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专利名称：用于检验红细胞渗透脆性的微流控芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及红细胞渗透脆性检验技术，特别是一种可以自动生成浓度梯度的 微流控芯片以及基于微流控芯片的红细胞渗透脆性检验方法。
背景技术：
红细胞在低渗盐溶液中出现溶血的特性称为红细胞渗透脆性，是一个重要的 临床血液学检验指标。正常状态下红细胞内的渗透压与血浆渗透压大致相等，将
红细胞置于等渗溶液(0.9。/。NaCI)中，能保持正常大小和形态；若将红细胞置于高 渗溶液(>0.9%)中，水分会逸出胞外，细胞因失水而皱缩；若将红细胞S于低滲 溶液(0.9。/。)中，水分进入细胞，红细胞膨胀变成球形，可膨胀至破裂，血红蛋 白释放到溶液中，称为溶血。正�：煜赴�一般于0.42%NaCI溶液中开始出现溶 血，并于0.35。/。NaCI溶液中完全溶血，故以0.42-0.35%的NaCI溶液代表正常 红细胞的渗透脆性范围。渗透脆性增加，常见遗传性球形红细胞增多症；渗透 脆性降低，常见地中海贫血、缺铁性贫血等。常规的检验操作方法需要人工配制 12个不同浓度的NaCI溶液，用正常人血样和病人血样做对比试验，静置2小时 后通过肉眼观测得到检验结果，操作复杂、人工干预大。

发明内容
本发明的目的是提供一种可以实现快速检验、减少用血量和减少人工干预的 红细胞渗透脆性检验方法，以及用于该检验方法的微流控芯片。
微流控芯片是在一块几平方厘米的芯片上构建的一个生化实验室，它以 MEMS ( Micro Electro Mechanical systems )力口工工艺为基石出，在石圭片、3皮J离或 PDMS等材料上制造微通道，并由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统， 实现生物和化学领域中所涉及的反应、分离、检验、细胞培养等基本操作，用以 取代常规生物或化学实验室的各种功能，因此也被称为"芯片上的实验室 (Lab-on-a-chip)"。具有明显的微型化、集成化和便携性等特点。与目前实验室的 常用方法相比，使用微流控芯片对细胞进行操作和分析主要优势在于1)微通 道尺寸与细胞尺寸相匹配，大约在10-100|jm; 2)微流控芯片提供了一个相对封 闭的空间，减少外界环境对细胞的刺激；3)可以直接在显微镜下观察到在微流 控芯片上对细胞进行的操作以及细胞的情况；4)微流控芯片体积微�。�节约了 细胞溶液以及其它试剂的消耗量，微通道传热传质迅速，反应时间也大大减少；5)可以将细胞釆样、分离、分析等几步操作集成在一块芯片上一次完成。
本发明具体技术方案如下 一种基于微流控芯片的红细胞渗透脆性检验方 法，包括以下步骤
a、 用微量注射泵将血样通过微流控芯片的血样进口输入微流控芯片内的不 同检测池中；
b、 用微量注射泵将两种不同浓度的NaCI溶液以相同的流速同时从所述微流 控芯片的两个溶液进口输入微流控芯片内，通过微流控芯片内的自动生成浓度梯 度的微通道网络配制出不同浓度的NaCI溶液，并分别送入不同的检测池中，与 检测池中的血样混合；
c、 用显微镜观察并拍摄每个检测池中的红细胞照片；
d、 从红细胞照片中识别每个检测池中完整红细胞并计数。
在步骤b中，所加入的两种不同浓度的NaCI溶液中，其中一种NaCI溶液 的浓度为0% ~ 0.25%,另 一种NaCI溶液的浓度为0.5% ~ 0.9%。
在步骤d中，优选方案是，通过计算机用图像处理方法识别每个检测池中完 整红细胞并计数，具体包括以下步骤先用阈值法把显微镜拍摄的照片分割成红 细胞和非红细胞区域，再用面积法统计红细胞个数及计算细胞大小。在没有计算 机图像处理条件的情况下，也可以由人工数出红细胞照片中肉眼可见的红细胞 数。
