专利名称：诊断阿尔茨海默病的成纤维细胞生长模式的制作方法
技术领域：
本发明涉及用成纤维细胞生长模式作为生物标记诊断阿尔茨海默病的方法。
背景技术：
阿尔茨海默病(AD)是表征为记忆和认知功能进行性下降的神经变性疾病。估计超过500万美国人患有此进行性和致命疾病。阿尔茨海默病破坏脑细胞，引起降低生活质量的失忆以及思考和行为的问题。AD没有已知的治愈方式，但治疗症状可改善数百万AD患者和其家庭的生活质量。AD的早期诊断给予病人作出最大化生命质量选择的时间，减少关于未知问题的焦虑，有更多时间规划未来，并提供更好的通过治疗获益的机会。需要高度灵敏和高度特异性测试来诊断阿尔茨海默病。本发明人第一次鉴定了独特的阿尔茨海默病特异性生物标记，用于以相较先前已知诊断测试的高度灵敏和高度特异性方式诊断阿尔茨海默病。具体地，本发明人鉴定成纤维细胞生长模式作为生物标记诊断阿尔茨海默病。因此，本文公开的独特阿尔茨海默病特异性生物标记是高度灵敏和特异性检测及诊断阿尔茨海默病的诊断方法的基础。本发明的独特阿尔茨海默病特异性生物标记也可用作脑网络的模型和用于筛选方法以鉴定可用作治疗和预防阿尔茨海默病的治疗剂的化合物。
发明内容
在某些优选实施方式中，本发明涉及用针对5种单独方法的试验诊断阿尔茨海默病的方法，所述方法在本文中称为(I)综合评分法；(2)每个聚合方法数量的平均聚合面积；(3)细胞迁移分析法；(4)分形分析法；和(5)空隙度分析法。在某些实施方式中，本发明涉及诊断人对象内阿尔茨海默病的方法，所述方法包括步骤(a)获得来自人对象的一个或多个细胞；(b)培养所述一个或多个细胞一段时间；(C)测定细胞聚集体的平均面积并将所述平均面积除以聚集体数量以获得每个聚集体数量的面积；(d)将步骤(C)的测定与用非阿尔茨海默病细胞所测每个聚集体数量的面积作比较；和(e)基于步骤(d)的比较诊断有或没有阿尔茨海默病。如果步骤(C)中所测每个聚集体数量的面积大于步骤(d)中所测每个聚集体数量的面积，则所述方法对阿尔茨海默病为阳性。在某些优选实施方式中，差异在统计学上显著。在优选实施方式中，用一种或多种额外诊断方法确认所述诊断。所述一种或多种额外诊断方法选自下组含有测定综合评分的方法、含有计算每个聚集体数量的面积的方法、含有细胞迁移分析的方法；含有分形分析的方法和含有空隙度分析的方法。
在优选实施方式中，本文所公开方法使用的细胞是成纤维细胞，尽管可使用其它细胞如血细胞或神经细胞。在某些实施方式中，已知的非阿尔茨海默病细胞是AC细胞。在某些实施方式中，所述细胞在蛋白混合物中培养。所述蛋白混合物可包括含层粘连蛋白、胶原、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、内动素/巢蛋白、和/或其组合的胞外基质制品。所述蛋白混合物还可包括生长因子。所述胞外基质蛋白可提取自肿瘤。在某些实施方式中，所述肿瘤是EHS小鼠肉瘤。在某些实施方式中，本发明涉及的方法包括(a)获得来自人对象的一个或多个细胞；(b)培养所述一个或多个细胞一段时间；(c)在所述时间段结束时获得所述细胞的图像；(d)测定所述图像上与细胞网络相关的分形维数；(e)将步骤(d)的测定与已知非阿尔茨海默病细胞相关的独立测定分形维数作比较。在某些实施方式中，如果步骤(d)所测分形维数在统计上显著低于与已知非阿尔茨海默病细胞相关的分形维数，则所述比较指示阿尔茨海默病。在优选实施方式中，用一种或多种额外诊断方法确认AD。所述一种或多种额外诊断方法选自下组含有测定综合评分的方法、含有计算每个聚集体数量的面积的方法、含有细胞迁移分析的方法；含有分形分析的方法和含有空隙度分析的方法。在某些实施方式中，用计盒法计算分形维数。在某些实施方式中，所述计盒法包括边缘检测过程。在某些实施方式中，所述对象与提供已知非阿尔茨海默病细胞的对照对象年龄匹配。在某些实施方式中，所述细胞培养时间段为约24小时或约36小时或约48小时。在某些实施方式中，所述细胞在蛋白混合物中培养。所述蛋白混合物可包括含层粘连蛋白、胶原、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、内动素/巢蛋白、和/或其组合的胞外基质制品。所述蛋白混合物还可包括生长因子。所述胞外基质蛋白可提取自肿瘤。在某些实施方式中，所述肿瘤是EHS小鼠肉瘤。在某些实施方式中，本发明涉及的方法包括(a)测定来自人对象的成纤维细胞网络图像的分形维数；(b)测定来自已知非阿尔茨海默病细胞的成纤维细胞网络图像的分形维数；(C)将步骤(a)和(b)的测定作比较。在某些实施方式中，如果步骤(a)所测分形维数在统计上显著低于步骤(b)所测分形维数，则所述诊断指示阿尔茨海默病。在某些实施方式中，所述对象与提供所述已知非阿尔茨海默病细胞的对照对象年龄匹配。在某些实施方式中，本发明涉及诊断人对象中阿尔茨海默病的方法，所述方法包括(a)计算所述对象成纤维细胞网络图像的分形维数；(b)比较步骤(a)的计算与已知非阿尔茨海默病细胞相关的独立测定分形维数；其中如果步骤(a)计算的分形维数在统计上显著低于已知非阿尔茨海默病细胞相关的分形维数，所述对象的阿尔茨海默病诊断为阳性。在某些实施方式中，所述对象与提供所述已知非阿尔茨海默病细胞的对照对象年龄匹配。在某些实施方式中，本发明涉及诊断人对象中阿尔茨海默病的方法，所述方法包、括(a)用手术刀片获取所述对象外周皮肤成纤维细胞样品；(b)用培养箱孵育所述样品一段时间；(C)用成像仪在所述时间段结束时获取所述样品图像；(d)用电脑计算所述图像上与成纤维细胞网络相关的分形维数；(e)将步骤(d)的计算与已知非阿尔茨海默病细胞相关的独立测定分形维数作比较，其中如果步骤(d)计算的分形维数在统计上显著低于与已知非阿尔茨海默病细胞相关的分形维数，则所述对象的阿尔茨海默病诊断为阳性。在某些实施方式中，所述细胞在蛋白混合物中培养。所述蛋白混合物可包括含层粘连蛋白、胶原、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、内动素/巢蛋白、和/或其组合的胞外基质制品。所述蛋白混合物还可包括生长因子。所述胞外基质蛋白可提取自肿瘤。在某些实施方式中，所述肿瘤是EHS小鼠肉瘤。在某些实施方式中，本发明涉及诊断人对象中阿尔茨海默病的方法，所述方法包括(a)用手术刀片获取所述对象外周皮肤成纤维细胞样品；(b)用培养箱孵育所述样品一段时间；(C)用成像仪在所述时间段结束时获取所述样品图像；(d)用电脑计算所述图像上与成纤维细胞网络相关的分形维数；(e)用电脑将步骤(d)的分形维数输入具有分形维数数据的数据库，所述分形维数数据由自获自各个年龄的对照对象的非阿尔茨海默病细胞生 成；(f)通过比较步骤(d)所计算的分形维数与所述数据库数据，用电脑诊断所述对象。在某些实施方式中，所述样品在胶状蛋白混合物中孵育。在某些实施方式中，所述细胞在胶状蛋白混合物中培养或孵育。所述蛋白混合物可包括含层粘连蛋白、胶原、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、内动素/巢蛋白、和/或其组合的胞外基质制品。所述蛋白混合物还可包括生长因子。所述胞外基质蛋白可提取自肿瘤。在某些实施方式中，所述肿瘤是EHS小鼠肉瘤。在某些实施方式中，本发明涉及具有分形维数数据的数据库的计算机可读介质，所述分形维数数据由获自各个年龄的对照对象的非阿尔茨海默病细胞生成，所述介质含有以下指令(a)计算图像的分形维数；(b)比较所述分形维数与所述数据库的分形维数数据；和(C)基于步骤(b)的比较输出诊断。在某些实施方式中，本发明涉及的方法包括(a)培养人对象的皮肤细胞一段时间；(b)检测与所述细胞的成纤维细胞网络相关的细胞形态学特征；(c)进行涉及所述细胞形态学特征的计算；和(d)将步骤(c)的计算与已知非阿尔茨海默病细胞相关的独立测定参数作比较。在某些实施方式中，所述细胞形态学特征选自下组成纤维细胞团(或聚集体)的数量、成纤维细胞团(或聚集体)的大小、成纤维细胞团(或聚集体)的生长、和其组合。在某些实施方式中，所述细胞形态学特征是有或没有大团(或聚集体)、有或没有附于团(或聚集体)的细胞、有或没有大团(或聚集体)生长、团(或聚集体)数量、有或没有来自先前形成的所述团(或聚集体)网络的剩余边缘、细胞迁移数量、有或没有渗流附近的细胞。在某些实施方式中，步骤(C)的计算包括将离散值分配给各所述细胞形态学特征并对所述值求和。在某些实施方式中，采用所述和诊断AD或没有AD。在某些实施方式中，所述细胞在蛋白混合物中孵育。