处理，运行成本高；每次每套装置仅能处理单独的样品。对于以获得优良工业生产菌株的菌种选育以及最优过程工艺的发酵优化过程而言，由于一次所需提取分析样本极大(从数十至数百个样品/次)，以往的文献专利所公开报道的技术存在耗时、耗力、耗能、劳动强度大、处理通量低、样品需求量大且提取过程有损耗等缺点，不适合大量样品的同时处理以及样品分析的需求。发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种可一次性充分提取生物样本中胡萝卜素的高通量提取方法。本发明的优势在于，处理样本通量大、过程简单、工作效率高、实验系统误差小、所需样品和溶剂少、劳动强度低、且隔绝溶剂挥发。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现一种高通量提取生物样本中胡萝卜素的方法，其特征在于，以固定有振荡破碎管架的机械振荡器，提供振荡破碎动力，将生物样本、振荡破碎珠和有机溶剂装至振荡破碎管内，并将密封的振荡破碎管锁定于振荡器管7架上，在一定的振荡转速或频率下，利用管内振荡破碎珠的碰撞摩擦及有机溶剂的渗透溶解，实现生物样本组织或细胞的研磨破碎以及胡萝卜素样本的溶解提取。
所述的生物样本包括三孢布拉霉菌、微生物、动物细胞、植物细胞、动物组织或植物组织。
所述的微生物包括天然菌株，突变株或基因工程菌株。
所述的胡萝卜素包括α -胡萝卜素、β -胡萝卜素、Y -胡萝卜素、δ -胡萝卜素、 胡萝卜素、胡萝卜素、虾青素、番茄红素、玉米黄质、角黄素、辣椒红素、叶黄素、辣椒黄素、链孢红素、番爺红素原(前番爺红素)、八氢番爺红素、六氢番爺红素、花黄素(百合黄素)、玉米胡萝卜素、葱绿叶黄素、辣椒玉红素、硅甲藻黄素、岩藻黄质、多甲藻素、隐黄素、紫黄素(紫黄质)、大马烯酮、3-氧代�？�、新黄素(新黄质)、硅藻黄素、藏红花素、藏红花苦素中的一种或几种的混合。
所述的有机溶剂包括石油醚、四氯化碳、氯仿、二氯甲烷、二硫化碳、三油酸甘油酯、植物油、乙酸乙酯、乙酸甲酯、甲酸乙酯、四氢呋喃、二甲亚砜、N，N- 二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、四氢呋喃、糠醛、吗啉、4-甲酰基吗啉、4-乙酰基吗啉、4-甲基吗啉、4-苯基吗啉、苯、甲苯、石油醚、戍烧、异戍烧、己烧、环己烧、庚烧、辛烧、壬烧、葵烧、甲醇、乙醇、丙醇、 丁醇、丙酮、乙腈在内的一种或者几种的混合。
根据权利要求I所述的一种高通量提取生物样本中胡萝卜素的方法，其特征在于，所述的机械振荡器的振荡方式包括水平回旋振荡、垂直回旋振荡、垂直往复振荡、水平往复振荡以及倾斜往复振荡方式的一种，其振荡轨迹亦包括圆周回旋振荡，线性往复振荡或椭圆振荡轨迹；机械振荡器的振幅为O. Imm 400mm。
所述的振荡破碎珠为空心珠或实心珠，其形状包括球形、长方形、立方形、椭圆形、 锥形或不规则形状中的任意一种，粒径大小为Imm 100mm,振荡破碎珠的数量为I 1000 个；所述的振荡破碎的安放倾斜角度为0° 180° ;所述的机械振荡器的转速为IOrpm 3000rpm,振荡时间为Is 360min。
所述的振荡破碎珠的材质包括钢、不锈钢、钨钢、玻璃、玛瑙、聚四氟乙烯、陶瓷、超高分子量聚乙烯、高分子量化合物或含有以上材质的复合型材质。
所述的振荡破碎珠为直径为5mm 8mm的实心圆球形振荡破碎珠，数量为12 42粒；所述的振荡破碎管通过振荡破碎管固定架固定在机械振荡器上，振荡破碎架倾斜安放的水平夹角度为0° 60° ;所述的机械振荡器的转速为300rpm 500rpm,振荡时间为 20min 40mino
