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专利名称：检测单细胞特异性抗体分泌的细胞微孔芯片及其制备方法
技术领域：
本发明建立了一种可以在单细胞水平上高通量检测表达或分泌特异性标志分子的细胞的微孔芯片。这ー芯片适合鉴定、分析B细胞(来源于人或其他脊椎动物)、杂交瘤细胞(鼠源或人源)或分泌抗体的工程细胞等在单细胞水平上特异性抗体的分泌情况，另外还可用于检测癌细胞表面标志分子以及评价药物筛选中药物对细胞功能的影响等，制备方便，价格经济，操作简单。
背景技术：
微阵列芯片(Microarray Chip)研究起始于20世纪80年代末,是指以高密度阵列为特征，将核酸探针、蛋白质探针等以极高的密度固定在经过微细加工的固相表面上，通过荧光以进行高通量的筛选研究[I]。根据所阵列探针种类的不同，微阵列芯片可分为基因芯片、蛋白质芯片以及细胞芯片等。基因芯片和蛋白质芯片目前已经被广泛应用于基因表 达差异研究、遗传学研究、蛋白质组学研究等生命科学的研究中[2]。细胞芯片技术是以活细胞作为研究对象的ー种生物芯片技术，其既保持传统的细胞研究方法的优点如原位检测等，又满足了高通量获取活细胞信息等方面的要求[3]。细胞芯片技术可以高通量分析细胞的多种生理现象及分子机制，具有传统方法不可比拟的优势。目前的细胞芯片技术一般指运用物理学、化学原理在芯片上完成对特异性细胞的捕获、固定、培养等精确操作，并通过对不同信号的分析实现对细胞特定生理指标的检测和性质分析。细胞免疫芯片是细胞芯片的重要种类，其原理主要基于抗原或抗体的固相化、抗原抗体特异性反应及抗原或抗体的检测方法(如荧光标记、酶标记及放射标记等)，以实现对特定细胞标志分子的精确检測，细胞免疫芯片具有特异性好、通量高、操作方便等优点，已经被广泛应用于新药筛选、免疫诊断、肿瘤靶标抗原分析等研究領域[3]。目前的细胞免疫芯片主要的设计思路为以玻片为基底，通过不同方法活化并标记上抗体或抗原，形成蛋白微阵列芯片，然后将细胞悬液和微阵列孵育并洗去非特异性结合的细胞，再通过不同的标记方法检测特异性结合在芯片上的细胞。其实质还是固相蛋白芯片的设计思路和原理，只不过将待测样品中的研究对象换为了细胞。这ー设计无法实现细胞的精确控制，不能在单细胞水平上检测细胞某特定生理指标(如抗体分泌)的情況。此夕卜，目前被广泛使用的另ー种重要的细胞分析方法流式细胞技术(FACS)，虽然可以分析出某细胞群落中特定细胞所占的比例，但是也无法在单细胞水平上高通量的实现对某个细胞特定指标的原位观察和分析。在抗体工程的相关研究中，在单细胞水平上，尤其是在活体细胞中检测其分泌特异性抗体的情况是十分需要的。对于一群细胞，如杂交瘤细胞、抗体工程细胞等，如何高通量地在其中寻找到分泌抗体亲和カ最高、分泌量最大的细胞，对于后续的杂交瘤克隆筛选或者工程抗体高表达细胞株的构建等都具有极其重要的意义。另外，单细胞水平上特异性抗体的检测对于研究B细胞群落中特定抗体分泌细胞的具体情况，对于某些天然存在的极少量的有特殊价值的B细胞(如分泌针对某些独特表位抗体的B细胞)的筛选和获得等也是十分需要的。目前，国际上已经有几种可以在单细胞水平上高通量分析细胞某特定生物学指标变化的细胞微孔芯片出现。如Biran等制作了通过光成像技术在单细胞水平上检测细胞某生理指标变化(如基因表达差异)的细胞微孔芯片[4] ,Deutsch等也研发了类似的单细胞高通量检测芯片[5]。但是，检测细胞分泌抗体情况的细胞微孔芯片产品国际上目前研究的还比较少。日本富山大学科研人员研制的抗体检测微孔芯片，采用微机电系统加工制作，首先用热氧化技术在硅片表面生长出ー层ニ氧化硅薄膜，将利用光刻技术制作的微孔模型覆盖于ニ氧化硅薄膜表面，利用氢氟酸溶剂处理制备微孔芯片，并在其表面加工出氟碳聚合物。其芯片孔径适合容纳单ー B细胞，并且通量达到234000孔/片。该芯片通过检测抗原刺激后，细胞内Ca2+变化情况或者直接荧光标记待测抗原并与细胞表面受体结合从而确定针对某抗原抗体的分泌细胞[6，7]。通过显微操作技术可以获取目的细胞并进行PCR，获得特异性抗体基因。