所述蛋白混合物可包括含层粘连蛋白、胶原、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、内动素/巢蛋白、和/或其组合的胞外基质制品。所述蛋白混合物还可包括生长因子。所述胞外基质蛋白可提取自肿瘤。在某些实施方式中，所述肿瘤是EHS小鼠肉瘤。在某些实施方式中，本发明涉及诊断对象中阿尔茨海默病的方法，所述方法包括(a)获取所述对象的一个或多个细胞并在组织培养基中培养所述一个或多个细胞；(b)测量一段时间的所述一个或多个细胞的分形维数；(C)对所述分形维数随着时间变化作图以获得分形维数曲线；(d)比较所述分形维数曲线与获自非阿尔茨海默病细胞和非阿尔茨海默病痴呆(非ADD)细胞的分形维数曲线；和(e)诊断所述对象中有或没有阿尔茨海默病。在某些实施方式中，如果获自所述对象的一个或多个细胞测得的所述分形维数曲线在统计上显著不同于获自非阿尔茨海默病细胞和所述非ADD细胞的分形维数曲线，则所述对象的阿尔茨海默病诊断为阳性。在某些实施方式中，获自所述对象的所述一个或多个细胞是成纤维细胞。在优选实施方式中，用一种或多种额外诊断方法确认诊断。所述一种或多种额外 诊断方法选自下组含有测定综合评分的方法、含有计算每个聚集体数量的面积的方法、含有细胞迁移分析的方法；含有分形分析的方法和含有空隙度分析的方法。在某些实施方式中，本发明涉及诊断对象中阿尔茨海默病的方法，所述方法包括(a)获取所述对象的一个或多个细胞并在组织培养基中培养所述一个或多个细胞；(b)基于所述培养细胞的一种或多种特征测定综合评分；(C)比较所述综合评分与非阿尔茨海默病细胞所测综合评分；(d)诊断所述对象中有或没有阿尔茨海默病。在某些实施方式中，用于计算所述综合评分的所述特征选自下组聚集体的大小、细胞与聚集体的结合、聚集体生长的迹象、聚集体的数量、网络内的边缘、细胞迁移迹象和接近渗滤界限(或细胞密度)。在优选实施方式中，用一种或多种额外诊断方法确认诊断。所述一种或多种额外诊断方法选自下组含有测定综合评分的方法、含有计算每个聚集体数量的面积的方法、含有细胞迁移分析的方法；含有分形分析的方法和含有空隙度分析的方法。在某些实施方式中，本发明涉及诊断对象中阿尔茨海默病的方法，所述方法包括(a)获取所述对象的一个或多个细胞并在组织培养基中培养所述一个或多个细胞；(b)测定迁移细胞数量；(C)比较所述迁移细胞数量与非阿尔茨海默病细胞的迁移细胞数量；(d)诊断所述对象中有或没有阿尔茨海默病。在某些实施方式中，如果获自所述对象的迁移细胞数量在统计上显著小于迁移的非阿尔茨海默病细胞数量，则AD诊断为阳性。在某些实施方式中，所述细胞是成纤维细胞。在优选实施方式中，用一种或多种额外诊断方法确认诊断。所述一种或多种额外诊断方法选自下组含有测定综合评分的方法、含有计算每个聚集体数量的面积的方法、含有细胞迁移分析的方法；含有分形分析的方法和含有空隙度分析的方法。在某些实施方式中，本发明涉及诊断对象中阿尔茨海默病的方法，所述方法包括(a)获取所述对象的一个或多个细胞并在组织培养基中培养所述一个或多个细胞；(b)测定所述细胞空隙度；(C)比较所述细胞的空隙度与非阿尔茨海默病细胞的空隙度；(d)诊断所述对象中有或没有阿尔茨海默病。在某些实施方式中，如果获自所述对象的细胞空隙度在统计上显著高于非阿尔茨海默病细胞的空隙度，则AD诊断为阳性。在优选实施方式中，用一种或多种额外诊断方法确认诊断。所述一种或多种额外诊断方法选自下组含有测定综合评分的方法、含有计算每个聚集体数量的面积的方法、含有细胞迁移分析的方法；含有分形分析的方法和含有空隙度分析的方法。在某些实施方式中，所述细胞是成纤维细胞。在某些实施方式中，本发明涉及用于开发治疗或预防阿尔茨海默病的一种或多种药物候选物的先导化合物筛选方法，所述方法包括步骤(a)在细胞培养基中培养一个或多个AD细胞；(b)将所述AD细胞与化合物接触；(c)测定所述AD细胞的一种或多种特征是否改变为与未接触所述化合物的非阿尔茨海默病细胞的特征类似。在某些实施方式中，所述细胞是成纤维细胞。
在某些实施方式中，所述细胞特征是分形维数或综合评分或每个聚集体数量的平均聚合面积、或细胞迁移、或空隙度。在某些实施方式中，本发明涉及测定对象中阿尔茨海默病持续时间的方法，所述方法包括(a)获取所述对象的一个或多个细胞；(b)测量已知AD细胞系的细胞迁移特征或每个聚集体数量的平均面积；(C)用步骤(b)所获数据制成标准曲线；测量步骤(a)所获细胞的迁移特征或每个聚集体数量的平均面积和(d)测定所述对象中AD病持续时间。在某些实施方式中，所述细胞是成纤维细胞。在某些实施方式中，鉴定有10、9、8、7、6、5、4、3、2或I年或更短时间AD的对象鉴定为对AD治疗的响应性增加。在某些实施方式中，本发明涉及区分对象存在阿尔茨海默病(AD)和非阿尔茨海默病痴呆(非ADD)的方法，所述方法包括(a)获取对象的一个或多个细胞；(b)测量所述一个或多个细胞一段时间的分形维数；(C)对所述分形维数随着时间变化作图以获得分形维数曲线；(d)比较所述分形维数曲线与获自已知非阿尔茨海默病细胞、已知非阿尔茨海默病痴呆(非ADD)细胞和已知AD细胞的分形维数曲线；和(e)区分所述对象中的AD和非ADD。在某些实施方式中，所述细胞是成纤维细胞。在某些实施方式中，本发明涉及区分对象存在阿尔茨海默病和非阿尔茨海默病痴呆的方法，所述方法包括(a)获取对象的一个或多个细胞；(b)获取所述对象的一个或多个细胞并在组织培养基中培养所述一个或多个细胞；(C)测定迁移细胞数量；(d)比较所述迁移细胞数量与已知非阿尔茨海默病细胞、已知AD细胞和已知非ADD细胞的迁移细胞数量；(e)区分所述对象中的AD和非ADD。在某些实施方式中，所述细胞是成纤维细胞。在某些实施方式中，本发明提供诊断人对象中阿尔茨海默病的方法，所述方法包括(a)计算所述对象成纤维细胞网络图像的分形维数；(b)比较步骤(a)的计算与已知非阿尔茨海默病细胞相关的独立测定分形维数；其中如果步骤(a)计算的分形维数在统计上显著低于已知非阿尔茨海默病细胞相关的分形维数，则诊断为阳性，否则所述诊断为阴性；和(C)诊断。附图简要说明图I :成纤维细胞的初始制备
图2 :综合评分方案图3 :分形分析方案图4 :综合评分法。代表接种后48小时的皮肤细胞成纤维细胞的8种特征加和的总分(AC =年龄匹配对照AD =阿尔茨海默病^ADD =非阿尔茨海默病如帕金森病(PD)和亨廷顿氏病(HD)痴呆)。图5A和5B :阿尔茨海默病成纤维细胞(A)和正常对照(B)的聚集体示例。通过跨聚集体拟合椭圆以μ m2测量面积并在IOx图像上手动计数所述聚集体。跨各聚集体拟合椭圆，从而聚集体边缘在椭圆内。在所有图像中统一使用相同过程。图6 48小时的成纤维细胞。31个细胞系的每个聚集体数量的平均面积年龄匹配 对照(Να。= 10)，阿尔茨海默病(Nad = 2)，和非阿尔茨海默病(N#add = 9)如帕金森病(PD)和亨廷顿氏病(HD)。误差柱代表均值的标准误差。图7 :结果的可重复性。4个重复细胞系的每个聚集体数量的平均面积。对于同一细胞系，实验至少间隔I个月。细胞的初始数量在10%内。图8A和8B :红点标记的自由迁移细胞示例。接种后48小时的成纤维细胞，左图(图8A)阿尔茨海默病(AD)和右图(图SB)非阿尔茨海默氏痴呆(非ADD ;亨廷顿氏病)。图9 :迁移率相比迁移细胞数量。绿色正方形-阿尔茨海默病Oiad = 10)，蓝色三角形-非阿尔茨海默氏痴呆(η = 7)，和红色圆圈-年龄匹配对照(％。= 9)。蓝线是分离阈值。
