专利名称：检测呋喃妥因代谢物的磁颗粒化学发光试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种直接化学发光检测试剂盒及其测试方法，特别是检测蜂蜜、水产、 组织等样本中呋喃它酮代谢物残留量的磁颗粒竞争直接化学发光检测试剂盒。
背景技术：
硝基呋喃类药物是人工合成的广谱抗生素，它有非�：玫目咕饔煤鸵┒ρУ奶匦裕还惴河τ米魑倚�、家禽、人工养殖水产品的促生长添加剂。但通过长期的实验研究发现，硝基呋喃类药物和代谢物均可以使实验动物发生癌变和基因突变，并由此推断，人类长期使用该类药物或长期食用添加该类促生长添加剂的家禽、家畜、人工养殖水产品，同样也可以发生癌变和基因突变。所以此类药物禁止在治疗和饲料中使用。呋喃妥因在1995年被禁用。由于呋喃妥因在体内很快就能被代谢，而在组织中结合的代谢产物则能存留较长的一段时间，所以在分析此类药物的残留时要经常分析其代谢后的产物，检测监管部门就以检测代谢产物为手段达到检测呋喃妥因残留的目的。目前，呋喃妥因代谢物残留量的常规检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)Jf 相色谱-质谱法(LC-MS)和酶联免疫吸附法(ELISA)等。1、高效液相色谱法(HPLC)具有检测精度高、假阳性率低的特点。HPLC法的主要缺点是仪器价格昂贵，操作比较繁琐，耗时长，检测费用昂贵，对检测人员专业要求较高，样本前处理较复杂。2、液相色谱-质谱法(LC-MQ，样品不需要衍生化处理，可对尿液、血液、肝脏、毛发和眼球样品进行检测。LC-MS/MS联用，可进一步提高信噪比，所以可用于对阳性结果的确认手段。但是，无论LC-MS还是LC-MS/MS，都未能解决仪器造价昂贵，操作步骤繁琐，样本前处理复杂，对操作人员专业素养要求高等问题。3、酶联免疫吸附法(ELISA)是20世纪70年代出现，用于微量物质的检测，最早应用于传染病、肿瘤标志物、激素水平等临床检测，90年代开始在我国食品安全检测领域推广应用，目前依托ELISA技术的试剂盒、试纸条已经成为食品安全快速检测领域的主导产品， 同时也是我公司研发和销售的主要产品类型。酶联免疫检测法基于抗原-抗体的特异性反应，检测灵敏度较高、特异性较好，技术操作简易，容易掌握，确实解决了大量的以前难以解决的许多微量小分子物质如抗生素、激素、农药残留等的定性、定量分析工作，对食品安全快速检测技术的发展起到了积极的促进作用。但是，ELISA方法存在许多自身无法克服的缺陷，主要表现在1)均相反应检测过程中为分离游离物与结合物，需要多步洗板过程，耗时费力， 难以提高操作的自动化程度。2)酶催化反应借助酶催化底物显色，测定反应液吸光度值。反应的时间与温度对酶活力存在较大影响，试剂稳定性差。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种呋喃妥因代谢物检测试剂盒，采用该试剂盒进行呋喃妥因代谢物的检测时不仅具备较高的灵敏度，特异性，而且具有较高的反应速度。本发明的另一个目的在于提供一种呋喃妥因代谢物的测试方法，该方法操作简单，灵敏度高，特异性好。实现上述目的，本发明提供一种呋喃妥因代谢物检测试剂盒，其包含的主要试剂有发光标记物、荧光素标记物、标准品、质控品、分离试剂。所述的分离试剂是包被有羊抗FITC单克隆抗体的顺磁性纳米微珠。所述的顺磁性纳米微珠，表面含有-OH、-COOH或-NH2活性基团的微珠，用于包被羊抗FITC单克隆抗体，其内芯是!^e3O4或Y -Fe2O3，使得微珠具有顺磁性。所述的发光标记物是异鲁米诺衍生物标记的呋喃妥因代谢物半抗原。所述的异鲁米诺衍生物是ABEI、AHEI或ABEN。所述的试剂盒还包括标准品，质控品和浓缩洗液。所述的荧光素标记物是FITC标记的呋喃妥因代谢物单克隆抗体。本发明还提供一种利用试剂盒检测呋喃妥因代谢物的方法，包括下列步骤1)分别吸取20 μ 1-100 μ 1标准品或样本，然后加入20 μ 1-100 μ 1发光标记物，再加20 μ 1-100 μ 1荧光素标记物，充分混勻后，37°C温育15min ；2)加入包被有羊抗FITC单克隆抗体的顺磁性纳米微珠80-150 μ 1，混勻后在37°C 温育5min ；3)用磁分离架分离5min，弃上清后用清洗液300-500 μ 1冲洗复合物沉淀；4)上述清洗步骤重复2-4次；5) 4)所得分离好的复合物直接放入测量暗箱，加入激发底物1和激发底物2，延迟 3-5s后检测发出的相对光强度(RLU)，样本中的含量与RLU成一定比例关系，可以通过RLU 集合标准曲线法计算呋喃妥因代谢物的浓度。