发明内容

本发明首次使用光刻技术制备细胞微孔芯片模板，然后灌注聚ニ甲基硅氧烷(PDMS)材料，制成细胞培养阵列芯片，实现每个细胞单独处于ー个阵列小室并进行培养。生物相容性材料PDMS作为细胞微孔芯片的制备材料，同硅片材料比较，其优点是生物相容性好，无毒，透气性佳，适合细胞生存，容易被锻造成任何形状，且制备方便，价格经济，操作简单。与原有技术比较，Love等使用PDMS制成直径100 μ m细胞芯片，接种杂交瘤细胞 系，使用蛋白芯片法进行检测杂交瘤细胞抗体特异性[8]。此方法存在以下缺陷第一，微孔直径过大，不能实现每个微孔为单细胞的要求；第二，使用蛋白芯片法检测，必须使用蛋白芯片扫描仪，对仪器要求很高。Tokimitsu和Tajiri等使用娃片制成细胞微孔阵列,筛选特异性抗体分泌细胞[6，7]。此方法制备细胞微孔芯片成本高，制作过程复杂，并且每个硅片芯片只能使用一次。本发明使用PDMS制备的细胞微孔芯片，只需要制备ー个模板，就能灌注出任意多的细胞芯片。并且微孔直径略大于单个细胞的尺寸，保证每个孔为单细胞；在微孔芯片中原位检测单个细胞抗体分泌，检测仪器只需要荧光显微镜即可。总体表明，本发明在芯片制作方面成本低，操作简单，模板能重复利用，能实现在単独的小室内对单个细胞原位进行抗体检测，检测方法简便易行。另外，本发明还摸索了适合杂交瘤、B细胞、癌细胞等不同大小细胞的微孔孔径，增强了芯片的针对性，细胞铺于微孔中，其单细胞率可以达到80%。本发明采用荧光原位检测法检测细胞分泌抗体的特异性，首先在微孔中包被抗人(或其他物种)IgG抗体，用于捕获待测细胞分泌的抗体，封闭之后，加入细胞，分别用生物素标记的待测抗原和亲和素标记的突光素和微孔杂交，在突光显微镜下通过检测细胞表面或者微孔内部的突光信号强度，从而确定该单个细胞抗体表达的情况(同时有非特异性活体细胞标记染料Calcein-AM确定孔中是否有细胞)。该方法既可以检测细胞表面受体对特定抗原的结合情况，也可以检测细胞分泌出的抗体对目的抗原的结合情况，满足了对不同细胞的检测要求。此方法操作简便，特异性好，灵敏度高，可以区分抗体表达量，是ー种十分有效的原位检测单细胞抗体分泌的方法。本发明在确定单个目的细胞后，还可以通过显微操作技术方便地取出目的细胞，进行后续操作和实验，实用性強。另外，通过在免疫荧光检测方法中运用不同的抗特异性癌细胞标志分子或其他有重要生物学意义的标志分子的抗体，本方法还可用于检测癌细胞表面标志分子以及评价药物筛选中药物对细胞功能的影响等。因此，本发明第一方面提供ー种细胞微孔芯片，所述芯片微孔的直径在30μπι以下，深度在30 μ m以下。在一具体实施例中，所述芯片微孔的直径在20 μ m以下，深度在20 μ m以下。在一具体实施例中，所述微孔的直径为5 20 μ m，所述深度为5 20微米。在一具体实施例中，所述芯片材料为生物相容性聚合物材料。在一具体实施例中，所述生物相容性聚合物材料为聚ニ甲基硅氧烷。 本发明第二方面提供ー种在细胞水平检测抗体表达的方法，所述方法包括(I)提供本发明所述的细胞微孔芯片；(2)将细胞接种到所述细胞微孔芯片上；(3)用标记的抗体检测试剂与微孔杂交；和(4)通过检测细胞表面或微孔内部的标记信号強度，确定微孔中细胞抗体表达的情况，实现抗体表达的检測。在一具体实施例中，所述方法还包括在细胞接种前，在芯片的微孔中包被捕获抗体或抗原，用于捕获待测细胞表达的抗体。在一具体实施例中，所述标记的抗体检测试剂为标记的细胞表达抗体的抗原或ニ抗和/或标记的荧光素。在一具体实施例中，所述抗原或ニ抗使用生物素标记，所述荧光素使用亲和素标 记。在一具体实施例中，所述接种细胞为杂交瘤细胞或B细胞或分泌抗体的工程细胞。在一具体实施例中，所述方法还包括同时用非特异性活体细胞标记染料Calcein-AM确定微孔中是否有细胞。在一具体实施例中，本发明的在细胞水平检测抗体表达的方法包括(I)提供本发明所述的细胞微孔芯片；(2)在芯片的微孔中包被捕获抗体，用于捕获待测细胞分泌的抗体；(3)将细胞接种到所述细胞微孔芯片上，使每个微孔中仅含有I个细胞；(4)用标记的待测抗原和标记的突光素与微孔杂交；和(5)在显微镜下通过检测细胞表面或微孔内部的荧光信号強度，确定该单个细胞抗体表达的情況，实现抗体表达的检測。