图10 :迁移率乘以迁移细胞数量。绿色正方形-阿尔茨海默病Oiad =10)，蓝色三角形-非阿尔茨海默氏痴呆(ηφΑΙ)Ι) = 7)，和红色圆圈-年龄匹配对照(nAC = 9)。图IlA和IlB :分形分析。图IlA :分形曲线和恢复区域线性拟合的示例。图IlB :显示分形曲线的斜率与截距的群体数据(N = 31 ；Nac = 10 ；Nad = 12 ；N#add = 9)。图12:空隙度分析。图12A:空隙度曲线示例。图12B :显示平均空隙度的群体数据(N = 8 ；Nac = I ；Nad = 4 ;N非細=3)。图13 :12孔板中基质胶厚度和体积间的比例关系。基质胶体积范围为400-800 μ I时，基质胶层的厚度范围为I. 04-2. 08mm。图14:分形维数和空隙度对基质胶初始体积的灵敏度。相较大体积的600 μ I (蓝)、700 μ I (粉红)和800 μ I (蓝绿)基质胶，分形维数(图14Α)和空隙度(图14Β)对小体积的400 μ I (红)和500 μ I (绿)基质胶有性质不同的趋势。对于大体积(>600 μ I)，加入更多基质胶，对分形维数(图14Α)和空隙度(图14Β)的效果越大。为了参考，所有前面的实验使用700 μ I基质胶。图15Α和15Β 48小时的AD聚集体对基质胶初始体积的灵敏度。图15Α 48小时和79小时的每个聚集体数量的面积相比基质胶的初始体积。图15Β :随着基质胶初始体积变化的面积/数量变化率。图描述(I)使用700 μ I基质胶的重要性，其中曲线显示峰且效果最大。(2)在此40-80小时的时间窗内，阿尔茨海默病聚集体大小增加且数量减少。这在A图中通过显示48小时和79小时的2个不同时间点的每个数量的聚合面积来描述。绿色曲线高于红色曲线，表明面积增长和/或数量减少。在实验上都观察到。B图显示48小时-79小时间此测量面积/#的变化率。换言之，取来自A图的曲线，减去它们并除以时间间隔。AD成纤维细胞在40小时后不能迁离聚集体。因此，对于此时间窗内的AD细胞，聚集体生长得更大。对于对照情况AC，没有观察到这种现象且细胞能迁离聚集体。图16 :描述孵育24小时后的年龄匹配对照(AC)成纤维细胞网络。图17 :描述孵育24小时后的阿尔茨海默病(AD)患者成纤维细胞网络。图18 :描述AC和AD对象的分形维数与时间的图。图19 :描述孵育24小时后AD与AC网络的分形维数的图。图20A和20B :图20A AD成纤维细胞细胞系。图显示疾病持续期间每个聚集体数量的平均聚合面积线性增加。换言之，疾病持续时间与(平均聚合面积)/(聚集体数量)之间存在直接关联。各正方形旁边的数字是测试的细胞系数。图20B :AD成纤维细胞细胞系。疾病持续时间和迁移细胞数量的线性关联。各正方形旁边的数字是测试细胞系数。使用这些关联，能鉴定早期、中期或晚期阿尔茨海默病患者。处于疾病较早期的患者对治疗的响应性增加。了解患者患有阿尔茨海默病多久有助于引导治疗目标和用于基于患者的治疗 方案的策略。发明详述缩写AC :年龄匹配对照；AD :阿尔茨海默病-MC :平均细胞数量；DC :细胞密度；DMEM :达尔伯克改良伊格尔培养基；EtOH :乙醇；FBS :胎牛血清；非ADD :非阿尔茨海默氏痴呆；RM :室温。如本文所用，“空隙度”指分形如何填充空间的量度。其用于进一步分类分形和结构，虽然它们可共有同一分形维数时，但所述结构的视觉呈现很不同。密集分形的空隙度低。随着分形粗度增加，空隙度也增加；直观上来自空隙意义“缺口更多缺r, , Eiir) -r))2
1.1I SS卿》w細软獅《挪咖雄撕^處》--------------..........Λ/ / \ ^在某些实施方式中，本发明涉及用外周皮肤成纤维细胞诊断阿尔茨海默病(AD)的方法。在发明的各种实施方式中，采用成纤维细胞的定量、定性和/或半定量方面来测定有或没有AD。在一个实施方式中，所述方法包括用分形维数检测定量人皮肤成纤维细胞网络的复杂度。在另一实施方式中，所述方法包括基于人皮肤细胞成纤维细胞特征加和来计算总分。在另一实施方式中，所述方法包括计算每个皮肤细胞成纤维细胞团数量的面积。所述方法可从非AD痴呆、年龄匹配对照(AC)病例中早期筛选AD患者。描述了用外周皮肤成纤维细胞诊断阿尔茨海默病(AD)的方法。此方法定量人皮肤成纤维细胞生长模式的复杂度，测量在专用基底(基质胶)上的网络形成、聚集、交流、动态移动以及成纤维细胞聚集体形态。基质胶提取自富含胞外基质(ECM)蛋白的小鼠肉瘤。其由层粘连蛋白组成，然后是胶原IV、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和内动素I。基质胶在37°C聚合以生成类似哺乳动物细胞基底膜的生物活性基质材料。发现BD基质胶低生长因子(BD Matrigel Matrix GrowthFactor) (GFR)特别适于需要更高度界定的凝胶基质的基底膜制剂的应用。描述了 5种诊断检测方法I.方法I :综合评分2.方法2 :每个聚集体数量的平均聚合面积3.方法3:细胞迁移分析
4.方法4:分形分析5.方法5:空隙度分析可开发成纤维细胞生长模式的其他检测以在诊断上区分取自活检的阿尔茨海默病(AD)、非阿尔茨海默氏痴呆(非ADD)和年龄匹配对照(AC)细胞。通过加入胞外基质改性剂来改善诊断功效。方法I-综合评分在此研究中，培养1-2小时内的皮肤成纤维细胞在基质胶上关联形成可测网络。此情况提供生理相关环境以研究细胞形态、细胞生化功能、细胞移动或侵入、和基因表达。I天后，这些网络退化且边缘缩回以留下可测聚集体。
接种于基质胶上48小时后，采用8种参数分开AD成纤维细胞和年龄匹配对照(AC)与非阿尔茨海默氏痴呆(非ADD)I.存在大聚集体。2.细胞结合聚集体。3.聚集体生长迹象。4.聚集体数量小(在IOx图像上< 10)。5.聚集体数量大(在IOx图像上〉10)。6.网络内的可检测边缘。7.细胞迁移迹象。8.接近渗滤界限(细胞形成连续流)。根据这8种参数，如下引入定量分数I.上面前4种参数特异于阿尔茨海默病(AD)，若存在则各分数为“-I”且若没有则为“O”。2.后4种参数特异于非AD和AC，若存在则分数为“+I”且若没有则为“O”。3.总分计算为所有8个值加和。如果总分为正或零，则细胞是AC或非ADD。如果总分为负，则细胞是AD。图4给出接种后48小时代表皮肤细胞成纤维细胞的8种特征加和的总分。方法2-每个聚集体数量的面积8种参数中的2个表示为每个聚集体数量的测量面积，AD的该值显著高于AC和非ADD (诊断准确率96%，N = 31 Oiad= 12，nAC= 10，和η非細=9)对于AD 与 AC，ρ< O. 000001,和对于 AD 与非 ADD, P < O. 00001)。AD细胞显示大的分离聚集体，迁移少或没有(图5A)。正常对照和非ADD成纤维细胞显示大量较小团块和聚集体间的高水平迁移(图5B)。方法3-细胞迁移不同于综合评分法，细胞迁移法能区分AD、AC和非ADD细胞。参见图9和10。计数自由迁移细胞，在48小时为Ni，约7小时后为N2，迁移率计算为R= (N2-N1)/AT，其中AT是计数间的时间间隔。自由迁移细胞是不附于聚集体的细胞，如图8的红点所示。群体数据(图9、10)显示阿尔茨海默病成纤维细胞(AD-绿色正方形)和非阿尔茨海默氏痴呆成纤维细胞(非ADD-蓝色三角形)的迁移细胞数和迁移率显著低于年龄匹配的对照成纤维细胞(AC红色圆圈)。阿尔茨海默病成纤维细胞(绿色正方形)显示最小迁移细胞数和最低迁移率，而年龄匹配对照(红色圆圈)显示最大迁移细胞数和最高迁移率。有趣的是非ADD细胞与AD和AC (图5和6)分开(有I个例外)。从迁移角度，非阿尔茨海默氏痴呆成纤维细胞与阿尔茨海默病成纤维细胞良好分离。方法4-分形分析不同于综合评分法，分形分析法能区分AD、AC和非ADD细胞(p < O. 01)。参见图11B。分形分析法利用分形维数所测的网络复杂度。取自阿尔茨海默病患者的细胞(优选是成纤维细胞)在组织培养中生长时，分形维数在统计上显著低于AC细胞。相较AC和非ADD成纤维细胞，就取自AD的成纤维细胞而言由此物理参数测得的网络复杂度也显著不 同。网络退化后( 48小时)，细胞迁移并在数天内达到融合。通过分形维数的线性增加捕获此恢复(图11A)。示踪分形维数与时间的函数的各曲线的斜率相比截距在AC、AD和非ADD 3个组中显著不同(96%准确率，n = 31(^ = 12，NAC = 10，N非細=9);对于AD与AC，P < O. 0001，和对于AD与非ADD，p < 0.00001)。不同于第一种方法，第二种方法区分AC 和非 ADD (P < O. 01)(图 11B)。方法5-空隙度分析空隙度分析法定量成纤维细胞模式的缺口且是用作第二区分水平的复杂度互补测量。相较AC和非ADD成纤维细胞，就取自AD的成纤维细胞而言，成纤维细胞的平均空隙度也更高。网络退化最大即仅分离聚集体可见时，通�？障抖仍黾忧掖锏椒逯�(图12A)。随着网络再生开始，空隙度下降。这些复杂度动力学的测量提供了用最小侵入性过程诊断AD患者的新可能。所述方法的简单性和低成本可用于筛选AD患者。类似AD脑中神经网络的人皮肤成纤维细胞网络显示复杂度减少，如分形维数所测。人皮肤成纤维细胞网络提供用于准确AD诊断和药物筛选的脑网络模型。阿尔茨海默病成纤维细胞的受损垂直迁移对于AD细胞系，将相同数量的成纤维细胞(50个细胞/mm3)接种于12孔板上从400 μ I增至800 μ I体积的基质胶，一次增加100 μ I。基质胶体积V增加使基质胶层厚度h的成比例增加，根据关系式V = O r2)h,其中r = 11. 05mm(图13)。随着基质胶层厚度增加，从顶部表面到底部表面的垂直细胞迁移变得更难。该迁移困难在此通过分形维数、空隙度和数量来定量(图14)。约24小时后，网络退化并留下聚集体。在此我们显示每个数量的面积对基质胶初始体积的依赖性(图12)。对于400和500 μ I的小体积基质胶，没有聚集体，而对于>500 μ I的较大体积基质胶，聚集体面积除以其数量的曲线在700 μ I达到峰值。对于很有限数量的阿尔茨海默病病例，面积除以聚集体数量接近阈值(参见图6)且稍后时间的聚集体测量有助于更好分开这些病例。79小时后，这些聚集体大小增加且数量减少，从而面积/数量比更进一步增加(图15Α中的绿色曲线)。对于48和79小时，700 μ I初始体积的效果最优。图3Β的面积/数量变化率也是有峰值的曲线，加强了最优初始基质胶体积为700 μ I的观点。
