专利名称：一种分离柱与喷针一体化的毛细管柱装填和塞子制作方法
技术领域：
本发明涉及一种分离柱与喷针一体化的毛细管柱装填和塞子制作方法，属于色谱、质谱 分析领域。
背景技术：
近年来，随着蛋白组学研究的快速发展，微毛细管液相色谱-电喷雾离子化质谱 (nano-LC-ESI-MS)获得越来越广泛的应用。微毛细管液相色谱使用内径20 300微米的分 离柱，对应的流动相流量一般在每分钟几十纳升到几百纳升。从毛细管分离柱洗脱的组分被 电喷雾喷针(内经为十几微米的锥形管)离子化，然后通过电场被引入质谱。对于液相色谱 分离柱(包括毛细管液相色谱分离柱和普通的液相色谱分离柱)， 一般都要在柱末端使用一个 塞板/塞子，以阻挡柱内填充的色谱填料，防止其泄露。目前，在毛细管液相色谱和毛细管 电色谱中使用的塞子主要有烧结塞子、凝胶一溶胶塞子、有机聚合物塞子、磁性粒子塞子、 单粒子塞子、不锈钢塞子和Teflon膜塞子。
在nano-LC-ESI-MS中，通常使用一个零死体积二通将带有上述塞子的微毛细管分离柱与 电喷雾喷针联接在一起；然而，即使是零死体积二通，仍然会引入柱外效应，导致色谱峰展 宽。将分离柱与电喷雾喷针集成在一起(即将微毛细管柱的一端拉细为锥形作为电喷雾喷针)， 利用填充在毛细管锥形口的填料自组装成一个"拱桥"塞子，阻挡柱内填充的填料，可以有效 避免使用联接二通引起的色谱峰展宽。然而，这种毛细管柱的一个缺点是当毛细管柱内没 有流动相时，在毛细管锥形口形成的"拱桥"塞子的填料会发生重排流失，导致毛细管分离柱 内填料泄漏。有研究者将硅胶整体柱和聚苯乙烯整体柱与电喷雾喷针集成在一起，构成一体 化的毛细管柱，获得了比较好的分离效果，但是，这种一体化毛细管柱制作步骤非常繁琐， 并且由于整体柱固有的低样品负载量，限制了他们的应用。
综上所述，为了保证毛细管分离柱有足够的样品负载量，应使用填充色谱填料的毛细管 分离柱，为了尽可能降低柱外谱带展宽，应使用分离柱与电喷雾喷针一体化的毛细管柱，然 而，目前面临的问题是没有非常有效的分离柱与电喷雾喷针一体化的毛细管柱装填和塞子制 作方法。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种分离柱与喷针一体化的毛细管柱装填和塞子制 作方法。
1. 分离柱与喷针一体化的毛细管柱装填方法，如图l所示。本装填方法属于低压匀浆法， 适合于一端拉细为锥形石英毛细管柱的装填。用有机溶剂将色谱填料配成一定浓度的匀浆液，
盛有匀浆液的离心管置于匀浆罐里；将毛细管柱一端穿过匀浆罐盖子插入匀浆液，用四个螺 丝将匀浆罐与匀浆罐盖子密封；打开减压阀，在氮气压力作用下，匀浆液缓慢进入毛细管柱， 并最终充满毛细管柱；将氮气压力缓慢降为零，卸下毛细管柱，通过一个微二通将毛细管柱 联接到液相色谱泵上，利用液相色谱泵产生的高压流动相将毛细管柱内的色谱填料压实，如 图2所示。 .