本发明第三方面提供ー种检测细胞靶标的方法，所述方法包括(I)提供本发明所述的细胞微孔芯片；(2)将细胞接种到所述细胞微孔芯片上；(3)用标记的靶标检测试剂与微孔杂交；和(4)通过检测微孔中的标记信号，确定细胞靶标。在一具体实施例中，所述方法还包括在细胞接种前，在芯片的微孔中包被捕获细胞或细胞靶标的试剂。在一具体实施例中，所述的细胞靶标包括但不限于细胞分泌的蛋白或小分子化合物，细胞表面蛋白等。在一具体实施例中，所述的靶标检测试剂含有与靶标结合的物质，选自抗原、抗体、受体和配体。在一具体实施例中,所述的标记为突光标记。在一具体实施例中,所述的细胞包括但不限于杂交瘤细胞、B细胞、分泌抗体的エ程细胞、肿瘤细胞和胰岛细胞。在一具体实施例中，所述方法还包括同时用非特异性活体细胞标记染料Calcein-AM确定微孔中是否有细胞。本发明第四方面提供ー种药物筛选方法，所述方法包括 (I)提供本发明所述的细胞微孔芯片；(2)将细胞接种到所述细胞微孔芯片上，其中，所述待测细胞是经药物处理的细胞；(3)用标记的靶标检测试剂与微孔杂交，和(4)通过检测微孔中的标记信号，确定该经药物处理的细胞中所述靶标的表达，从而筛选出对所述细胞中所述靶标的表达产生影响的药物。在一具体实施例中，所述方法还包括同时用非特异性活体细胞标记染料Calcein-AM确定微孔中是否有细胞。在一具体实施例中，本发明的药物筛选方法包括(I)提供本发明所述的细胞微孔芯片；(2)在芯片的微孔中包被特异性针对靶标的单克隆抗体；(3)将待测细胞接种到所述细胞微孔芯片上，使每个微孔中仅含有I个细胞，其中，所述待测细胞是经药物处理的细胞；(4)用标记的抗靶标的抗体与微孔杂交，染色；和(5)在显微镜下通过检测细胞表面或微孔内部的荧光信号強度，确定该该经药物处理的细胞中所述靶标的表达，从而筛选出对所述细胞中所述靶标的表达产生影响的药物。本发明还包括本发明细胞微孔芯片在检测癌细胞表面标志分子以及评价药物筛选中药物对细胞功能的影响中的应用。


图I :细胞微孔芯片模板。图2 :细胞微孔芯片制作流程示意图。图3 :细胞芯片(a)细胞芯片模具；(b)细胞芯片；(C)细胞芯片显微照片。图4 :明场下细胞芯片中的细胞。图5 :细胞芯片中单细胞(a)杂交瘤细胞(b)小鼠脾脏细胞(每个绿点代表ー个活细胞)。图6 :对照组杂交瘤细胞抗体检测(a) Calcein-AM细胞染色；(b)HA_Cy3染色；(C)Merge。图7 :阳性杂交瘤细胞S-95-7抗体检测(a) Calcein-ΑΜ细胞染色；(b)HA_Cy3染色；(c)Merge。图8 :对照组小鼠脾脏细胞抗体检测(a) Calcein-ΑΜ细胞染色；(b)HA_Cy3染色；(c)Merge。图9 :阳性HA DNA疫苗免疫小鼠脾脏细胞抗体检测(a) Calcein-ΑΜ细胞染色；(b)HA-Cy3 染色；(c)Merge。图10 :微流控芯片小孔内的单个乳腺癌细胞。图11 :毛细管捕获微流控芯片上的单细胞。
具体实施例方式本发明的细胞微孔芯片可采用各种生物相容性聚合物材料制备。聚ニ甲基硅氧烷(PDMS)是ー种广泛应用于微流体等领域的聚合物材料，是ー种生物相容性材料，无毒，透气性较好，适合细胞生存。因此，在优选的实施例中，使用聚ニ甲基硅氧烷材料制备本发明的细胞微孔芯片。本申请以PDMS为例进行说明，但应理解，本发明并不限于PDMS。通常，可先采用本领域常规的光刻技术制备细胞微孔芯片模板，然后灌注生物相容性聚合物材料，制成细胞培养阵列芯片。光刻技术是半导体エ业化技术，包括旋涂(甩胶)光刻胶、前供、紫外曝光、后烘和显影等步骤。在一优选实施例中，本发明微孔的深度由光刻时旋涂光刻胶的厚度来決定。可按照需要制备该模板，从而使得该模板的微孔数量、微孔之间的间距、微孔的深度和直径等满足所需要求。制备得到模板后，可对其表面进行疏水化处理，目的是使得PDMS固化以后容易从模具表面分离。