在上述实验中，我们使用含10%胎牛血清(FBS)和I %青霉素/链霉素(PS)的1.5ml达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)。血清饥饿会对所示检测有进一步的主要干扰。分形维数法在一个实施方式中，在可以是数字图像的原始图像经边缘检测法过滤后，使用标准计盒法计算分形维数，所述边缘检测法采用例如二者高斯差。可基于培养的人皮肤成纤维细胞的定量图像分析来诊断AD。在一个实施方式中，通过打孔活检取样。一般可使用手术刀片。群体数据显示AC病例的分形维数显著高于AD病例。人皮肤成纤维细胞网络AD病例的复杂度降低提供了与AC和非AD痴呆病例的区分。本发明可用其他图像处理过程来取代盒计数或线检测。
所述方法的简单性和低成本有助于在采取其他复杂和昂贵技术前筛选AD患者。类似AD脑中神经网络的人皮肤成纤维细胞网络显示复杂度减少，如分形维数所测。在一个实施方式中，人皮肤成纤维细胞网络可以是用于新药物筛选的脑网络模型。图16描述24小时孵育后年龄匹配对照(AC)的成纤维细胞网络。在一个实施方式中，拍摄所述网络的数字图像。图17描述24小时孵育后阿尔茨海默病(AD)患者的成纤维细胞网络。在一个实施方式中，拍摄所述网络的数字图像。图18描述AC和AD对象相比时间的分形维数。针对2个细胞系的分形维数测得的细胞网络动力学显示AC的分形维数高于AD。孵育约数小时后，可注意到显著的分离。图19描述24小时孵育后，AD相比AC网络的分形维数的散布图。分形一般是可分成几部分的大体或片段化几何形状，各部分为(至少约为)整体的小尺寸副本，此性质称为“自相似”。目标(分形)不需在所有尺度展示完全相同的结构，但同一“类型”的结构必须出现在所有尺度上。人皮肤成纤维细胞网络是天然产生的分形示例。考虑线。如果所述线再对半分，采用这些一半部分中的2个重现初始线。如果所述线再分成4个部分，采用其中4个覆盖所述线。一般，考虑到线段长度“S”，覆盖初始线的区段数量由N(S) = (Ι/s)1给出。考虑正方形。如果所述正方形再分成各有一半边长的较小正方形，则用这些较小正方形中的4个(22 = 4)形成初始正方形。如果所述正方形再分成各有四分之一边长的较小正方形，则用其中16个(24= 16)形成初始正方形。如上，我们可以写出各部分数量的表达式，我们需要大小“s”来覆盖初始正方形，为N(S) = (Ι/s)2。对于正方体，结果为N(S)=(l/s)3o上面示例中的指数1、2和3分别是线、正方形和正方体的维数。这可概括为N(S)=(l/s)D，这里D是维数，如上所述为整数，但其不必须是。如果我们对两边都取对数，则有log(N(s)) =D log(l/s),换言之我们可通过log(N(s))相对log(l/s)作图来估计维数，所述图的斜率(D)是维数。如果斜率是非整数，则所述目标为分形，且维数是分数(分形)维数。复杂度是研究生物和非生物如何作为系统自身构成模式并相互作用。复杂度涉及众多学科且包括从生物学到物理学的广阔分类领域的科学家。人皮肤成纤维细胞网络的复杂度可通过计算其分形维数来定量。在一个实施方式中，边缘检测用于本发明。边缘检测是用于图像处理领域具体是特征检测和特征抽取领域以表示算法的术语，所述算法旨在鉴定数字图像中例如图像亮度大幅改变或有其他不连续的点。而在图像形成模型的一般假设下，显示图像亮度的不连续性可能对应于一种或多种的深度不连续、表面方向不连续、材料性质变化和景物照度变化。理想情况下，将边缘检测器应用于图像的结果可产生一组指示目标边界、表面标记边界的相关曲线以及对应于表面方向不连续性的曲线。因此，将边缘检测器应用于图像可显著减少待处理数据量并因而可过滤视作不太相关的信息，而保留图像的重要结构性质。如果边缘检测器步骤成功，解释初始图像中信息内容的后续任务可因此显著简化。有许多边缘检测的方法，但其中大部分可分成2类-基于搜索和基于零交叉。基于搜索的方法检测边缘是通过首先计算边缘强度的量度，通常是一阶导数表达式如梯度值，然后用计算估计的局部边缘方向，通常是梯度方向搜索梯度值的局部定向最大值。基于零交叉的方法搜索计算自图像的二阶导数表达式中的零交叉以发现边缘，通常是拉普拉斯算子的零交叉或非线性微分表达式的零交叉。作为边缘检测的预处理步骤，可应用平滑段，例 如高斯平滑。在其他实施方式中，可采用噪音过滤算法。已发表的边缘检测法的主要差异在于应用的平滑滤波器类型和计算边缘强度量度的方式。由于许多边缘检测法依赖于计算图像梯度，它们用于计算X和y方向梯度估值的滤波器类型也不同。在一个实施方式中，所述方法使用计盒法。图像用盒覆盖，例如通过计算机。目标是发现在所述盒尺寸情况下覆盖图像变化所需的盒数量。如果物体是I维的如线，我们预期如上所述N(S) = (Ι/s)1。对于更高维数也如此。这种方法可用样品的数字图像在计算机完成。在一个实施方式中，数据库可由各个年龄的许多不同非阿尔茨海默病对照(AC)对象构成。可制成所述数据库，从而测试的人对象可相比年龄匹配的AC数据进行评估。在一个实施方式中，所述成纤维细胞网络的复杂度通过检测分形维数和空隙度曲线来定量。取自AD的成纤维细胞相较AC和非ADD成纤维细胞而言，由这些物理参数检测的所述网络复杂度也显著不同。网络退化后，例如约48小时后，细胞迁移并在数天内达到融合。在一个实施方式中，通过分形维数的线性增加捕获此恢复。各曲线的斜率相比截距示踪随着时间变化的分形维数，其在AC、AD和非ADD 3个组中显著不同(100%准确率，η = 26 (AD = 10，AC 10，非 ADD = 6);对于 AD 与 AC，p < O. 0001，和对于 AD 与非 ADD，p
<O. 00001)。此方法显示AC和非ADD之间可区分的差异(p < O. 01)。利用细胞形态学特征的方法培养后短时间内，例如I小时内，形成可测网络。在一个实施方式中，培养在胶状蛋白混合物中发生，所述混合物提供可行环境用以研究细胞形态学。一段时间后，例如约I天后，这些网络退化且边缘缩回以留下可测“团”或聚集体。用本发明的任何方法，通过获得细胞或样品并培养或孵育所述细胞或样品一段时间，可制备图像。在一个实施方式中，所述时间段为约48小时或其任何一小时增量细分。所述时间段内，所述细胞或样品成纤维细胞网络改变。然后获取图像。可从图像中收集定量、定性和半定量信息。在一个实施方式中，所述图像的某些特征可以是分配值。例如，通过检测图像，可确定下列非详尽和非限制性特征且可为任选的分配值(1)有没有大团？(2)细胞是否附于团？(3)所述大团是否生长？(4)有没有少数团块？例如在IOx图像上少于或等于5个？(5)有没有多个团(例如在IOx图像上大于5个)？(6)有没有来自先前所形成网络(例如在基质胶中)的剩余边缘？(7)有没有许多细胞迁移？(8)细胞是否临近渗滤(即从图像的左右或上下形成显著连续流的细胞)？在一些实施方式中，仅可考虑这些特征的部分列表。8种参数中的2个表示为每个聚集体数量的所测面积比例。AD的此比例显著高于年龄匹配对照(AC)、非阿尔茨海默氏变性(非 ADD)(诊断准确率 96%，N = 30 (AD = 12，AC = 10，和非 ADD = 8)，对于 AD 与 AC，p