其中，微流控芯片包括芯片主体，芯片主体上设置两个溶液进口和一个血样 进口，芯片主体内设置若干检测池，所述若干检测池呈一字形排列，它们通过血 样微通道与血样进口连通，并通过自动生成浓度梯度的微通道网络与两个溶液进 口连通；所述自动生成浓度梯度的微通道网络包括平行排列的若干组混合通道.， 从第一组到最后一组，所包含的混合通道的数量依次递增，每组中所有混合通道 的入口、以及上一组中所有混合通道的出口均连接在一个总通道上，每个混合通 道和下一组中与该混合通道相邻的两个混合通道威品字形排列，且每个混合通道 的出口与下 一组中与该混合通道相邻的两个混合通道的入口之间的总通道长度 相等，最后一组中各混合通道的出口对应连到所述若干检测池，第一组混合通道 的总通道于两个不同位置与所迷两个溶液进口连通，且一个溶液进口与第一组中 前两个混合通道的入口之间的通道长度相等，另 一个溶液进口与第 一组中后两个 混合通道的入口之间的通道长度相等。
所述混合通道为蜿蜒通道，其形状可以是S形、或Z字形、或弓字形等，其 功能是"f吏流入其内的两种溶液充分混合。混合通道可以设计成截面为圓形、长方 形、正方形或三角形等形状的通道，通道内径为20- 100微米，检测池的深度为20 ~ 100微米。检测池深度优选30 ~ 60微米。
一种用于检验红细胞渗透脆性的微流控芯片，包括芯片主体，其特征在于 所述芯片主体上设置两个溶液进口和一个血样进口 ，芯片主体内设置若干检测 池，所述若干检测池呈一字形排列，检测池的深度为30~60微米，它们通过血 样微通道与血样进口连通，并通过自动生成浓度梯度的微通道网络与两个溶液进 口连通；所述自动生成浓度梯度的微通道网络包括平行排列的若干组混合通道， 从第一组到最后一组，所包含的混合通道的数量依次递增，每组中所有混合通道 的入口、以及上一组中所有混合通道的出口均连接在一个总通道上，每个混合通 道和下一组中与该混合通道相邻的两个混合通道成品字形排列，且每个混合通道
的出口与下一组中与该混合通道相邻的两个混合通道的入口之间的总通道长度 相等，最后一组中各混合通道的出口对应连到所述若干检测池，第一组包括三个 混合通道，第一组混合通道的总通道于两个不同位置与所述两个溶液进口连通， 且一个溶液进口与第 一组中前两个混合通道的入口之间的通道长度相等，另 一个 溶液进口与第 一组中后两个混合通道的入口之间的通道长度相等。
本发明通过微流控芯片自动配制浓度梯度NaCI溶液并自动分装于不同的检 测池中，与检测池中的血样混合，用显微镜拍照，然后通过计算机用图像处理方 法统计完整细胞个数来实现红细胞渗透脆性的检验。其整个溶液配制过程全部在 微流控芯片内部自动完成，不需人工配制，减少了人工干预，大大地缩短了检测 时间，同时减少了外界环境对细胞的刺激，提高了检测的准确性。而且.其使用 的血样可减少到微升级，大大减少了用血量。
由于其利用显微镜拍照，然后通过计算机用图像处理方法统计完整细胞个 数，进一步减少了人工干预，使检测结果更客观、准确，并且使检测速度更快。


图1、 2分别为本发明中微流控芯片的外部结构示意图和内部示意图； 图3为其微流控芯片内部微通道网络的结构示意图。
具体实施例方式
本发明将红细胞脆性的相关检验转移到微流控芯片上进行，可以在芯片上自 动配制出浓度梯度，将红细胞送入各个不同浓度的检测池中，在显微镜下观察红 细胞变化，并用图像处理方法对红细胞进行识别。基于灰度阈值的分割方法是一 种经典的图像分割方法，它通过设置阚值，把像素点按灰度级分若干类，从而实 现图像分割。对于我们的红细胞图，只需分割成细胞和非细胞区即可，然后统计