所述的振荡破碎管使用直径或管口周长范围为Imm 500mm，容积范围为Iml IOOOml的圆底、平底或圆锥形底的圆管状、长方体或立方体的容器。
机械振荡器可以根据需要改变振荡器类型、振荡破碎管运行轨迹、振荡破碎时间、 破碎温度、提取溶剂、振荡转速(或频率)和振幅、振荡破碎珠规格和数量以及样品处理量。
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种快速高通量的天然胡萝卜素提取方法，以满足大量样品提取的需求，从而为高通量的菌株选育及生产工艺优化提供胡萝卜素提取分析上的技术保障，并进而提高通过菌株选育和工艺优化获取高产胡萝卜素菌株及最优工艺条件的工作效率以及成功几率。由于该发明系利用密闭的小型破碎管，借助高频振荡产生的动能，以及振荡破碎珠的碰撞碾磨效应以及溶剂萃取效应，实现样品的破碎CN 102914462 A书明说6/10 页及样品中β_胡萝卜素的充分提取。鉴于以上原理，因此整个提取过程具有以下优点
I.待提取样品无需复杂的预处理过程，只需要将样品进行离心过滤，去除游离的水分即可。每次提取，只需要取得少量的组织或细胞样品，加入破碎管中，并添加振荡破碎珠和有机溶剂即可置于振荡器中的振荡架上即可进行振荡破碎。
2.整个过程操作简单，不需要多级萃取过程。破碎后，直接将破碎管进行离心，待管内的细胞或组织碎片沉积至管底，即可取少量的澄清萃取液进行β-胡萝卜素的分析。
3.无溶剂挥发泄露。封闭的提取体系避免了有机溶剂挥发溢出对操作人员的毒害。
4.由于在密闭的体系进行细胞的破碎和提取，因此无损耗，可以实现细胞的完全粉碎，并做到100%回收样品中的β-胡萝卜素。
5.每个样品所需溶剂量极小。每个样品所需的有机溶剂体积仅为5ml，从而避免了样品提取分析过程中的大量试剂开销。
6.可常温进行操作，避免了加热、回流以及仪器设备的冷却，降低了提取过程中的能耗。
7. 一次可处理的样品数量极大。根据振荡架的设计容量，以及振荡摇床的尺寸，可以实现一次同时破碎100·至1000个样本。实现了大量样品的快速同时提取处理，符合菌株选育过程中的高通量需求。
8.由于提取过程中无溶剂和样品损耗，因此该方法所需的样本量很少(视样品中胡萝卜素的含量，仅需要O. Olg 2g样品)，满足对待测样品中β-胡萝卜素分析的要求。
图I为破碎时间与β -胡萝卜素提取率的曲线图2为振荡破碎珠直径大小对β -胡萝卜素提取率的影响曲线图3为振荡破碎管振荡角度对β -胡萝卜素提取率的影响曲线图4为振荡器振荡转速对β -胡萝卜素提取率的影响曲线图5为振荡破碎珠使用数量对β -胡萝卜素提取率的影响曲线图6为国标提取法与本发明提取方法的分析结果比较图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以下实施例并不构成对本发明的限制。
首先，以75目滤网将发酵液中的三孢布拉霉菌菌体进行真空抽滤收集，所收获的滤饼，以等发酵液体积的自来水漂浮清洗。随后，收集漂浮的菌体细胞并重新以75目滤网将菌体进行真空抽滤收集。自来水漂洗三孢布拉霉菌发酵菌体两次，以充分去除发酵液中少量的小颗粒泥沙以及不可溶性微粒。最后，以相同体积的去离子水漂洗三孢布拉霉菌发酵菌体,并以4_孔径的滤网去除菌体悬浮液中夹杂的较大的菌丝体,重复过滤两次,并以 75目滤网将菌体进行真空抽滤收集。
将所收集的菌体滤饼，以药匙分散均匀，并称重约O. 20±0. Olg分装于IOml破碎管中封盖，-20°C避光保存。分装菌体作为本发明实施例所用的样品。9
实施例I