<O. 000001，和对于AD与非ADD，p < O. 00001)。任何或甚至所有这些特征可手工或经相关领域已知的图像处理方法确定。在一个实施方式中，“特征”例如8种参数(或其亚集或特征增强组)是分配值。所述值可根据关联性研究分配，例如根据与AD细胞的关联或者与AC或非ADD细胞的关联。 在一个实施方式中，上述特征(1)-(4)与AD成纤维细胞相关联，然后例如若存在则分配值 为-1，或者若缺失则为O。仅通过举例方式给出实际值，因为也可分配其他值。在一个实施方式中，上述特征(5)-(8)与AC和非ADD成纤维细胞关联。帕金森病(PD)和亨廷顿氏病(HD)是非ADD细胞的非限制性示例。若存在则特征(5)-(8)的分配值为+1，或者若缺失则为O。在一个实施方式中,可对各团的分配值求和。然后可对求和值作图，如图4所不。在另一实施方式中，可根据所测特征的“强度”将中间值分配给特征值。例如，特征⑴“有没有大团？”可分配-1(用于很大的团)-0(用于很小的团)的任何中间值。例如，-O. 9的值可分配给相对“大”团，-O. 8的值分配给略小(但仍然“大”)的团，等等。任何上述特征(或其他)的刻度标可通过常规实验配置。在一个实施方式中，所述方法可以用图像处理技术全自动化，此外所有(或也许仅一些)的特征可在全刻度即数字基础上定量。如图4所述，如图5A所示的AD细胞相较AC细胞和非ADD细胞特征性展示大的分离团，且迁移很少或没有。因此，AD细胞通常有相对较低数总和的值，在此方案中常为负数。如图5B所示的正常对照和非ADD成纤维细胞显示许多较小团块和团块间的高水平迁移。因此，AC细胞和非ADD细胞通常有相对较高数总和的值，在此方案中常为正数。上述方法提供诊断AD的另一方式。利用面积的方法在另一实施方式中，计算团块面积。例如，计算图5B所示(AC细胞)团块面积。这可用任何合适方法完成，例如但不限于通过跨团块拟合椭圆。然后可计数图像上的团块。计数以及面积计算可手工完成或可自动化如通过相关领域已知的图像处理技术。图5B所示数字代表以平方微米μ 2计的团块面积。类似地，可计算图5Α所示的AD细胞面积。例如，图5Α所示面积为12，670 μ 2，面积远大于图5Β所示AC细胞的相关面积。每个团块数量的面积可如图7所示作图。图7是每个团块数量的面积的对数图，如上述方法所计算。应注意，AD细胞的每个团块数量的面积显著高于AC或非ADD细胞的每个团块数量的面积。上述方法提供另一诊断AD的方式。 在发明的其他实施方式中，可组合任何上述方法。例如，可计算分形维数，和/或可分配特征并求和，和/或可计算每个团块数量的面积。在一个实施方式中，仅当2种或更多上述方法独立指示阳性诊断时，作出AD的阳性诊断。在其他实施方式中，仅当所有方法(例如3种不同方法，具体例如分形维数、特征总和、面积方法)独立指示阳性诊断时，作出AD的阳性诊断。在其他实施方式中，通过调整“统计上显著”的定义，例如对任何上述变量在某一多种群体标准偏差设置诊断阈值，可避免或最小化假阳性和阴性。在本发明的任何实施方式中 ，细胞可在蛋白混合物中培养或孵育。在一个实施方式中，所述蛋白混合物是胶状蛋白混合物。一种非限制示例性胶状蛋白混合物是Matrigel ο Matrigel 是 Engelbreth-Holm-Swarm(ElHS)小鼠肉瘤细胞分泌的胶状蛋白混合物的商品名并由BD生物科学公司(BD Biosciences)销售。此混合物类似许多组织中发现的复合胞外环境，为细胞生物学家所用作为细胞培养基底。BD生物公司网址为http://www. bdbiosciences. ca。在一个实施方式中，细胞在基底膜制品中培养或孵育。在一个实施方式中，此制品溶解。在一个实施方式中，基底膜制品提取自肿瘤。在一个实施方式中，所述肿瘤是富含胞外基质蛋白的Engelbreth-Holm-Swarm(BHS)小鼠肉瘤。其主要成分是层粘连蛋白，然后是月父原IV、硫酸乙酸肝素蛋白聚糖、内动素/桌蛋白。在某些实施方式中，此制品包含TGF- β、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子、组织型纤溶酶原激活物、和/或可能在EHS肿瘤中天然产生或不产生的其他生长因子。在一个实施方式中，细胞在含胞外基质蛋白的制品中培养或孵育。在一个实施方式中，所述制品包括层粘连蛋白、胶原、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、内动素/巢蛋白、和/或其组合。在一个实施方式中，所述制品提取自肿瘤。在一个实施方式中，所述肿瘤是Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤。在一个实施方式中，所述制品还包括生长因子。在一个实施方式中，所述制品还包括TGF-β、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子、组织型纤溶酶原激活物、和/或其组合、和/或其他生长因子。在一个实施方式中，TGF-β、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子、组织型纤溶酶原激活物、和/或其他生长因子在肿瘤中天然产生。在一个实施方式中，所述生长因子在EHS小鼠肉瘤中天然产生。在一个实施方式中，所述制品包括胞外基质蛋白制品，其有效结合和分化正常及转化的锚定依赖性上皮样细胞和其他细胞类型。这些包括神经元、肝细胞、塞尔托利氏细胞、鸡晶状体、和血管内皮细胞。在一个实施方式中，所述胞外基质蛋白制品可影响成年大鼠肝细胞中的基因表达以及小鼠和人乳腺上皮细胞的三维培养。在一个实施方式中，这是数种肿瘤细胞侵入试验的基�。С痔迥谥芪窬偕峁┭芯刻迥谕庋苌伤璧牡孜铩Ｔ谝桓鍪凳┓绞街校饣实鞍谆怪С置庖咭种菩∈笾腥酥琢龅奶迥谠鲋�。在一个实施方式中，一定体积的冷冻胞外基质蛋白倒入组织培养的实验器皿上。如本文所用，“冷冻”指温度低于室温，优选低于约15°C，更优选低于约10°C，更优选低于约5°C，最优选约4°C。以升高的温度孵育时，所述胞外基质蛋白自组装，产生覆盖实验器皿表面的薄膜。如本文所用，“升高”指温度高于室温，优选高于约20°C，更优选高于约25°C，更优选高于约30°C，更优选高于约35°C，最优选约37°C，37°C约为平均人体温度。在胞外基质蛋白上培养的细胞显示另外在实验室条件下难以观察到的复杂细胞行为。例如，内皮细胞在胞外基质蛋白包被表面上产生蜘蛛网样复杂网络，但在塑料平面上没有。这种网络高度提示使活组织充满血的微血管毛细管系统。因此，生物学研究者对内皮细胞构建这类网络的过程很感兴趣且胞外基质蛋白使他们能观察到这点。在一些实施方式中，优选使用更大体积的胞外基质蛋白以生成厚的三维凝胶。使用厚凝胶是因为它们诱导细胞从凝胶表面迁移到内部。在一些实施方式中，此迁移行为被研究者作为肿瘤细胞转移模型加以研究。胞外基质蛋白刺激复杂细胞行为的能力是其异质组合物的结果。在一些实施方式中，胞外基质蛋白主要成分是结构蛋白如层粘连蛋白和胶原，其呈递培养细胞与它们在其天然环境中会遇到的粘附肽序列。一些实施方式还使用促进许多细胞类型分化和增殖的生长因子。胞外基质蛋白还可包含少量的许多其他蛋白。如本文所公开，成纤维细胞网络复杂度动力学的测量提供了用最小侵入性过程诊断AD患者的新机会。类似AD脑中神经网络的人皮肤成纤维细胞网络显示复杂度相较AC 和非ADD细胞降低，如分形维数所测。人皮肤成纤维细胞网络提供用于准确AD诊断和药物筛选的脑网络模型。本文的所有书籍、文章或专利参考以不与本公开相矛盾的程度通过引用纳入。本发明现在通过举例方式描述，意在阐明而不是限制发明范围。实施例I :用BD基质胶低生长因子包被12孔板设备和材料11级A/B 3生物安全柜(福马科技公司(Forma Scientific))。CO2隔水式恒温培养箱(福马科技公司)。倒置显微镜。巴斯德吸管。血清移液管。移液器配件(欧米茄公司(Omega)产品目录号P5017)。BD基质胶低生长因子(BD生物科学公司，产品目录号354230)，(等分800 μ I并在_20°C储存)。无菌12孔培养板(康宁公司(ComingInc.)，产品目录号3512)。过程临用前在4°C于冰上解冻BD基质胶低生长因子30分钟，使用预冷移液管、吸头和12孔培养板。确保基质胶为液体且没有固体聚集物。厚凝胶方法使用冷却的移液管，混合BD基质胶低生长因子直到均匀。使用前以及在加入每孔700 μ L的BD基质胶低生长因子期间，将12孔培养板在冰上保持30分钟。在倒置显微镜下验证细胞培养板表面的凝胶均一性，并避免气泡。12孔板在37°C放置30分钟。添加细胞悬液到BD基质胶低生长因子顶部。细胞密度调整至50细胞/mm3(见下)。实施例2 :制备人皮肤成纤维细胞用于接种设备和材料11级A/B 3生物安全柜(福马科技公司)。CO2隔水式恒温培养箱(福马科技公司)。倒置显微镜。T-E (胰蛋白酶-EDTA溶液IX) (-20C储存)。有10% FBS和1%PS的M-2(培养基-2)DMEM。巴斯德吸管。血清移液管。移液器配件(欧米茄公司产品目录号P5017)。培养瓶，排气盖，25cm2。15ml和50ml无菌塑料管。500ml瓶顶过滤器。水浴离心机。过程在37°C水浴中解冻和加热T-E及M-2培养基。含组织片段的瓶培养通过抽吸从瓶中移出培养基并弃去。为去除可能灭活胰蛋白酶的血清残余物，加入2ml T-E并立即吸出。添加2ml T-E到瓶中并37°C孵育3_5分钟。就所有病人而言，细胞从培养瓶表面脱落的时间并不相同且需要对各病例在3-5分钟范围内调整。在显微镜下观察细胞如果为圆形，则其脱落。如果大部分非圆形，将悬液再留在培养箱内I分钟或2分钟直到它们变圆。添加5ml M-2培养基以抑制胰蛋白酶活性。通过移液操作温和捣碎使细胞从瓶底部脱离，但小心不要触碰组织片段或使其脱离。将细胞悬液转移(用移液管)到15ml无菌塑料管内，1000RPM(速度3)离心5分钟，弃去上清，将细胞悬浮在3ml M-2培养基中。通过移液操作温和捣碎使细胞从15ml无菌塑料管底部脱离。实施例3 :计数人皮肤成纤维细胞设备和材料11级A/B 3生物安全柜(福马科技公司)。倒置显微镜。细胞计数板-Levy Double (VWR科技公司(VffR scientific)，产品目录号15170-208)。巴斯德吸管。血清移液管。移液器配件(欧米茄生物技术公司产品目录号P5017)。无菌12孔培养板(康宁公司，产品目录号3512)。过程添加O. 25ml细胞悬液到细胞计数板并将盖玻片置于顶部。
