专利名称：白菜型油菜与甘蓝型油菜种间杂种鉴定的方法
技术领域：
本发明属于植物细胞学应用技术领域，具体涉及到鉴别白菜型油菜与甘蓝型油菜种间杂种的方法。
背景技术：
油菜是世界重要的油料作物，油菜发展，品种是关键，而远缘杂交育种鉴定是选育新品种的ー个重要途径，为提高远缘杂交育种真杂种育种的选择效率，及时、准确鉴别杂种Fl的真伪，具有重要意义。早期种间杂种鉴定常用的传统方法形态学标记鉴定，形态标记指作物特定的肉眼可见的且简单直观的外部特征或借助简单测试即可识别的某些性状。主要包括植物学性状、农艺性状和抗性等，形态学标记虽然简单直观，但它主要是靠田间观察、记载和測量，不仅费吋，而且标记数量少，持续时间长，检定周期长，易受外部环境条件、生育期等因素的影响。油菜形态性状复杂多祥，真假杂种难以区分，所以単独依靠形态学方法进行杂种研究还远远不能满足育种需要。随着细胞遗传学的诞生以及显微技术的改进，杂种鉴定过渡到了细胞学标记领域，由于油菜染色体较小、数目多，种属间材料稀少且差异大，从而増加了染色体制片难度，核型分析较难进行，很多研究仅停留在染色体数目变异方面。要制出全套染色体分散好、不丢失、清晰能记数目的片子，需要娴熟的染色体制片技巧，制片十分耗时，不适用于大量种间杂种真伪的鉴别。油菜染色体数量多传递行为复杂，变异幅度大，有时同一材料计数差别达十几条，而且常表现为非整倍体，因此鉴定结果也还不能令人十分信服。近年来国内外流行通过生化标记-同エ酶技术鉴定杂种Fl真伪，在油菜种间杂种鉴定上多集中于过氧化物酶(PO)和酯酶(AT)。虽然同エ酶技术用于血缘关系复杂的亲子关系真实性鉴定有简便、清晰、可靠、酶带易于分析判断等优点，但由于同エ酶是基因表达的直接产物，易受环境、栽培条件和植物生长阶段的影响，而且存在着基因位点数目少、多态性水平低等缺点。从而限制了同エ酶技术在油菜种间杂种鉴别直接利用。上世纪80年代起，分子标记(RFLP)技术被作为主要手段来鉴定杂种F1，分子标记直接以DNA的形式表现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否的问题；标记数量极多，遍及整个基因组，多态性高，自然存在着许多等位变异，有许多分子标记表现为共显性(codominance)能够鉴别出纯合基因型与杂合基因型，提供完整的遗传信息。但该技术存在难度大、耗时、成本高等缺点。因此,急需ー种实用于油菜种间杂种真伪鉴别的快速、准确、成本低的方法。据前人研究，叶片气孔保卫细胞长度与叶绿体数与染色体倍性呈正相关关系，刘成洪等(用气孔保卫细胞周长鉴定了甘蓝型油菜植物倍性水平.上海农业学报，2002，18
(3)35-38)測量了甘蓝型油菜品种(2n)和单倍体(n)植物叶片的气孔保卫细胞纵横经长度，采用了公式L= 1.57X [1.5 X (A+B)-々A + B]计算了保卫细胞周长。他们指出保卫细胞周长值可以作为鉴定甘蓝型油菜染色体倍性水平的指标，张菊平等在辣椒倍性鉴定方面也得到了相似的结论。叶片保卫细胞叶绿体计数法操作简便、结果准确、鉴定工作效率高，已有应用到马铃薯、烟草、花生、葡萄等作物的研究，也有将叶绿体数作为鉴定桑叶和枇杷等作物倍性分界指标的研究.但是至今未见利用叶片气孔保卫细胞周长及叶绿体数来鉴别油菜种间杂种真伪的报道。为了能够快速有效的鉴别油菜种间杂种真伪，加快油菜远缘杂交杂交育种进程，我们以种间杂种植株叶片为材料，研究了白菜型油菜、甘蓝型油菜与其杂种Fl保卫细胞周长，叶绿体数之间的相关性，进行了显著差异性分析，找到了亲本及Fl细胞周长及叶绿体数的分界域值，建立了将气孔保卫细胞周长及叶绿体数相结合快速鉴别种间杂种Fl真伪的技木，使假杂种尽早被剔除，解决了盲目种间杂种选择问题，节约了实验成本及时间，減少了人工及土地等费用，使油菜种间杂种大批量快速有效被鉴别，从而使远缘杂交技术体系在油菜遗传育种中得以有效应用