每组条件设三组平行样，破碎振荡破碎珠直径为6mm，破碎振荡破碎珠使用数量为 15个，破碎转速为400rpm，破碎管安放倾角为0°，分析样品的称重为约O. 2g。破碎时间按图I中所述条件范围进行实施
根据实施结果分析可知，当破碎时间达到30min时，三组平行样的破碎提取率皆达到100%，且随着破碎时间的延长，三孢布拉霉菌中β-胡萝卜素提取率在100 %的水平上保持不变。由此可见，通过选择合适的破碎时间，本发明可以有效的实施于三孢布拉霉菌β-胡萝卜素的提�。黄渲校酆峡悸撬醵烫崛∈奔湟约唉�-胡萝卜素提取效果稳定性， 30min提取时间最佳。
实施例2
为了保证本发明可以有效的实施于三孢布拉霉菌中β-胡萝卜素的提取。本实施例对破碎珠的大小规格进行了考察。在破碎振荡破碎珠使用数量为15个，破碎转速为 400rpm,破碎时间30min,破碎管安放倾角为0° ,分析样品的称重为约O. 2g的实施条件下, 本实施例考察4mm, 5mm和6mm三种大小不同破碎珠对发明实施的影响。
根据发明实施结果可知，在破碎珠尺寸考察范围内，皆可以充分的提取三孢布拉霉菌中的β-胡萝卜素。在三组实施实验中，以6mm钢珠的破碎效果最佳，且工作效率最高。
实施例3
通过改变破碎管固定架角度，考察本发明对三孢布拉霉菌细胞内β-胡萝卜素提取的实施。将装有15粒直径6mm的振荡破碎珠，约O. 2g的三孢布拉霉菌细胞，以及5ml提取溶剂的振荡破碎管锁定于不同安放角度的固定架中，于破碎转速为400rpm的振荡器上破碎时间30min，以此考察本发明的实施，结果如图3所示。
据本实施例的结果分析可知，当振荡破碎管安置角度为90° (垂直于回旋振荡平面)时，细胞破碎效果(或β_胡萝卜素提取效率)最差；随着倾角的不断增大，在其他条件保持不变的条件下，破碎效果逐渐改善。当振荡破碎管的振荡倾角为水平时，三孢布拉霉菌细胞的破碎效果以及胞内β_胡萝卜素的提取效果达到最佳。
实施例4
为了考察振荡器振荡转速对本发明实施的影响，本实施例将装有15粒直径6mm的振荡破碎珠，约O. 2g的三孢布拉霉菌细胞，以及5ml提取溶剂的振荡破碎管锁定于O °安放角度的固定架中，于250rpm 500rpm振荡转速范围内破碎时间30min。结果如下
根据本发明的实施结果分析可知，在所考察的振荡器振荡转速范围内，皆可以提取三孢布拉霉菌菌体中的β-胡萝卜素；其中，以400rpm 500rpm转速范围内可以达到有效的实施；另外，又以振荡器最大振荡转速(500rpm)的破碎效果最佳。综合考虑本发明实施效率以及设备的使用负荷，其中又以400rpm振荡转速最为适宜。虽然在所考察的条件范围内，较低的振荡转速其提取效果较差，未能达到100 %提取率，但通过适当延长振荡破碎时间以及改变振荡珠的大小、数量和材质，理应可以使本发明进行有效的实施。
实施例5
为了考察振荡破碎珠使用数量对本发明实施效果的影响，本实施例将装有直径为 6mm的振荡破碎珠，约O. 2g的三孢布拉霉菌细胞，以及5ml提取溶剂的振荡破碎管锁定于 O °的振荡固定架中，于破碎转速为400rpm的振荡器上破碎时间30min，以此考察3 42粒破碎珠使用范围内，本发明的实施效果。结果如图5所示
根据图表中的数据可知，在本实施例其他参数固定的情况下，随着振荡破碎珠使用数量的增加，本专利实施的效果得到显著改善。具体表现为，完全提取三孢布拉霉菌细胞内β_胡萝卜素所需的时间会随之大大减少。虽然较少的振荡破碎珠使用数量，在当前实施条件下，未能完全提取三孢布拉霉菌细胞内β-胡萝卜素，但通过适当改变振荡破碎珠的材质、规格和尺寸，振荡器的运行转速以及振荡破碎时间，将可以使本发明得到有效的实施。
实施例6