细胞计数板-Levy Double，含有成纤维细胞使细胞保持稳定，然后在倒置显微镜下计数9个大正方形内的细胞数。平均细胞数(AvC)乘以10，得到以细胞数/mm3表示的细胞密度(DC)。用M-2培养基稀释细胞悬液以在I. 5ml总体积中达到50个细胞/mm3的密度。对细胞悬液使用(I. 5ml) X (50) /AvC并用M-2培养基将剩余加至I. 5ml。各细胞系使用3个孔。因此，将步骤3的数字乘以3。在15ml无菌塑料管中制备4.5ml混合物并用IOml移液管温和匀化。各添加I. 5ml到3个孔。所述3孔板标记有病人代码、日期和传代数。用70% EtOH外喷12孔培养板并置于培养箱内。实施例4 :通过图像分析验证人皮肤成纤维细胞的细胞密度设备和材料倒置显微镜。图像J(Image J)。过程培养箱中10分钟后，取出12孔培养板并置于倒置显微镜下。用图像分析细胞计数4x物镜下对齐孔中心与视场中心。变化物镜到10x，拍摄I张中心图像以及通过左/右、上/下移动一个视场拍摄其他4张。将图像加载到图像J下并转至处理/杂色/去斑。然后转至处理/杂色/ 二元/产生二元。使二元图像去斑2-3次，然后使用分析/分析粒子计数细胞。结果在概括/计数下。应注意自动计数细胞比手动计数高估 12%。初始细胞密度的下阈值是45细胞/mm3，其对应于IOx下190个细胞的细胞数和I. 4的分形维数。初始细胞密度的上阈值是62细胞/mm3，其对应于IOx下650个细胞的细胞数和I. 62的分形维数。弃去平均细胞数在2个阈值外的任何孔。实施例5:方法I;评分设备和材料倒置显微镜(威斯多佛AMID 2000数字型(Westover Digital AMIDModel 2000)) o Micron 2· O. O 威斯多佛科技公司(Westover Scientific) 2008。图像 J。过程在48小时拍摄照片且之后基于8个标准测量总分。3个标准(见下面的I、4和5)由每个聚集体数量的平均面积来定量表示。用于筛选的参数I.存在大聚集体。2.细胞结合聚集体。3.聚集体生长迹象。4.聚集体数量小(IOx图像上< 10)。5.聚集体数量大(IOx图像上> 10)。6.网络内的可测边缘。7.细胞迁移迹象。
8.接近渗滤界限(细胞形成连续流)。总分(1)前4种参数特异于阿尔茨海默病(AD)，若存在则分数为“-I”且若没有则为“O”。(2)后4种参数特异于年龄匹配对照(AC)和非阿尔茨海默氏痴呆(非ADD)，若存在则分数为“+I”且若没有则为“O”。(3)总分计算为所有8个值的和。如果总分为正或零，则细胞是AC或非ADD。如果总分为负，则细胞是AD。每个聚集体数量的平均面积(I)将图像输入Micron 2. O. O并在检测/椭圆面积下一一测量聚集体。在聚集体上拟合椭圆且由软件自动提供面积。(2)收集电子表格中的面积并用函数COUNT自动提取聚集体数量。(3)对各图像计算聚集体的平均面积和平均数量以及2者的比例。(4)就各孔的所有5个图像而言，算出每#聚集体的面积均值。(5)就 同一细胞系的所有3个孔而言，算出每#聚集体的面积均值。(6)如果每#聚集体的面积小于1000，则细胞系是AC或非ADD，若其大于1000，则细胞是AD。实施例6 :方法2 ;分形分析设备和材料倒置显微镜(威斯多佛AMID 2000数字型(Westover Digital AMIDModel 2000)。图像 J。FracLac 中的插件。过程48小时后拍摄照片并计算分形维数。用于筛选的参数⑴存在大聚集体。实施例7 :制备培养基制备培养基DMEM(高葡萄糖)，产品目录号10313-039，英杰吉布可公司(Invitrogen Gibco) (4O冰箱储存)；FBS,产品目录号10082-147,英杰吉布可公司(等分50ml并-20°C储存)；PS(青霉素和链霉素溶液)产品目录号15140-122，英杰公司(Invitrogen)(等分 5ml 并-20°C储存)。含 45 %和 I % PS 的 M-1 (培养基-I)DMEM。含10%和1% PS的M-2(培养基-2)DMEM。过滤、标记并在4°C冰箱储存，多至I个月。
权利要求
1.一种诊断人对象内阿尔茨海默病的方法，所述方法包括步骤 (a)获得来自人对象的一个或多个细胞； (b)培养所述一个或多个细胞一段时间； (C)测定细胞聚集体的平均面积并将所述平均面积除以聚集体数量以获得每个聚集体数量的面积； (d)将步骤(C)的测定与用非阿尔茨海默病细胞所测每个聚集体数量的面积作比较；和 (e)基于步骤(d)的比较诊断有或没有阿尔茨海默病。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，如果步骤(C)中所测每个聚集体数量的面积大于步骤(d)中所测每个聚集体数量的面积，则所述诊断为阿尔茨海默病阳性。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述诊断用一种或多种额外诊断方法确认。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述一种或多种额外诊断方法选自下组含有测定综合评分的方法、含有计算每个聚集体数量的面积的方法、含有细胞迁移分析的方法、含有分形分析的方法和含有空隙度分析的方法。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述细胞是成纤维细胞。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(d)中的非阿尔茨海默病细胞是AC细胞。
7.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述细胞在蛋白混合物中培养。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述蛋白混合物包括含层粘连蛋白、胶原、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、内动素/巢蛋白、和/或其组合的胞外基质制品。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述蛋白混合物还可包括生长因子。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述胞外基质蛋白提取自肿瘤。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述肿瘤是EHS小鼠肉瘤。
12.—种方法，所述方法包括 (a)获得来自人对象的一个或多个细胞； (b)培养所述一个或多个细胞一段时间； (c)在所述时间段结束时获得所述细胞的图像； (d)测定所述图像上与细胞网络相关的分形维数； (e)将步骤(d)的测定与已知非阿尔茨海默病细胞相关的独立测定分形维数作比较。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，如果步骤(d)所计算分形维数在统计上显著低于已知非阿尔茨海默病细胞相关的分形维数，则所述比较指示阿尔茨海默病。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述阿尔茨海默病用一种或多种诊断方法确认。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述一种或多种诊断方法选自下组含有测定综合评分的方法、含有计算每个聚集体数量的面积的方法、含有细胞迁移分析的方法、含有分形分析的方法和含有空隙度分析的方法。