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足，提供ー种白菜型油菜与甘蓝型油菜种间杂种鉴定的方法。主要内容为測量确定亲本材料及种间杂种的叶片气孔保卫细胞周长，记数亲本及种间杂种的叶绿体数目，确定亲本及杂种的叶片气孔保卫细胞周长值范围与叶绿体数目范围，根据两个性状值的测量，计数结果，以其分界域值为參数建立了快速简便大批量鉴别白菜型油菜与甘蓝型油菜种间杂种真伪的有效方法。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为ー种白菜型油菜与甘蓝型油菜种间杂种鉴定的方法，其特征在于包括以下步骤( I) 1%碘-碘化钾染色液的配置；(2)在幼苗期采摘白菜型油菜、甘蓝型油菜以及白菜型油菜与甘蓝型油菜种间杂种Fl第4-7叶位处的平展叶片，装入塑料袋中，在5-10min内放入准备好的0° C以下冰盒中，带回，叶片经蒸馏水清洗后，置于通风橱中吹干叶片表面水分，用刀片切叶片下面部位，用镊子撕取下表皮气孔，放在载玻片上，使其平展开，滴I滴1%碘-碘化钾染色液，染色30 60秒，压片；(3)将步骤(2)制好的玻片在光学显微镜下用测微尺测出气孔保卫细胞横径A、纵径B值，并作以记录；同时观察计数叶表皮气孔保卫细胞内的叶绿体数；每张叶片观察14-16个气孔，以4-5张叶片的平均值作为该品种的保卫细胞叶绿体数值；(4)用椭圆模型近似公式L=I.57 X [1.5 X算出保卫细胞周长，式中L为保卫细胞周长，A为保卫细胞横径，B为保卫细胞纵径；(5)用气孔保卫细胞周长及叶绿体数量分界域值来判定种间杂种真伪以其亲本作为对照，若每片叶有10个以上气孔同时满足保卫细胞周长介于58. 90um 75. 83um,叶绿体个数为14 16个者，判定该植株为白菜型油菜与甘蓝型油菜种间杂种Fl。根据亲本及Fl叶片气孔保卫细胞的周长及叶绿体数的相关性，将气孔保卫细胞周长及叶绿体数相结合，通过亲本及种间杂种Fl气孔保卫细胞周长及叶绿体数的分界域值鉴定种间杂种。本发明的有益效果I.与传统的形态学鉴定相比，本发明明显提高了油菜种间杂种鉴定的准确度，在种间杂种选择时，使用本发明建立的气孔保卫细胞周长及叶绿体数相结合的方法，能够准确的把真杂种鉴别出来，尽早剔除掉假杂种，不需要太多的经验来判定，易操作掌控且不受环境、生育期等因素的影响。2.采用本发明建立的气孔保卫细胞周长及叶绿体数相结合的方法，约6min就可以完成一个植株鉴定，省吋，鉴定效率高。3.本发明建立的气孔保卫细胞周长及叶绿体数相结合的方法技术简便，易操作，不需要娴熟的制片技木，且成本低，比起染色体压片法，每10000株苗就要节约成本8373元。若采用细胞学染色体制片法，则需要相当熟练的制片技木。没有一定细胞学基础的エ作人员难以完成本项实验。
图I白菜型油菜气孔保卫细胞叶绿体数；图2白菜型油菜及甘蓝型油菜种间杂种Fl气孔保卫细胞叶绿体数；图3甘蓝型油菜气孔保卫细胞叶绿体数。
具体实施例方式以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例I :ー种白菜型油菜与甘蓝型油菜种间杂种鉴定的方法，其包括以下步骤(1)1%碘-碘化钾染色液的配置，称取Ig碘倒入小烧杯中，加80ml蒸馏水进行溶解后再加2g碘化钾；定容至IOOml备用；(2)在幼苗期采摘白菜型油菜陇油9号、甘蓝型油菜vision以及白菜型油菜陇油9号与甘蓝型油菜vision种间杂种Fl第6叶位处的平展叶片，装入塑料袋中，在5_10min内放入准备好的0° C以下冰盒中，带回，叶片经蒸馏水清洗后，置于通风橱中吹干叶片表面水分，用刀片切叶片下面部位，用镊子撕取下表皮气孔，放在载玻片上，使其平展开，滴I滴1%碘-碘化钾染色液，染色30 