在本实施例中，为了最终证明本发明实施的有效性，以本发明所用的方法与国标 《GB8821-1988食品添加剂β -胡萝卜素》中的方法，对同一批27个不同实验条件下所获取的三孢布拉霉菌菌体中的β-胡萝卜素含量进行提取并分析。结果如图6所示。
在本实施例中，本发明的实施条件为振荡破碎珠直径为6mm，使用数量为12个， 破碎转速为400rpm,破碎时间为30min,破碎管安放倾角为0°。结果显示以两种不同的方法对同一批样品进行提取分析，所测得β_胡萝卜素的含量基本相符。从数据上表现为， 回归曲线为线性，且其斜率和回归系数接近于I。由此可以证实，通过本实施例，有效的实现了三孢布拉霉菌菌体细胞中β_胡萝卜素的准确充分提�。⒓婀肆吮痉⒚髟て诘母髦钟�
实施例I
一种高通量提取生物样本中胡萝卜素的方法，以固定有振荡破碎管架的机械振荡器，提供振荡破碎动力，将生物样本天然菌株或植物组织、振荡破碎珠和有机溶剂石油醚装至振荡破碎管内，并将密封的振荡破碎管锁定于振荡器管架上，在转速为300rpm下，振荡时间为360min，利用管内振荡破碎珠的碰撞摩擦及有机溶剂的渗透溶解，实现生物样本组织或细胞的研磨破碎以及胡萝卜素样本的溶解提取。
所述的胡萝卜素包括β-胡萝卜素、虾青素、番茄红素以及玉米黄质或以上化合物的衍生化合物。
所述的机械振荡器的振荡方式包括水平圆周回旋振荡；机械振荡器的振幅为 IOmm0所述的振荡破碎珠为空心钢珠，其形状为长方体形，粒径为1mm，振荡破碎珠的数量为 42个；所述的振荡破碎的安放倾斜角度为30°。
实施例8
一种高通量提取生物样本中胡萝卜素的方法，以固定有振荡破碎管架的机械振荡器，提供振荡破碎动力，将生物样本动物细胞、振荡破碎珠和有机溶剂氯仿装至振荡破碎管内，并将密封的振荡破碎管锁定于振荡器管架上，在转速为500rpm下，振荡时间为120min， 利用管内振荡破碎珠的碰撞摩擦及有机溶剂的渗透溶解，实现生物样本组织或细胞的研磨破碎以及胡萝卜素样本的溶解提取。
所述的胡萝卜素包括β -胡萝卜素、虾青素以及番茄红素或以上化合物的衍生化合物。
所述的机械振荡器的振荡方式包括水平圆周回旋振荡；机械振荡器的振幅为 10mm。所述的振荡破碎珠为直径为5mm 8mm实心钨钢珠，振荡破碎珠的数量为12个；所述的振荡破碎的安放倾斜角度为60°。振荡破碎管使用管口周长为16mm，容积为IOml圆锥形底的圆管容器。
实施例9
一种高通量提取生物样本中胡萝卜素的方法，以固定有振荡破碎管架的机械振荡器，提供振荡破碎动力，将生物样本动物细胞、振荡破碎珠和有机溶剂石油醚和丙酮混合溶液或二甲亚砜装至振荡破碎管内，并将密封的振荡破碎管锁定于振荡器管架上，在转速为 IOrpm下，振荡时间为360min，利用管内振荡破碎珠的碰撞摩擦及有机溶剂的渗透溶解，实现生物样本组织或细胞的研磨破碎以及胡萝卜素样本的溶解提取。
所述的胡萝卜素包括α -胡萝卜素、β -胡萝卜素、Y -胡萝卜素、δ -胡萝卜素、 ε-胡萝卜素和ζ-胡萝卜素或以上化合物的衍生化合物。
所述的机械振荡器的振荡方式包括水平线性往复振荡；机械振荡器的振幅为 400mm。所述的振荡破碎珠为超高分子量聚乙烯包裹钢珠，其形状为立方体形，长度为 100mm，振荡破碎珠数量为I个；所述振荡破碎管安放倾斜角度为60°。振荡破碎管使用管口周长为500mm，容积为IOOOml的平底长方体振荡破碎管。
实施例10
一种高通量提取生物样本中胡萝卜素的方法，以固定有振荡破碎管架的机械振荡器，提供振荡破碎动力，将生物样本动物细胞、振荡破碎珠和有机溶剂二硫化碳装至振荡破碎管内，并将密封的振荡破碎管锁定于振荡器管架上，在转速为3000rpm下，振荡时间为 360min，利用管内振荡破碎珠的碰撞摩擦及有机溶剂的渗透溶解，实现生物样本组织或细胞的研磨破碎以及胡萝卜素样本的溶解提取。