6细胞的面积，对完整细胞进行计数。下面结合附图做进一步说明。 本基于微流控芯片的红细胞渗透脆性检验方法，包括以下步骤
a、 用微量注射泵将血样通过微流控芯片的血样进口输入微流控芯片内的不
同4企测池中；
b、 用微量注射泵将两种不同浓度的NaCI溶液以相同的流速同时从所述微流 控芯片的两个溶液进口输入微流控芯片内，通过微流控芯片内的自动生成浓度梯 度的微通道网络配制出不同浓度的NaCI溶液，并分別送入不同的检测池中，与 检测池中的血样混合；
c、 用显微镜观察并拍摄每个检测池中的红细胞照片；
d、 通过计算机用图像处理方法处理所述红细胞照片，识别每个检测池中完 整红细胞并计数。也可以由人工数出红细胞照片中肉眼可见的红细胞数。
在步骤b中，所加入的两种不同浓度的NaCI溶液中， 一种NaCI溶液的浓 度为0% ~ 0.25%,另 一种NaCI溶液的浓度为0.5% ~ 0.9%。两种溶液中有一种 溶液的浓度可以为0,也就是说，可以从一个溶液进口加入NaCI溶液，从另一 个溶液进口加入纯水。而且加入方式可以是使用一台双通道微量注射泵(如美国 KDScience公司的KDS 200),也可以使用两台单通道微量.注射泵(如美国 KDScience公司的KDS 100)，还可以使用一台多通道微量注射泵的两个通道， 但不管采用何种方式， 一定要保证同时向两个溶液进口加入，而且两个溶液进口 的流速相同，流速一^殳设定在0.1 |jl/min的数量级。
在步骤d中，所采用的图像处理方法包括先用阈值法把显微镜拍摄的照片 分割成红细胞和非红细胞区域，再用面积法统计完整红细胞个数及计算细胞大
参照图1-3,本实施例中微流控芯片包括由上基片1和下基片2构成的芯片 主体，芯片主体上设置两个溶液进口 3、 4和一个血样进口 5,芯片主体内设置 八个检测池61 ~ 68,所述八个检测池61 ~ 68呈一字形排列形成检测池组6，它 们通过血样微通道10与血样进口 5连通，并通过自动生成浓度梯度的微通道网 络7与两个溶液进口3、 4连通；所述自动生成浓度梯度的微通道网络7包括平 行排列的六组S形蜿蜒通道71 ~ 76,第一组S形蜿蜒通道71含有三个S形蜿 蜒通道712、 713、 714，从第一组71到最后一组76，所包含的S形蜿蜒通道 的数量依次递增，第六组S形蜿蜒通道76含有八个S形蜿蜒通道762 ~ 769， 每组中所有S形蜿蜒通道的入口 、以及上一組中所有S形蜿蜒通道的出口均连接 在一个总通道上，如第六组中所有S形蜿蜒通道762-769的入口与第五组中 所有S形蜿蜒通道的出口均连接在一个总通道761上，每个S形蜿蜒通道和下一组中与该S形蜿蜒通道相邻的两个S形蜿蜒通道成品字形排列，如第一组中 的S形蜿蜒通712与第二组中的S形蜿蜒通道722、 723成品字形排列，第五组 中的S形蜿蜒通752与第六组中的S形蜿蜒通道762、 763成品字形排列，且每 个S形蜿蜒通道的出口与下一组中与该S形蜿蜒通道相邻的两个S形蜿蜒通道 的入口之间的通道长度相等，如第一组中的S形蜿蜒通712的出口与第二组中 的S形蜿蜒通道722、 723的入口之间的通道长度相等，以保证从S形蜿蜒通 712流入S形蜿蜒通道722、723的溶液相等；最后一组中各S形蜿蜒通道762 -769的出口对应连到所述八个检测池61 ~ 68，第一组S形蜿蜒通道71的总通道 711于两个不同位置分别通过两个通道8、 9连至所述两个溶液进口 3、 4，更具 体地讲，溶液进口 3通过通道8连至第一组S形蜿蜒通道71中前两个S形蜿蜒 通道712和713之间的总通道711上，且溶液进口 3与两个S形蜿蜒通道712 和713的入口之间的通道长度相等，溶液进口 4通过通道9连至第一组S形蜿 蜒通道71中后两个S形蜿蜒通道713和714之间的总通道711上，且溶液进口 4与两个S形蜿蜒通道713和714的入口之间的通道长度相等。