所述的发光底物的主要成分是NaOH和Η202。本发明中分析测试方法所用的分析仪是包括电源电路、自动注射泵1和2、测量室、发光室、光电倍增管计数器和输出系统，同时还配置有计算机与中文界面的Windows控制软件，可进行资料录入、结果汇总、质量控制、结果储存和结果查询等功能，可完成多种分析模式的编程，定量或定性报告结果，自动生成并储存、更新功能，两点自动修正标准曲线， 所采用的系统是CI-2008系统。本发明所述的分离试剂是包被羊抗FITC单克隆抗体，其表面基团的含量是 0. 1-0. 3eqm/g,其保存于 pH7. 1-7. 5，含有 3-5 % 酪蛋白，0. 1-0. 3 % 吐温-20,0. 02-0. 04 % 硫柳汞防腐剂，0. 03-0. 05mol/LTRIS缓冲液中。所述的FITC是异硫氰酸荧光素。所述百分
含量为质量百分含量。所述的发光标记物是异鲁米诺衍生物ABEI、AHEI或ABEN标记的呋喃妥因代谢物半抗原，其保存于其保存于ρΗ7· 2-7. 6，含0. 1-0. 3%吐温-20，0. 02-0. 04% NaN3的TRIS缓冲液中。所述百分含量是质量百分含量。所述的荧光素标记物是FITC标记的呋喃妥因代谢物单克隆抗体，其保存于ρΗ7· 2-7. 6，含8-10%卵清蛋白，0. 02-0. 04%硫柳汞防腐剂，0. 1-0. 2mol/LPBS缓冲液。所述百分含量为质量百分含量。呋喃妥因代谢物标准品溶液(0ng/ml，0.01ng/ml，0. 03ng/ml，0. 09ng/ml，0. 27ng/ ml，0. 81ng/ml)，标准品稀释液为 ρΗ7· 2-7. 6,0. 03-0. 05 %硫柳汞防腐剂，0. 05-0. Imol/ LTRIS缓冲液。所述百分含量为质量百分含量。呋喃妥因代谢物质控品溶液浓度分别为0. 02ng/ml，0. 5ng/ml，质控品稀释液 PH7. 2-7. 4,0. 03-0. 05%硫柳汞防腐剂，0. 05-0. lmol/L TRIS缓冲液。所述百分含量为质量
百分含量所述的浓缩洗液为PH7. 0-7. 4，0. 2-0. 4 %吐温-20,0. 2-0. 4 %叠氮化钠， 0. 1-0. 2mol/L PBS缓冲液。所述百分含量为质量百分含量。本发明的有益效果如下1)本发明试剂盒可特异性检测呋喃妥因代谢物，对其他药物无交叉。2)本发明试剂盒的灵敏度较高，对呋喃妥因代谢物的检测灵敏度可达0. Olng/ ml ο3)本发明试剂盒的检测快捷，检测时间低于20min。
具体实施例方式实施例1试剂盒具体组分的制备1、发光标记物的制备a)半抗原的合成将呋喃妥因代谢物和对羧基苯甲醛在水中反应进行衍生化得到呋喃妥因代谢物衍生物半抗原。取呋喃妥因代谢物IOOOmg溶于12ml纯水中。将IOOOmg对羧基苯甲醛溶于^ml 水中，加入呋喃妥因代谢物溶液中室温反应48h，得到淡黄色沉淀即为呋喃妥因代谢物衍生物半抗原。用50ml水反复清洗5-6次，烘干后得到呋喃妥因代谢物衍生物半抗原。b)发光标记物制备取4. 5mmol/L ABEI，溶于4ml蒸馏水中，5. Ommol/L N-羟基琥珀酰亚胺溶于0. 5ml N，N-二甲基甲酰胺中，二者充分混勻后室温反应3-4h。取上述制备的呋喃妥因代谢物半抗原15mg，用pH7. 4PBS调节体积到1. 5ml，然后加入上述活化的ABEI溶液，充分混勻后室温反应过夜，过G-25凝胶柱纯化。2、荧光标记物制备a)免疫原的制备将呋喃妥因代谢物半抗原与卵清蛋白采用混合酸酐法进行偶联得到免疫原。b)呋喃妥因代谢物单克隆抗体的制备动物免疫以免疫原对Balb/c小鼠进行免疫，免疫剂量为150 μ g/只，使其产生抗血清。细胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按9 1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，得到单克隆抗体的杂交瘤细胞株。