16.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述分形维数用计盒法计算。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述计盒法包括边缘检测过程。
18.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述对象与提供所述已知非阿尔茨海默病细胞的对照对象年龄匹配。
19.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述时间段为约24小时。
20.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述细胞在蛋白混合物中培养。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述蛋白混合物包括含层粘连蛋白、胶原、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、内动素/巢蛋白、和/或其组合的胞外基质制品。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述蛋白混合物还包括生长因子。
23.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述胞外基质蛋白提取自肿瘤。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述肿瘤是EHS小鼠肉瘤。
25.—种方法,所述方法包括 (a)测定来自人对象的成纤维细胞网络图像的分形维数； (b)测定来自已知非阿尔茨海默病细胞的成纤维细胞网络图像的分形维数； (C)将步骤(a)和(b)的测定作比较。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，如果步骤(a)所测分形维数在统计上显著低于步骤(b)所测分形维数，所述诊断指示阿尔茨海默病。
27.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述对象与提供已知非阿尔茨海默病细胞的对照对象年龄匹配。
28.—种诊断人对象中阿尔茨海默病的方法，所述方法包括 (a)计算所述对象成纤维细胞网络图像的分形维数； (b)比较步骤(a)的计算与已知非阿尔茨海默病细胞相关的独立测定分形维数； 其中如果步骤(a)计算的分形维数在统计上显著低于已知非阿尔茨海默病细胞相关的分形维数，所述对象的阿尔茨海默病诊断为阳性。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述对象与提供所述已知非阿尔茨海默病细胞的对照对象年龄匹配。
30.一种诊断人对象中阿尔茨海默病的方法，所述方法包括 (a)用手术刀片获取所述对象外周皮肤成纤维细胞样品； (b)用培养箱孵育所述样品一段时间； (C)用成像仪在所述时间段结束时获取所述样品图像； (d)用电脑计算所述图像上与成纤维细胞网络相关的分形维数； (e)将步骤(d)的计算与已知非阿尔茨海默病细胞相关的独立测定分形维数作比较，其中如果步骤(d)计算的分形维数在统计上显著低于已知非阿尔茨海默病细胞相关的分形维数，所述对象的阿尔茨海默病诊断为阳性。
31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述样品在蛋白混合物中孵育。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述蛋白混合物包括含层粘连蛋白、胶原、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、内动素/巢蛋白、和/或其组合的胞外基质制品。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述蛋白混合物还包括生长因子。
34.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述胞外基质蛋白提取自肿瘤。
35.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述肿瘤是EHS小鼠肉瘤。
36.一种诊断人对象中阿尔茨海默病的方法，所述方法包括 (a)用手术刀片获取所述对象外周皮肤成纤维细胞样品；(b)用培养箱孵育所述样品一段时间； (C)用成像仪在所述时间段结束时获取所述样品图像； (d)用电脑计算所述图像上与成纤维细胞网络相关的分形维数； (e)用电脑将步骤(d)的分形维数输入含分形维数数据的数据库，所述分形维数数据用获自各个年龄的对照对象的非阿尔茨海默病细胞生成； (f)通过比较步骤(d)所计算的分形维数与所述数据库数据，用电脑诊断所述对象。
37.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述样品在胶状蛋白混合物中孵育。
38.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述胶状蛋白混合物包括含层粘连蛋白、胶原、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、内动素/巢蛋白、和/或其组合的胞外基质制品。
39.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述胶状蛋白混合物还包括生长因子。
40.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述胞外基质蛋白提取自肿瘤。
41.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述肿瘤是EHS小鼠肉瘤。
42.一种具有分形维数数据的数据库的计算机可读介质，所述分形维数数据由获自各个年龄的对照对象的非阿尔茨海默病细胞生成，所述介质含有以下指令 (a)计算图像的分形维数； (b)比较所述分形维数与所述数据库的分形维数数据；和 (c)基于步骤(b)的比较输出诊断。
43.一种方法，所述方法包括 (a)培养人对象的皮肤细胞一段时间； (b)检测与所述细胞的成纤维细胞网络相关的细胞形态学特征； (C)进行涉及所述细胞形态学特征的计算；和 (d)将步骤(C)的计算与已知非阿尔茨海默病细胞相关的独立测定参数作比较。
44.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述细胞形态学特征选自下组成纤维细胞团的数量、成纤维细胞团的大小、成纤维细胞团的生长、和其组合。
45.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述细胞形态学特征是有或没有大团、有或没有附于团的细胞、有或没有大团生长、团数量、有或没有来自先前形成的所述团网络的剩余边缘、细胞迁移数量、有或没有渗流附近的细胞。
46.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述步骤(c)的计算包括将离散值分配给各所述细胞形态学特征并对所述值求和。
47.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述和用于诊断AD或没有AD。
48.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述细胞在蛋白混合物中培养。
49.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述蛋白混合物包括含层粘连蛋白、胶原、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、内动素/巢蛋白、和/或其组合的胞外基质制品。
50.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述蛋白混合物还包括生长因子。