本发明中微流控芯片还可以设计成具有更少的检测池，或者具有更多的检测 池，相应地，自动生成浓度梯度的微通道网络7所包含的S形蜿蜒通道的组数也 会发生变化。
所述各通道(包括S形蜿蜒通道)可以设计成截面为圓形、长方形、正方形 或三角形等形状的通道，通道内径为20~ 100微米，检测池61 ~68的深度可设 计为20 ~ 100微米。检测池的深度优选设计为30 ~ 60微米。
本实施例中，每个检测池到血样进口 5之间的通道的长度相等、内径也相等。 微流控芯片是由两片透光的基片1、 2封合制成，其中一个基片1上成型有
构成所述检测池和各通道的微型槽，另一个基片2紧贴在所述微型槽的开口一侧，
两个基片封合后将所述微型槽的开口侧封闭形成所述微通道和检测池。其中，基
片1、 2可以采用PDMS、玻璃或者其它高分子材料制成。
微流控芯片也可以由一个PDMS基片和一个玻璃片键合制成，其中PDMS
基片是通过微通道成型模具制成的，微通道成型模具采用MEMS加工工艺制成。
一种具体的制作过程如下
1. 用计算机制图软件绘制微流控芯片的设计图形，如图3所示；
2. 制作光刻掩模版
掩模材料可以选用5英寸镀铬玻璃板，电子束曝光，将设计图形转移到掩模 版上。
3. 曝光、显影清洗4寸硅片，在其表面均匀地涂上一层光刻胶(正胶)，带有光刻胶的硅 片在一束光通过绘有预定图案的掩模版中的透明部分而曝光，则图案部分被光刻 胶保护了起来。
4. 等离子刻蚀(ICP)
用包含气体分子、自由电子和气体离子的高能量等离子体撞击硅片表面，并 且从表面除去硅，至此，微通道成型模具制作完毕。
5. 制作PDMS基片
PDMS与固化剂按照质量比10: 1混合，搅拌均匀，除去气泡，倒在微通道 成型模具上，置于烘箱中以70度固化1小时左右后耳又出，冷却，揭下成形的 PDMS,在通道血样进样口及溶液进口用钻孔器打孔，即制成PDMS基片。
6. 封装
PDMS基片经氧气等离子体表面处理后，与玻璃片贴在一起。
利用本发明中的微流控芯片能够自动生成浓度梯度的NaCI溶液，并能确定 各检测池中NaCI溶液的具体浓度，下面说明其原理参照图3,设有浓度为A 和B体积均为1的两种NaCI溶液分别从两个溶液进口 3、 4进入微流控芯片， 在微通道的交叉点分流，在S形蜿蜒通道中以扩散方式混合，各蜿蜒通道中试剂 的总流量相同，
第 一组S形蜿蜒通道71 ，从左到右，三个出口流出溶液的体积均为2/3,浓 度分别为A, (A+B)/2, B;
第二组S形蜿蜒通道72,从左到右，四个出口流出溶液的体积均为1/2 ，浓 度分别为A, (2A+B)/3, (A+2B)/3, B;
第三组S形蜿蜒通道73,从左到右，五个出口流出溶液的体积均为2/5，浓 度分别为A， (3A+B)/4, (A+B)/2, (A+3B)/4, B;
第四组S形蜿蜒通道74,从左到右，六个出口流出溶液的体积均为1/3， 浓度分另'J为A, (4A+B)/5, (3A+2B)/5, (2A+3B)/5， (A+4B)/5, B;
第五组S形蜿蜒通道75,从左到右，七个出口流出溶液的体积均为2/7, ;农度分另廿为A， (5A+B)/6, (2A+B)/3, (A+B)/2, (A+2B)/3, (A+5B)/6, B;
第六组S形蜿蜒通道76,从左到右，八个出口流出溶液的体积均为1/4，浓 度分另'j为A, (6A+已)/7, (5A+2B)/7, (4A+3B)/7, (3A+4B)/7, (2A+5已)/7, (A+6B)/7, B。
假如从一个溶液进口 3输入0.9%的NaCI溶液，另 一个溶液进口 4输入纯水， 则八个检测池61 -68的NaCI溶液浓度分别为0.90%, 0.77%, 0.64%, 0.51%,0.39%， 0.26%， 0.13%,和0。