上述色谱填料是正相色谱填料、反相色谱填料、离子交换色谱填料中的一种，填料的粒 径为3 10微米。为了防止色谱填料在装填过程中沉降，在匀桨液中放置一个搅拌子，将整 个匀浆罐放置在一个磁力搅拌器上，搅拌器的速度控制在100 200r/min。
在氮气压力F，匀浆液缓慢向毛细管柱锥形口方向移动，当到达毛细管柱锥形口时，匀 浆溶剂从锥形口流出，而色谱填料在锥形口停留下来形成"拱桥"塞子，阻挡后面的填料向前 移动。由于匀浆罐内匀浆液不停向上移动，色谱填料逐渐充满毛细管柱。在刚开始装填时， 使用较小的氮气压力，防止填料移动过快导致毛细管锥形口色谱填料填充不理想，此后，随 着填充长度的增加，氮气压力逐渐增加到1 MPa。
在使用氮气压力将色谱填料压入毛细管柱时，可以使用权利要求3中所述填料的一种一 次性将毛细管柱填满，也可以分段填充，即前段填充反相色谱填料，后段填充离子交换色谱 填料，或者前段填充反相色谱填料，中间段填充离子交换色谱填料，后段填充反相色谱填料; 填料的选择可以是所述3种填料之间的任意组合，从而获得具有不同分离性质的毛细管柱。
使用液相色谱泵产生的高压流动相压实毛细管柱内色谱填料时，最大压力介于15MPa和 20MPa之间，既保证将填料压得紧密、结实，获得高柱效，又防止压力过大损坏色谱填料。
2. 分离柱与电喷雾喷针一体化的毛细管柱塞子制作方法，如图3所示。本方法属于烧结 色谱填料法制作塞子，适合于一端拉细为锥形的石英毛细管柱。将一根不锈钢管套在已经填 充色谱填料的毛细管柱上，用一个不锈钢三通将毛细管柱与液相色谱泵联结，泵保持一定流 速的流动相；将毛细管锥形口从不锈钢管伸出一定长度，用火焰烧结毛细管锥形口处的色谱 填料，形成烧结塞子。
色谱填料在氮气作用下填充毛细管柱时，填料在毛细管锥形口会形成一个自组装塞子(由 于拱桥效应)，阻挡后面的填料泄露，但是该塞子不稳定。通过烧结锥形口处的色谱填料，可以使自组装塞子变成一个非常稳定的烧结塞子。为控制烧结塞子的长度和防止在烧结时损坏 毛细管柱内色谱填料，使用一个不锈钢保护管套在毛细管柱上。同时，在烧结色谱填料时， 为了防止过度烧结，毛细管柱内保持一定流速的流动相。
本发明的分离柱与喷针一体化的毛细管柱装填方法具有以下优点(1)装填过程简单，
从减压阀出来的氮气压力最大为1 MPa，操作安全；(2)装填过程不需特殊仪器、设备，实
现起来非常容易；(3)装填毛细管柱的成功率很高，在90%以上；(4)装填的毛细柱分离重 现性好；(5)装填的毛细柱柱效高。
本发明的分离柱与喷针一体化的毛细管柱塞子制作方法具有以下优点(1)操作非常简 单、快速，平均每个塞子的制作时间小于3分钟；(2)不需要特殊仪器、设备和试剂，普通 的液相色谱分析实验室就可以实现；(3)制作成本非常低，(4)塞子的体积很�。苑掷朊� 有影响；(5)塞子对样品没有吸附作用，不会引入柱外色谱峰展宽。
图l.分离柱与电喷雾喷针一体化的毛细管柱的装填示意图。(a)，毛细管柱插入匀浆罐准 备装填；(b)色谱填料快要装填满毛细管柱。ll.毛细管柱锥形口， 12.毛细管柱，13.密封用 螺丝，14.匀浆罐盖子，15.装运浆液的离心管，16.色谱填料匀浆液，17.磁子，18.匀浆罐， 19.磁力搅拌器，110.氮气传输管，lll.氮气瓶，112.毛细管内填充的色谱填料，113.毛细管锥
形口处的填料。
图2.使用液相色谱泵压实填充的毛细管柱的示意图。21.液相色谱泵输液管，22.流动相， 23.微三通，24.毛细管柱，25.毛细管柱内填充的色谱填料，26.毛细管柱锥形口的色谱填料， 27.微三通分流毛细管。
图3.分离柱与喷针一体化的毛细管柱塞子制作过程示意图。31.液相色谱泵输液管，32.流 动相，33.微三通，34.毛细管柱，35.毛细管柱内填充的色谱填料，36.不锈钢管，37.毛细管柱 锥形口的色谱填料，38.丁烷喷枪，39.丁垸喷枪内焰，310.丁烷喷枪外焰，311.微三通分流毛 细管。