可采用本领域周知的各种疏水化处理方式。在一优选实施例中，本发明采用喷涂疏水性的硅烷的方式进行疏水化处理。 可配制含有生物相容性聚合物材料的胶，例如，可取市售获得的Siliconeelastomer base 和 SYGARD 184 silicone elastomer curing agent (购于陶氏化学)以10 I的质量比配制含PDMS的胶。应理解，可根据实际需要选用不同的市售产品来配制该含PDMS的胶，且该质量比也可根据实际需要而变化，例如可在7 : I 13 : I的范围之内。然后将配制好的PDMS胶倾倒在模具上。在一优选实施例中，通过抽真空的方式赶走配制时溶于PDMS的空气。之后，可在常温下使PDMS胶固化。或者也可将PDMS胶置于烘箱进行烘烤，待其完全固化后取出。烘烤的方式可以大大缩短固化时间。将PDMS与模具分离，即可获得本发明的细胞微孔芯片。而模具可多次反复使用。图1、2显示了本发明制备细胞微孔芯片的流程。为实现单细胞目的，本发明细胞微孔芯片的微孔的直径和深度必须略大于细胞直径。通常，杂交瘤细胞的直径为16-18 μ m，原代B细胞直径为6-8 μ m。因此，设计微孔芯片直径为30 μ m以下,深度为30 μ m以下。在优选的实施例中，微孔芯片中微孔的直径为25 μ m以下，深度为25 μ m以下。
在另ー优选实施例中，微孔芯片的微孔直径为30 μ m以下，深度为25 μ m以下。在另ー优选实施例中，微孔芯片的微孔直径为25 μ m以下，深度为30 μ m以下。在另一优选实施例中，微孔芯片的微孔直径为6 30 μ m,深度为6 30 μ m。在另ー优选实施例中，微孔芯片的微孔直径为10 30 μ m，深度为10 30 μ m。在另ー优选实施例中，微孔芯片的微孔直径为10 25 μ m，深度为10 25 μ m。在另一优选实施例中，微孔芯片的微孔直径为25 μ m以下。在另ー优选实施例中，微孔芯片的微孔深度为25μπι以下。在另一优选实施例中，微孔芯片的微孔直径为20 μ m以下,例如5 20 μ m、10 20 μ m不等；微孔芯片的微孔深度也为20 μ m以下，例如5 20 μ m、10 20 μ m不等。 本发明细胞微孔芯片中微孔的直径和深度不需要相等，只要在上述限定的范围内即可。对本发明细胞微孔芯片上微孔的数量无特殊限制，通常其数量可在10 10000的范围之内。孔与孔之间的距离也无特殊限制，通常为两倍微孔直径。在获得本发明的细胞微孔芯片后，可对其实施灭菌处理和亲水化处理。可采用常规的方法实施灭菌处理，例如通过高温高压实现灭菌。在一具体实施例中，将本发明的细胞微孔芯片粘附于玻片上，放入耐高温的盒子，在121°C放置30分钟，从而实现灭菌处理。可采用本领域多种常规的方式进行亲水化处理，例如，亲水硅烷处理、氧等离子处理等。在一优选实施例中，本发明通过将芯片放置于氧等离子体处理I分钟的方式实现亲水化处理。通过以上处理，细胞微孔芯片是无菌的，并且表面具有亲水性。由于灭菌和亲水化处理都具有时效性，处理完的芯片通常需要在12小时内使用。在其它优选实施方式中，可使用各种连接分子包被本发明细胞微孔芯片的微孔表面。所述连接分子包括各种生物活性分子，包括但不限于抗原或其活性片段、抗体或其活性片段等。在优选的实施例中，本发明提供ー种在细胞水平检测抗体表达的方法，所述方法包括 (I)提供本发明所述的细胞微孔芯片；(2)在芯片的微孔中包被捕获抗体，用于捕获待测细胞分泌的抗体；(3)将细胞接种到所述细胞微孔芯片上，使每个微孔中仅含有I个细胞；(4)用标记的待测抗原和标记的突光素与微孔杂交；和(5)在显微镜下通过检测细胞表面或微孔内部的荧光信号強度，确定该单个细胞抗体表达的情況，实现抗体表达的检測。所述捕获抗体是各种抗特异性癌细胞标志分子或其他有重要生物学意义的标志分子的抗体，所述方法用于检测癌细胞表面标志分子。这类表面标志分子包括但不限于
癌细胞表面标志
急性髓细胞白血病 CD123, CD45等
权利要求
1.一种细胞微孔芯片，其特征在于，所述芯片微孔的直径在30 y m以下，深度在30 y m以下。