51.如权利要求49所述的方法，其特征在于，所述胞外基质蛋白提取自肿瘤。
52.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述肿瘤是EHS小鼠肉瘤。
53.一种诊断对象中阿尔茨海默病的方法，所述方法包括步骤 (a)获取所述对象的一个或多个细胞并在组织培养基中培养所述一个或多个细胞； (b)测量一段时间内所述一个或多个细胞的分形维数；(C)对所述分形维数随着时间变化作图以获得分形维数曲线； (d)比较所述分形维数曲线与获自非阿尔茨海默病细胞和非阿尔茨海默病痴呆(非ADD)细胞的分形维数曲线；和 (e)诊断所述对象中有或没有阿尔茨海默病。
54.如权利要求53所述的方法，其特征在于，如果获自所述对象的一个或多个细胞测得的所述分形维数曲线在统计上显著不同于获自非阿尔茨海默病细胞和所述非ADD细胞的所述分形维数曲线，所述对象的所述阿尔茨海默病诊断为阳性。
55.如权利要求54所述的方法，其特征在于，所述获自所述对象的一个或多个细胞是成纤维细胞。
56.如权利要求53所述的方法，其特征在于，所述诊断用一种或多种额外诊断方法确 认。
57.如权利要求56所述的方法，其特征在于，所述一种或多种额外诊断方法选自下组含有测定综合评分的方法、含有计算每个聚集体数量的面积的方法、含有细胞迁移分析的方法、含有分形分析的方法和含有空隙度分析的方法。
58.一种诊断对象中阿尔茨海默病的方法，所述方法包括步骤 (a)获取所述对象的一个或多个细胞并在组织培养基中培养所述一个或多个细胞； (b)基于所述培养细胞的一种或多种特征测定综合评分； (C)比较所述综合评分与非阿尔茨海默病细胞所测综合评分； (d)诊断所述对象中有或没有阿尔茨海默病。
59.如权利要求58所述的方法，其特征在于，所述用于计算所述综合评分的特征选自下组聚集体的大小、细胞与聚集体的结合、聚集体生长的迹象、聚集体的数量、网络内的边缘、细胞迁移迹象和接近渗滤界限(或细胞密度)。
60.如权利要求58所述的方法，其特征在于，所述诊断用一种或多种额外诊断方法确认。
61.如权利要求60所述的方法，其特征在于，所述一种或多种额外诊断方法选自下组含有测定综合评分的方法、含有计算每个聚集体数量的面积的方法、含有细胞迁移分析的方法、含有分形分析的方法和含有空隙度分析的方法。
62.一种诊断对象中阿尔茨海默病的方法，所述方法包括步骤 (a)获取所述对象的一个或多个细胞并在组织培养基中培养所述一个或多个细胞； (b)测定迁移细胞数量； (C)比较所述迁移细胞数量与非阿尔茨海默病细胞的迁移细胞数量； (d)诊断所述对象中有或没有阿尔茨海默病。
63.如权利要求62所述的方法，其特征在于，如果获自所述对象的迁移细胞数量在统计上显著小于迁移的非阿尔茨海默病细胞数量，所述诊断对AD为阳性。
64.如权利要求62所述的方法，其特征在于，所述细胞是成纤维细胞。
65.如权利要求62所述的方法，其特征在于，所述诊断用一种或多种额外诊断方法确认。
66.如权利要求65所述的方法，其特征在于，所述一种或多种额外诊断方法选自下组含有测定综合评分的方法、含有计算每个聚集体数量的面积的方法、含有细胞迁移分析的方法、含有分形分析的方法和含有空隙度分析的方法。
67.一种诊断对象中阿尔茨海默病的方法，所述方法包括步骤 (a)获取所述对象的一个或多个细胞并在组织培养基中培养所述一个或多个细胞； (b)测定所述细胞空隙度； (C)比较所述细胞的空隙度与非阿尔茨海默病细胞的空隙度； (d)诊断所述对象中有或没有阿尔茨海默病。
68.如权利要求67所述的方法，其特征在于，如果获自所述对象的细胞空隙度在统计上显著高于非阿尔茨海默病细胞的空隙度，所述诊断对AD为阳性。
69.如权利要求67所述的方法，其特征在于，所述诊断用一种或多种额外诊断方法确认。
70.如权利要求69所述的方法，其特征在于，所述一种或多种额外诊断方法选自下组含有测定综合评分的方法、含有计算每个聚集体数量的面积的方法、含有细胞迁移分析的方法、含有分形分析的方法和含有空隙度分析的方法。
71.如权利要求67所述的方法，其特征在于，所述细胞是成纤维细胞。
72.一种用于开发治疗或预防阿尔茨海默病的一种或多种药物候选物的先导化合物筛选方法，所述方法包括步骤 (a)在细胞培养基中培养一个或多个AD细胞； (b)将所述AD细胞与化合物接触； (c)测定所述AD细胞的一种或多种特征是否改变为与未接触所述化合物的非阿尔茨海默病细胞的特征类似。
73.如权利要求72所述的方法，其特征在于，所述细胞是成纤维细胞。
74.如权利要求72所述的方法，其特征在于，所述特征是分形维数。
75.如权利要求72所述的方法，其特征在于，所述特征是综合评分。
76.如权利要求72所述的方法，其特征在于，所述特征是每个聚集体数量的平均聚合面积。
77.如权利要求72所述的方法，其特征在于，所述特征是或细胞迁移。
78.如权利要求72所述的方法，其特征在于，所述特征是空隙度。
79.一种测定对象中阿尔茨海默病持续时间的方法，所述方法包括 (a)获取所述对象的一个或多个细胞； (b)测量已知AD细胞系的细胞迁移特征或每个聚集体数量的平均面积； (c)用步骤(b)所获数据制成标准曲线； (d)测量步骤(a)所获细胞的迁移特征或每个聚集体数量的平均面积；和 (e)测定所述对象中AD病持续时间。
80.如权利要求79所述的方法，其特征在于，所述细胞是成纤维细胞。
81.如权利要求79所述的方法，其特征在于，所述鉴定有10年或更短时间AD的对象鉴定为对AD治疗的响应性增加。
82.如权利要求79所述的方法，其特征在于，所述鉴定有9年或更短时间AD的对象鉴定为对AD治疗的响应性增加。
83.如权利要求79所述的方法，其特征在于，所述鉴定有8年或更短时间AD的对象鉴定为对AD治疗的响应性增加。
84.如权利要求79所述的方法，其特征在于，所述鉴定有7年或更短时间AD的对象鉴定为对AD治疗的响应性增加。
85.如权利要求79所述的方法，其特征在于，所述鉴定有6年或更短时间AD的对象鉴定为对AD治疗的响应性增加。
86.如权利要求79所述的方法，其特征在于，所述鉴定有5年或更短时间AD的对象鉴定为对AD治疗的响应性增加。
87.如权利要求79所述的方法，其特征在于，所述鉴定有4年或更短时间AD的对象鉴定为对AD治疗的响应性增加。
88.如权利要求79所述的方法，其特征在于，所述鉴定有3年或更短时间AD的对象鉴定为对AD治疗的响应性增加。
89.如权利要求79所述的方法，其特征在于，所述鉴定有2年或更短时间AD的对象鉴定为对AD治疗的响应性增加。
90.如权利要求79所述的方法，其特征在于，所述鉴定有I年或更短时间AD的对象鉴定为对AD治疗的响应性增加。
91.一种区分对象存在阿尔茨海默病和非阿尔茨海默病痴呆的方法，所述方法包括 (a)获取对象的一个或多个细胞； (b)测量所述一个或多个细胞一段时间内分形维数； (C)对所述分形维数随着时间变化作图以获得分形维数曲线； (d)比较所述分形维数曲线与获自已知非阿尔茨海默病细胞、已知非阿尔茨海默病痴呆(非ADD)细胞和已知AD细胞的分形维数曲线；和 (e)区分所述对象中的AD和非ADD。
92.如权利要求91所述的方法，其特征在于，所述细胞是成纤维细胞。
93.一种区分对象存在阿尔茨海默病和非阿尔茨海默病痴呆的方法，所述方法包括 (a)获取对象的一个或多个细胞； (b)获取所述对象的一个或多个细胞并在组织培养基中培养所述一个或多个细胞； (C)测定迁移细胞数量； (d)比较所述迁移细胞数量与已知非阿尔茨海默病细胞、已知AD细胞和已知非ADD细胞的迁移细胞数量； (e)区分所述对象中的AD和非ADD。
94.如权利要求93所述的方法，其特征在于，所述细胞是成纤维细胞。
全文摘要
提供诊断阿尔茨海默病的方法。提出至少5种诊断测量方法方法1综合评分；方法2每个聚集体数量的平均聚合面积；方法3细胞迁移分析；方法4分形分析；方法5空隙度分析。在某些实施方式中，对象的皮肤样品提供成像的成纤维细胞网络，计算所述图像的分形维数。所述分形维数可与年龄匹配的对照(非阿尔茨海默病)数据库作比较以确定对象是否有阿尔茨海默病。成纤维细胞网络可在基质例如蛋白中培养。
文档编号G01N33/50GK102741693SQ201080055221
公开日2012年10月17日 申请日期2010年10月2日 优先权日2009年10月2日
发明者D·L·阿尔康, F·V·希里拉, T·K·汉 申请人:布朗歇特 洛克菲勒神经科学研究所
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