图4.本发明制作的分离柱与喷针一体化的毛细管柱塞子图片。41.塞子，42.色谱填料， 43.毛细管壁。
图5.使用本发明装填/制作的分离柱与喷针一体化的毛细管柱分析牛血清白蛋白(BSA) 胰蛋白酶切肽段的色谱图(三次平行分析)。
图6.自组装塞子的毛细管柱分析牛血清白蛋白(BSA)胰蛋白酶切肽段的色谱图(三次 平行分析)。条件同图5。
具体实施例方式
实施例1
分离柱与电喷雾喷针一体化的毛细管柱的装填用5 mL离心管15配制2 mL-5 mg/mL-5 pm的d8反相填料一甲醇匀浆液，内放置磁子17;将离心管放入到匀浆罐18里，匀浆罐放 置在磁力搅拌器19上，保持200r/min的转速；内径75pm、锥形口内径15nm，长度12 cm 毛细管柱12按图1所示插入匀浆液16中，用密封螺丝13将匀浆罐密封�。淮蚩跹估� 调节氮气压力为0.1MPa;在氮气压力下，填料缓慢向毛细管柱锥形口方向移动，2小时后， 填料充满毛细管柱，在此过程中，逐渐增加氮气压力至1 MPa;将毛细管柱从匀浆罐取下来， 用微三通23将毛细管柱联接到液相色谱泵上，微三通一端联接有内径250)im、 50cm长的分 流毛细管；液相色谱泵的流动相保持0.001 mL/min， 0.002 mL/min， 0.005 mL/min, 0.01 mL/min, 0.02 mL/min， 0.03 mL/min各30分钟，在此过程中，液相色谱泵压力最大为15 MPa;将流动 相流速降为零，从微三通上卸下毛细管柱，获得分离柱与电喷雾喷针一体化的毛细管柱。
实施例2
分离柱与喷针一体化的毛细管柱塞子的制作将一根长3cm、内径0.5mm、外径1.6mm 的不锈钢管套在实施例1填充的毛细管柱上，使用微三通33将毛细管柱34与液相色谱泵联 结，微三通一端联接内径250 (im、50 cm的分流毛细管；液相色谱泵的流动相保持O.Ol mL/min; 将毛细管柱锥形口从不锈钢管伸出0.25毫米，用火焰烧结毛细管锥形口的填料，形成长度为 0.25mm的烧结塞子；将流动相流速降为零，卸下毛细管柱。
实施例3
按照实施1和2制备的分离柱与喷针一体化的毛细管柱和塞子用于实际样品分析，结果如 图5所示。作为对比，在同样条件下，使用自组装塞子毛细管柱分析同样的样品，结果如图 6所示。对比两个图，可以看出，本发明制备的分离柱与喷针一体化的烧结塞子毛细管柱具 有更好的分离效果。
色谱条件流动相A, 0.1%甲酸一2%乙腈，流动相B， 0.1%甲酸一80%乙腈；90min内 流动相B从5%线性增加到50%,然后10 min内流动相B线性增加100%,流速200 nL/min。 质谱条件"&=400 1600全扫描， 一个全扫描完成后选择6个最强峰进行二级扫描。仪器: 戴安公司nano-LC-Packing色谱耦合热电线性离子阱质谱(LTQ)。样品lpmol的牛血清白 蛋白(BSA)的胰蛋白酶切肽段。
权利要求
1.一种分离柱与喷针一体化的毛细管柱装填方法，包括以下步骤(1)配制5mg/mL的色谱填料匀浆液，置于匀浆罐里；(2)向匀浆罐中匀浆液放入一个磁子；(3)在搅拌情况下，使用0.1～1MPa的氮气将匀浆液反向压入毛细管柱；(4)将毛细管柱连接到液相色谱泵上，用流动相压实毛细管柱内的色谱填料。
2. 根据权利要求1所述的装填方法，其特征在于所述毛细管柱为内径20 300微米 的石英毛细管柱，毛细管柱一端为逐渐变细的锥形口，锥形口内径为10 30微米；所述 锥形口作为毛细管柱的喷针。
3. 根据权利要求1所述的装填方法，其特征在于所述色谱填料是正相色谱填料、反相色谱填料、离子交换色谱填料中的一种，填料的粒径为3 10微米。
4. 根据权利要求1所述的装填方法，其特征在于所述匀浆液的溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、丙酮和氯仿等与填料密度接近、对填料没有损害的有机溶剂。