60秒,压片；(3)将步骤(2)制好的玻片在光学显微镜40倍物镜头下，用测微尺测出气孔保卫细胞横径A、纵径B值，并作以记录；同时观察计数叶表皮气孔保卫细胞内的叶绿体数；每张叶片观察15个气孔，由于叶绿体中的淀粉粒被染液染成蓝黑色，很容易被分辨出来；以5张叶片的平均值作为该品种的保卫细胞叶绿体数值；(4)用椭圆模型近似公式L=1.57X[1.5X(A+B)-Vj + 5]计算出保卫细胞周长，式中L为保卫细胞周长，A为保卫细胞横径，B为保卫细胞纵径；(5)用气孔保卫细胞周长及叶绿体数量分界域值来判定种间杂种真伪以其亲本陇油9号与vision作为对照，若每片叶有10个以上气孔同时满足保卫细胞周长介于58. 90um 75. 83um,叶绿体个数为14 16个者，判定该植株为白菜型油菜与甘蓝型油菜种间杂种Fl。将步骤(3)所得到的气孔保卫细胞周长及叶绿体数，通过T测验得亲本与杂种Fl有着显著差异，存在着明显的分界；即有70%以上的白菜型油菜陇油9号保卫细胞周长小于58. 90um,甘蓝型油菜vision保卫细胞周长大于75. 83um,白菜型油菜与甘蓝型油菜杂种Fl保卫细胞周长介于58. 90-75. 83um之间(见表I)；表I白菜型油菜陇油9号、甘蓝型油菜vision与陇油9号Xvision种间杂种Fl气孔保卫细胞周长值
权利要求
1.一种白菜型油菜与甘蓝型油菜种间杂种鉴定的方法，其特征在于包括以下步骤 (1)1%碘-碘化钾染色液的配置； (2)在幼苗期采摘白菜型油菜、甘蓝型油菜以及白菜型油菜与甘蓝型油菜种间杂种Fl第4-7叶位处的平展叶片，装入塑料袋中，在5-10min内放入准备好的0° C以下冰盒中，带回，叶片经蒸馏水清洗后，置于通风橱中吹干叶片表面水分，用刀片切叶片下面部位，用镊子撕取下表皮气孔，放在载玻片上，使其平展开，滴I滴1%碘-碘化钾染色液，染色30 60秒,压片； (3)将步骤(2)制好的玻片在光学显微镜下用测微尺测出气孔保卫细胞横径AJigB值，并作以记录；同时观察计数叶表皮气孔保卫细胞内的叶绿体数；每张叶片观察14-16个气孔，以4-5张叶片的平均值作为该品种的保卫细胞叶绿体数值； (4)用椭圆模型近似公式L=1.57X[1.5X(A+B)-义4+ 5]计算出保卫细胞周长，式中:L为保卫细胞周长，A为保卫细胞横径，B为保卫细胞纵径； (5)用气孔保卫细胞周长及叶绿体数量分界域值来判定种间杂种真伪以其亲本作为对照，若每片叶有10个以上气孔同时满足保卫细胞周长介于58. 90um 75. 83um,叶绿体个数为14 16个者，判定该植株为白菜型油菜与甘蓝型油菜种间杂种Fl。
全文摘要
本发明属于植物细胞学技术领域。一种鉴定白菜型油菜与甘蓝型油菜种间杂种的方法，其包括以下步骤在幼苗期，取植株第4-7片叶，撕取叶片下面部位的下表皮组织，用碘-碘化钾染液染色，在光学显微镜下观察气孔测量保卫细胞长轴及短轴值，再用椭圆模型计算出保卫细胞周长值，同时观察记数叶绿体数，每片叶观察并记录15个数据；以亲本作为对照，白菜型油菜气孔保卫细胞周长小于58.90um,叶绿体个数为9-11个，甘蓝型油菜气孔保卫细胞周长大于75.83um，叶绿体个数为19-20个；待鉴定材料测定10个以上气孔同时满足保卫细胞周长在58.90-75.83um范围内，且叶绿体数在14-16个则判定此植株为白菜型油菜与甘蓝型油菜种间杂种F1，否则为假杂种。
文档编号G01N21/85GK102768210SQ201210264178
公开日2012年11月7日 申请日期2012年7月28日 优先权日2012年7月28日
发明者何丽, 刘自刚, 孙万仓, 方彦, 曾秀存, 李学才, 武军艳, 赵彩霞 申请人:甘肃农业大学
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