所述的胡萝卜素包括α -胡萝卜素、β -胡萝卜素、Y -胡萝卜素、δ -胡萝卜素、 胡萝卜素、胡萝卜素、虾青素、番茄红素、玉米黄质、角黄素、辣椒红素、叶黄素、辣椒黄素、链孢红素、番爺红素原(前番爺红素)、八氢番爺红素、六氢番爺红素、花黄素(百合黄素)、玉米胡萝卜素、葱绿叶黄素、辣椒玉红素、硅甲藻黄素、岩藻黄质、多甲藻素、隐黄素、紫黄素(紫黄质)、大马烯酮、3-氧代�？肌⑿禄扑�(新黄质)、硅藻黄素、藏红花素、藏红花苦素的一种或几种的混合。
所述的机械振荡器的振荡方式包括水平回旋振荡；机械振荡器的振幅为O. Imm0 所述的振荡破碎珠为实心玛瑙材质，其形状为圆形，粒径为1mm，振荡破碎珠的数量为1000 个；所述的振荡破碎的安放倾斜角度为60° ;振荡破碎管使用直径为10mm，容积为IOml的圆底圆管状振荡破碎管。
实施例11
一种高通量提取生物样本中胡萝卜素的方法，以固定有振荡破碎管架的机械振荡器，提供振荡破碎动力，将生物样本动物细胞、振荡破碎珠和有机溶剂石油醚和丙酮混合溶液装至振荡破碎管内，并将密封的振荡破碎管锁定于振荡器管架上，在转速为3000rpm下， 振荡时间为ls，利用管内振荡破碎珠的碰撞摩擦及有机溶剂的渗透溶解，实现生物样本组织或细胞的研磨破碎以及胡萝卜素样本的溶解提取。
所述的胡萝卜素包括α -胡萝卜素、β -胡萝卜素、Y -胡萝卜素、δ -胡萝卜素、 胡萝卜素、胡萝卜素、虾青素、番茄红素、玉米黄质、角黄素、辣椒红素、叶黄素、辣椒黄素、链孢红素、番爺红素原(前番爺红素)、八氢番爺红素、六氢番爺红素、花黄素(百合黄素)、玉米胡萝卜素、葱绿叶黄素、辣椒玉红素、硅甲藻黄素、岩藻黄质、多甲藻素、隐黄素、紫黄素(紫黄质)、大马烯酮、3-氧代�？�、新黄素(新黄质)、硅藻黄素、藏红花素、藏红花苦素的一种或几种的混合。
所述的机械振荡器的振荡方式包括水平回旋振荡；机械振荡器的振幅为5_。所述的振荡破碎珠为实心陶瓷材质，其形状为圆形，粒径为6mm，振荡破碎珠的数量为100个； 所述的振荡破碎的安放倾斜角度为60° ;振荡破碎管使用直径为20mm，容积为IOOml的圆底圆管状振荡破碎管。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。
权利要求
1.一种高通量提取生物样本中胡萝卜素的方法，其特征在于，以固定有振荡破碎管架的机械振荡器，提供振荡破碎动力，将生物样本、振荡破碎珠和有机溶剂装至振荡破碎管内，并将密封的振荡破碎管锁定于振荡器管架上，在一定的振荡转速或频率下，利用管内振荡破碎珠的碰撞摩擦及有机溶剂的渗透溶解，实现生物样本组织或细胞的研磨破碎以及胡萝卜素样本的溶解提取。
2.根据权利要求I所述的一种高通量提取生物样本中胡萝卜素的方法，其特征在于，所述的生物样本包括三孢布拉霉菌、微生物、藻类、动物细胞、植物细胞、动物组织或植物组织。
3.根据权利要求2所述的一种高通量提取生物样本中胡萝卜素的方法，其特征在于，所述的微生物包括天然菌株，突变株或基因工程菌株。
4.根据权利要求I所述的一种高通量提取生物样本中胡萝卜素的方法，其特征在于，所述的胡萝卜素包括α -胡萝卜素、β -胡萝卜素、Y -胡萝卜素、δ -胡萝卜素、ε -胡萝卜素、胡萝卜素、虾青素、番茄红素、玉米黄质、角黄素、辣椒红素、叶黄素、辣椒黄素、链孢红素、番茄红素原、八氢番茄红素、六氢番茄红素、花黄素、玉米胡萝卜素、葱绿叶黄素、辣椒玉红素、硅甲藻黄素、岩藻黄质、多甲藻素、隐黄素、紫黄素、大马烯酮、3-氧代�？�、新黄素、硅藻黄素、藏红花素、藏红花苦素中的一种或几种的混合。