5. 根据权利要求1所述的装填方法，其特征在于在使用0.1 1 MPa的氮气将匀浆液反向 压入毛细管柱步骤，可以使用权利要求3中的一种填料一次性将毛细管柱填充满，也可以 分段填充，前段填充反相色谱填料，后段填充离子交换色谱填料，或者前段填充反相色谱填料，中间段填充离子交换色谱填料，后段填充反相色谱填料；填料的选择可以是所述3种填料之间的任意组合。
6. 根据权利要求1所述的装填方法，其特征在于所述液相色谱泵运行流动相流速台阶梯度，每个台阶梯度保持30 60min，压实毛细管柱内色谱填料；所述流动相流速台阶梯度获得 的最大柱头压力大于15MPa、小于20MPa;所述的流动相为甲醇、乙腈、乙醇中的一种。
7. 根据权利要求l所述的装填方法，其特征在于使用一个微三通将毛细管柱与液相色谱泵 连接；所述微三通一端连接有分流毛细管，用于液相色谱泵的快速卸压。
8. —种按权利要求1装填的毛细管柱，其特征在于所述毛细管柱为石英毛细管柱，内径为 20 300微米， 一端为内径10 30微米的锥形口，柱内填充3 10微米的色谱填料；所 述毛细管柱主要应用于毛细管液相色谱一电喷雾质谱分析。
9. 一种分离柱与喷针一体化的毛细管柱塞子制作方法，包括以下步骤(1) 将一根不锈钢管套在根据权利要求1填充的毛细管柱上；(2) 使用一个微三通，将毛细管柱与液相色谱输液泵连接，流动相保持0.01 0.02 mL/min的流速；(3) 将毛细管柱锥形口从不锈钢管伸出0.2 0.5毫米，用火焰烧结毛细管锥形口的填 料，形成塞子。
10. 根据权利要求9所述的塞子制作方法，其特征在于所述不锈钢管作为保护管，用来控制 塞子的长度和保护塞子后面的色谱填料，不锈钢管的内径等于或稍大于毛细管柱的外径。
11. 根据权利要求9所述的塞子制作方法，其特征在于所述毛细管柱锥形口的内径为为10 30微米。
12. 根据权利要求9所述的塞子制作方法，其特征在于所述色谱填料是正相色谱填料、反相色谱填料、离子交换色谱填料中的一种，填料的粒径为3 10微米。
13. 根据权利要求9所述的塞子制作方法，其特征在于用火焰烧结填充在毛细管柱锥形口的色谱填料形成，形成塞子。
14. 根据权利要求9所述的塞子制作方法，其特征在于所述的火焰为丁烷火焰的外焰，也可以是其它温度介于丁烷外焰温度范围内的其它火焰。
15. 根据权利要求9所述的塞子制作方法，其特征在于用火焰烧结毛细管锥形口色谱填料时， 流动相保持0.01 0.02mL/min的流速，防止填料过度烧结；所述的流动相是甲醇、乙醇、 乙腈中的一种。
16. —种按权利要求9制备的毛细管柱塞子，其特征在于所述塞子为烧结塞子，位于毛细管柱的锥形口，长度为0.2 0.5mm;塞子具有惰性，对样品没有吸附，不会引入柱后效应。
全文摘要
本发明涉及一种分离柱与喷针一体化毛细管柱装填和塞子制作新方法。将色谱填料配成一定浓度的匀浆液，通过一定压力的氮气将匀浆液反向压入毛细管柱进行填充；所述毛细管柱一端为逐渐变细的锥形，通过火焰烧结锥形口的色谱填料形成塞子；烧结过程中，使用一根不锈钢管控制塞子长度和保护塞子后面的色谱填料。本发明的分离柱与喷针一体化的毛细管柱装填和塞子制作方法操作简单、快速，不需要特殊设备，成功率高，根据本发明方法装填的毛细管柱分离效率高、分离重现性好，根据本发明制作的塞子体积小、对样品无吸附、无柱后效应，在基于毛细管液相色谱—电喷雾质谱技术的蛋白组学，微量环境、生物样品分析领域具有非�：玫挠τ眉壑�。
文档编号G01N30/00GK101666786SQ20081021343
公开日2010年3月10日 申请日期2008年9月2日 优先权日2008年9月2日
发明者张养军, 王京兰, 耘 蔡, 峰 谭, 钱小红 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所
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