细胞冻存和复苏将杂交瘤细胞用冻存液制成IX IO6个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37°C水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。单克隆抗体的制备与纯化将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0. 5ml/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞5X IO5个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，纯化后的腹水放入_20°C环境保存。C)荧光标记物制备用0. 025mol/L, pH9. 0的碳酸盐缓冲液将呋喃妥因代谢物单克隆抗体稀释成1 % 质量百分比浓度；根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加O.OlmgFITC，用分析天平准确称取所需的FITC粉末。用同一缓冲液将FITC配成0. lmg/ml的溶液，按上述抗体溶液体积的3-5倍，混入FITC稀释液；在4 。C避光条件下电磁搅拌、标记30-4 ；将标记溶液3000r/min，室温离心20min，除去其中少量的沉淀物，装入透析袋中，再pH7. 4的PBS 缓冲液透析2-3天，期间至少更换透析液3次；取透析过夜的标记物，通过kphadexG-25或 G-50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光标记物进行鉴定，分装，贮存于4°C冰箱中。3、分离试剂制备a)磁珠活化表面-COOH基团的磁珠(购于DYNAL，粒径为2. 8 μ m)，其含量是0. 15eq/g;取 100 μ 1 磁珠，用 100 μ 1 25mmol/L,pH5. 0,0. 05% Tween_20MES 溶液洗涤两次，磁分离后移除上清；使用前，用4°C贮存的25mmol/L MES溶液分别配置50mmol/L的EDC、NHS溶液；分别加入50 μ 1新配置的EDC和NHS溶液到装有磁珠的离心管中，涡旋混勻，室温活化30min ； 离心管置于磁分离架上磁分离^iin,移除上清，加入100 μ l,25mmol/L,pH5. 0,MES清洗2_3 次后即可得表面羧基活化的磁珠。b)磁珠偶联羊抗FITC单克隆抗体将50-100 μ g羊抗FITC单克隆抗体溶解到60 μ 1，25mmol/L, pH5. OMES中，用所述 MES溶液调节总体积至100 μ 1，轻柔混勻磁珠与抗体；室温条件下至少偶联30min或4。C偶联2h，该期间可利用涡旋仪使磁珠保持混勻状态；离心管置于磁分离架上磁分离3-5min， 移除上清；为了淬灭未反应的-C00H，可加入100 μ 1，ρΗ7. 4，TRIS反应15min或100μ 1， ρΗ8· 0，含有 50mmol/L 乙醇胺的 PBS 封闭磁珠；用 100 μ 1,0. 1-0. 3% BSA, 0. 1% Tween-20 的PBS或TRIS清洗封闭好的磁珠3-5次；最后将磁珠复溶于含0. 1-0. 5% BSA, 0. 01-0. 1 % Tween-20,0. 02% NaN3 的 PBS 或 TRIS 缓冲液中，2_8°C保藏。实施例二试剂盒的组建组建检测呋喃妥因代谢物的磁颗粒化学发光检测试剂盒，使其含有下列组分FITC标记的呋喃妥因代谢物单克隆抗体的荧光标记物ABEI标记的呋喃妥因代谢物半抗原的发光标记物表面包被羊抗FITC单克隆抗体的顺磁性纳米微珠的分离试剂呋喃妥因代谢物标准品溶液(0ng/ml，0.01ng/ml，0. 03ng/ml，0. 09ng/ml，0. 27ng/ ml，0. 81ng/ml)，标准品稀释液为ρΗ7· 4，含有0. 05%硫柳汞防腐剂，0. lmol/LTRIS缓冲液。 所述百分含量为质量百分含量。呋喃妥因代谢物质控品溶液浓度分别为0. 02ng/ml，0. 5ng/ml，质控品稀释为 !17.4，含有0. 05%硫柳汞防腐剂，0. lmol/LTRIS缓冲液。所述百分含量为质量百分含量。
浓缩洗液为pH7. 2,0. 4%吐温-20，0. 3%叠氮化钠，0. lmol/L PBS缓冲液。所述百