2.如权利要求I所述的细胞微孔芯片，其特征在于，所述芯片微孔的直径在20i!m以下，深度在20iim以下。
3.如权利要求I 2中任一项所述的细胞微孔芯片，其特征在于，所述生物相容性聚合物材料为聚二甲基硅氧烷。
4.一种在细胞水平检测抗体表达的方法，其特征在于，所述方法包括 (1)提供权利要求I 3中任一项所述的细胞微孔芯片； (2)将细胞接种到所述细胞微孔芯片上； (3)用标记的抗体检测试剂与微孔杂交；和 (4)通过检测细胞表面或微孔内部的标记信号强度，确定微孔中细胞抗体表达的情况，实现抗体表达的检测。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在细胞接种前，在芯片的微孔中包被捕获抗体或抗原，用于捕获待测细胞表达的抗体。
6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述标记的抗体检测试剂为标记的细胞表达抗体的抗原或二抗和/或标记的荧光素。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述抗原或二抗使用生物素标记，所述荧光素使用亲和素标记。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述接种细胞为杂交瘤细胞或B细胞或分泌抗体的工程细胞。
9.一种检测细胞靶标的方法，其特征在于，所述方法包括 (1)提供权利要求1-3中任一项所述的细胞微孔芯片； (2)将细胞接种到所述细胞微孔芯片上； (3)用标记的靶标检测试剂与微孔杂交；和 (4)通过检测微孔中的标记信号，确定细胞靶标。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在细胞接种前，在芯片的微孔中包被捕获细胞或细胞祀标的试剂。
11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的细胞靶标包括但不限于细胞分泌的蛋白或小分子化合物，细胞表面蛋白等。
12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的靶标检测试剂含有与靶标结合的物质，选自抗原、抗体、受体和配体。
13.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的标记为荧光标记。
14.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的细胞包括但不限于杂交瘤细胞、B细胞、分泌抗体的工程细胞、肿瘤细胞和胰岛细胞。
15.—种药物筛选方法,其特征在于,所述方法包括 (1)提供权利要求1-3中任一项所述的细胞微孔芯片； (2)将细胞接种到所述细胞微孔芯片上，其中，所述待测细胞是经药物处理的细胞； (3)用标记的靶标检测试剂与微孔杂交，和 (4)通过检测微孔中的标记信号，确定该经药物处理的细胞中所述靶标的表达，从而筛选出对所述细胞中所述靶标的表达产生影响的药物。
16.如权利要求4-15中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括同时用非特异性活体细胞标记染料Calcein-AM确定微孔中是否有细胞。
全文摘要
本发明建立了一种可以在单细胞水平上高通量检测分泌特异性抗体细胞的细胞微孔芯片。这一芯片适合鉴定、分析B细胞(来源于人或其他脊椎动物)、杂交瘤细胞(鼠源或人源)或分泌抗体的工程细胞等在单细胞水平上特异性抗体的分泌情况，并找出特异性好、亲和力高、分泌量大的单个抗体分泌细胞，且制备方便，价格经济，操作简单。
文档编号G01N33/68GK102680679SQ20111006278
公开日2012年9月19日 申请日期2011年3月15日 优先权日2011年3月15日
发明者孙兵, 王战会, 边超, 陈坦, 陈爱中, 马轶凡 申请人:中国科学院上海生命科学研究院, 中国科学院深圳先进技术研究院