5.根据权利要求I所述的一种高通量提取生物样本中胡萝卜素的方法，其特征在于，所述的有机溶剂包括石油醚、四氯化碳、氯仿、二氯甲烷、二硫化碳、三油酸甘油酯、植物油、乙酸乙酯、乙酸甲酯、甲酸乙酯、四氢呋喃、二甲亚砜、N，N- 二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、四氢呋喃、糠醛、吗啉、4-甲酰基吗啉、4-乙酰基吗啉、4-甲基吗啉、4-苯基吗啉、苯、甲苯、石油醚、戊烷、异戊烷、己烷、环己烷、庚烷、辛烷、壬烷、葵烷、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙酮、乙腈在内的一种或者几种的混合。
6.根据权利要求I所述的一种高通量提取生物样本中胡萝卜素的方法，其特征在于，所述的机械振荡器的振荡方式包括水平回旋振荡、垂直回旋振荡、垂直往复振荡、水平往复振荡以及倾斜往复振荡方式的一种，其振荡轨迹亦包括圆周回旋振荡，线性往复振荡或椭圆回旋振荡轨迹；机械振荡器的振幅为O. Imm 400mm。
7.根据权利要求I或6所述的一种高通量提取生物样本中胡萝卜素的方法，其特征在于，所述的振荡破碎珠为空心珠或实心珠，其形状包括球形、长方形、立方形、椭圆形、锥形或不规则形状中的任意一种，粒径大小为Imm 100mm,振荡破碎珠的数量为I 1000个；所述的振荡破碎的安放倾斜角度为0° 180° ;所述的机械振荡器的转速为IOrpm 3000rpm,振荡时间为Is 360min。
8.根据权利要求7所述的一种高通量提取生物样本中胡萝卜素的方法，其特征在于，所述的振荡破碎珠的材质包括钢、不锈钢、钨钢、玻璃、玛瑙、聚四氟乙烯、陶瓷、超高分子量聚乙烯、高分子量化合物或含有以上材质的复合型材质。
9.根据权利要求I或6所述的一种高通量提取生物样本中胡萝卜素的方法，其特征在于，所述的振荡破碎珠为直径为5mm 8mm的实心圆球形振荡破碎珠，数量为12 42粒；所述的振荡破碎管通过振荡破碎管固定架固定在机械振荡器上，振荡破碎架倾斜安放的水平夹角度为0° 60° ;所述的机械振荡器的转速为300rpm 500rpm,振荡时间为20min 40mino
10.根据权利要求9所述的一种高通量提取生物样本中胡萝卜素的方法，其特征在于，所述的振荡破碎管使用直径或管口周长范围为Imm 500mm，容积范围为Iml IOOOml的圆底、平底或圆锥形底的圆管状，长方体或立方体的容器。
全文摘要
本发明涉及一种高通量提取生物样本中胡萝卜素的方法，以固定有振荡破碎管架的机械振荡器，提供振荡破碎动力，将生物样本、振荡破碎珠和有机溶剂装至振荡破碎管内，并将密封的振荡破碎管锁定于振荡器管架上，在一定的振荡转速或频率下，利用管内振荡破碎珠的碰撞摩擦及有机溶剂的渗透溶解，实现生物样本组织或细胞的研磨破碎以及胡萝卜素样本的溶解提取。与现有技术相比，本发明兼具处理样本通量大、过程简单、工作效率高、实验系统误差小，所需样品和溶剂少、劳动强度低、且隔绝溶剂挥发等优点。在工业微生物、动物和植物优良品种选育及工艺优化过程中，应用本发明可以有效的提高样品的处理通量和胡萝卜素提取效率。
文档编号G01N1/28GK102914462SQ20121047934
公开日2013年2月6日 申请日期2012年11月22日 优先权日2012年11月22日
发明者董宏伟, 徐大刚, 吴向阳, 蔡杨, 陈慧芳, 杨晔, 吴欣森, 李泓全, 童海宝 申请人:上海化工研究院
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