分含量为质量百分含量。实施例三实际样品中呋喃妥因代谢物的检测1、样本前处理(一 )肌肉、肝脏、等组织前处理方法用均质器均质样本；取1. 0士0. 05g的均质物至50ml聚苯乙烯离心管中；加入5ml 甲醇-水溶液，用振荡器振荡5min，3000g以上，室温O0_25°C )离心lOmin，去除全部上清液；(本步骤可降低样本基质干扰)加入細1去离子水，用涡旋仪涡动溶解，加入0. 5ml IM 盐酸溶液和100 μ 1衍生化试剂，用振荡器充分振荡aiiin ；在37°C过夜孵育(大约16h)；分别加入5ml 0. IM磷酸氢二钾溶液、0.細1 IM氢氧化钠溶液和5ml的乙酸乙酯，用振荡器剧烈振荡30s ；3000g以上，室温Q0-25°C )离心IOmin ；取2. 5ml乙酸乙酯相至IOml干燥的玻璃试管中，于50 60°C水浴氮气流下吹干；加入Iml的正己烷(或正庚烷)用涡旋仪涡动lmin，再加入Iml复溶工作液，用涡旋仪涡动30s充分混勻(注意涡动过程中防止出现严重乳化现象)后转入2ml聚苯乙烯离心管中；3000g以上，室温Q0-25°C )离心IOmin ； 除去上层有机相，取下层水相50 μ 1用于分析，样本稀释倍数2。(二)水产(鱼、虾等)组织前处理方法用均质器均质样本；取1. 0士0. 05g的均质物至50ml聚苯乙烯离心管中；加入5ml 甲醇-水溶液，用振荡器振荡5min，3000g以上，室温O0_25°C )离心lOmin，去除全部上清液；(本步骤可降低样本基质干扰)加入細1去离子水，用涡旋仪涡动溶解，加入0. 5ml IM 盐酸溶液和100 μ 1衍生化试剂，用振荡器充分振荡aiiin ；在37°C过夜孵育(大约16h)；分别加入5ml 0. IM磷酸氢二钾溶液、0. 4ml IM氢氧化钠溶液和5ml的乙酸乙酯，用振荡器剧烈振荡30s ；3000g以上，室温Q0-25°C )离心IOmin ；取2. 5ml乙酸乙酯相至IOml干燥的玻璃试管中，于50 60°C水浴氮气流下吹干；加入Iml正己烷(或正庚烷)用涡旋仪涡动 lmin，再加入Iml复溶工作液，用涡旋仪涡动30s充分混勻(注意涡动过程中防止出现严重乳化现象)后转入2ml聚苯乙烯离心管中；3000g以上，室温Q0-25°C )离心IOmin ；除去上层有机相，取下层水相50 μ 1用于分析，样本稀释倍数2。(三)蜂蜜前处理方法称取1.0士0.05g蜂蜜至50ml聚苯乙烯离心管中；加入的去离子水，用振荡器振荡至蜂蜜全部溶解；加入0. 5ml IM盐酸溶液和100 μ 1衍生化试剂，用振荡器振荡30s ； 在37°C过夜孵育(大约16h)；分别加入5ml 0. IM磷酸氢二钾溶液、0.細1 IM氢氧化钠溶液和5ml乙酸乙酯，用振荡器剧烈振荡30s ；3000g以上，室温(20-25°C )离心IOmin ；取2. 5ml 上层有机相至IOml干燥玻璃试管中，于50 60°C水浴氮气流下吹干；加入Iml的正己烷 (或正庚烷)用涡旋仪涡动lmin，再加入Iml复溶工作液，用涡旋仪涡动30s充分混勻(注意涡动过程中防止出现严重乳化现象)后转入2ml聚苯乙烯离心管中；3000g以上，室温 (20-25°C )离心IOmin ；除去上层有机相，取下层水相50 μ 1用于分析，样本稀释倍数2。2、用试剂盒检测与结果分析分别吸取20 μ 1-100 μ 1标准品或样本，然后加入20 μ 1-100 μ 1发光标记物，再加 20μ 1-100μ 1荧光素标记物，充分混勻后，37°C温育15min ；加入包被有羊抗FITC单克隆抗体的顺磁性纳米微球80-150 μ 1，混勻后在37°C温育5min ；用磁分离架分离5min，弃上清后用清洗液300-500 μ 1冲洗复合物沉淀；所得分离好的复合物直接放入测量暗箱，加入激发底物1和激发底物2，延迟3- 后检测发出的相对光强度(RLU)，样本中呋喃妥因代谢物的含量与RLU成一定比例关系，可以通过RLU结合标准曲线法计算呋喃妥因代谢物的浓度。激发底物1是NaOH，激发底物2是H202。底物装载前，用蒸馏水清洗底物泵10_20 遍，排空管道内残存的水�：螅俳嘤Φ牡孜镏苯臃湃胍瞧髂冢霉懿迦氲孜锲恐校挥玫孜锍逑垂艿�5次，并测定底物的RLU值，正常情况下，底物的RLU值不应超过1200。若超过1200，需重新用蒸馏水对管道和底物泵进行更多次清洗，直至空白值降至合理范围内。若超过三天不做实验，需卸载底物瓶，并盖上盖子，以防蒸发。随后用蒸馏水清洗管道，并排空，以免强碱溶液腐蚀底物泵。本发明采用6个呋喃妥因代谢物标准品(Ong/ml，0. 01ng/ml，0. 03ng/ml， 0. 09ng/ml,0. 27ng/ml,0. Slng/ml)，进行曲线测绘。仪器根据所述方法检测得到一条RLU 值与呋喃妥因代谢物浓度相关的定标曲线，相对应每一个样品中的浓度则可从标准曲线上读出样本中呋喃妥因代谢物的残留量。实施例四试剂盒质量的测定1、试剂盒的灵敏度试剂盒灵敏度的定义为测定20次零标准品，测定的平均值加上3倍标准差。该试剂盒的灵敏度为0. Olng/ml。2、样本的准确度和精密度准确度是指测定值与真值间的符合程度，试剂盒准确度常用回收率表示。精密度又称可重复性，常用变异系数表示。按照实施例三的样本提取方法，以0. 03ng/g(ml)、0. 06ng/g(ml)两个浓度的呋喃妥因对鸡肉、虾、蜂蜜样本进行添加回收，每种样本每个浓度各4个平行，用三批试剂盒进行测定，计算样本的平均回收率及精密度。实验结果见下表。表1准确度和精密度测定ng/g (ml)
权利要求
1.一种检测呋喃妥因代谢物的磁颗粒化学发光试剂盒，包括的试剂有发光标记物、 荧光素标记物、标准品、质控品、分离试剂。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的分离试剂是包被有羊抗FITC单克隆抗体的顺磁性纳米微珠。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的顺磁性纳米微珠是里面包覆有 Fe3O4或γ -Fe2O3，表面含有_0H、-COOH或-NH2活性基团的微珠。
4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于所述的发光标记物是异鲁米诺衍生物标记的呋喃妥因代谢物半抗原。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述的异鲁米诺发光标记物是ABEI、 AHEI 或 ABEN。
6.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒还包括标准液、 质控品和浓缩洗液。
7.根据权利要求1-3之一所述的试剂盒，其特征在于所述的荧光素标记物是FITC标记的呋喃妥因代谢物单克隆抗体。
8.一种利用权利要求1-7任一项所述的试剂盒检测呋喃妥因代谢物的方法，包括下列步骤1)分别吸取20μ 1-100 μ 1标准品或样本，然后加入20 μ 1-100 μ 1发光标记物，再加 20 μ 1-100 μ 1荧光素标记物，充分混勻后，37°C温育15min ；2)加入包被有羊抗FITC单克隆抗体的顺磁性纳米微珠80-150μ1，混勻后在37°C温育 5min ；3)用磁分离架分离5min，弃上清后用清洗液300-500μ 1冲洗复合物沉淀；4)上述清洗步骤重复2-4次；5)4)所得分离好的复合物直接放入测量暗箱，加入激发底物1和激发底物2，延迟3- 后检测发出的相对光强度(RLU)，样本中呋喃妥因代谢物的含量与RLU成一定比例关系，可以通过RLU集合标准曲线法计算呋喃妥因代谢物的浓度。
全文摘要
本发明涉及检测呋喃妥因代谢物的磁颗粒化学发光试剂盒，包括的试剂有发光标记物、荧光素标记物、标准品、质控品、分离试剂。发光标记物是异鲁米诺发光标记物标记的呋喃妥因代谢物半抗原，荧光标记物是指荧光素或其衍生物标记的呋喃妥因代谢物单克隆抗体，分离试剂是指包被有羊抗FITC单克隆抗体的顺磁性纳米微珠。本发明还涉及一种采用所述的试剂盒检测动物源性食品中呋喃妥因代谢物的方法，本方法对呋喃妥因代谢物检测具备较高的灵敏度、特异性和较快的检测速度。
文档编号G01N33/533GK102565032SQ20101059023
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月15日 优先权日2010年12月15日
发明者万宇平, 何方洋, 冯才伟, 刘平, 张丽杰, 杨秀贤, 赵正苗 申请人:北京勤邦生物技术有限公司
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