本发明检验方法检验速度快，人工干预少，同时减少了用血量，血样用量可 减少到微升级。
上述实施例中，微流控芯片中的混合通道采用S形蜿蜒通道，实际中，还可 以采用z字形、或弓字形等其它形状的蜿蜒通道，其功能是使流入其内的两种溶 液充分混合。
权利要求
1、基于微流控芯片的红细胞渗透脆性检验方法，其特征在于包括以下步骤a、用微量注射泵将血样通过微流控芯片的血样进口输入微流控芯片内的不同检测池中；b、用微量注射泵将两种不同浓度的NaCl溶液以相同的流速同时从所述微流控芯片的两个溶液进口输入微流控芯片内，通过微流控芯片内的自动生成浓度梯度的微通道网络配制出不同浓度的NaCl溶液，并分别送入不同的检测池中，与检测池中的血样混合；c、用显微镜观察并拍摄每个检测池中的红细胞照片；d、从红细胞照片中识别每个检测池中完整红细胞并计数。
2、 根据权利要求1所述的检验方法，其特征在于在步骤b中，所加入的 两种不同浓度的NaCI溶液中，其中一种NaCI溶液的浓度为0%~ 0.25%,另一 种NaCI溶液的浓度为0.5% 0.9%。
3、 根据权利要求1所述的检验方法，其特征在于在步骤d中，通过计算 机用图像处理方法识别每个检测池中完整红细胞并计数，或者人工数出红细胞照 片中肉眼可见的红细胞数；其中，用计算机用图像处理方法识别和计数的方法包 括以下步骤先用阈值法把显微镜拍摄的照片分割成红细胞和非红细胞区域，再 用面积法统计红细胞个数及计算细胞大小。
4、 根据权利要求1-3任一项所述的检验方法，其特征在于所述微流控芯 片包括芯片主体，芯片主体上设置两个溶液进口和一个血样进口 ，芯片主体内设 置若干检测池，所述若干检测池呈一字形排列，它们通过血样微通道与血样进口 连通，并通过自动生成浓度梯度的微通道网络与两个溶液进口连通；所述自动生 成浓度梯度的微通道网络包括平行排列的若干组混合通道，从第一组到最后一 组，所包含的混合通道的数量依次递增，每组中所有混合通道的入口、以及上一 组中所有混合通道的出口均连接在一个总通道上，每个混合通道和下一组中与该 混合通道相邻的两个混合通道成品字形排列，且每个混合通道的出口与下一组中 与该混合通道相邻的两个混合通道的入口之间的通道长度相等，最后 一 组中各混 合通道的出口对应连到所述若干检测池，第一组混合通道的总通道于两个不同位 置与所述两个溶液进口连通，且一个溶液进口与第 一组中前两个混合通道的入口 之间的通道长度相等，另 一个溶液进口与第一组中后两个混合通道的入口之间的 通道长度相等。
5、 根据权利要求4所述的检验方法，其特征在于所述混合通道为蜿蜒通道，其形状为呈S形、或Z字形、或弓字形。
6、 根据权利要求4所述的检验方法，其特征在于所述混合通道的截面是 圓形、长方形、正方形或三角形，通道内径为20- 100微米，检测池的深度为 20~ 100微米。
7、 根据权利要求4所述的检验方法，其特征在于所述混合通道的截面是 圓形、长方形、正方形或三角形，通道内径为30 6CU敖米，所述检测池的深度 为30 ~ 60微米。
8、 根据权利要求4所述的检验方法，其特征在于:每个检测池到血样进口 之间的通道的长度相等、内径也相等。
9、 根据权利要求4所述的检验方法，其特征在于所述微流控芯片是由PDMS 基片和玻璃片键合制成，其中PDMS基片是通过微通道成型模具制成的，微通 道成型模具采用MEMS加工工艺制成。
10、 一种用于检验红细胞渗透脆性的微流控芯片，包括芯片主体，其特征在 于所述芯片主体上设置两个溶液进口和一个血样进口 ，芯片主体内设置若干检 测池，所述若干检测池呈一字形排列，检测池的深度为30~60微米，它们通过 血样《鼓通道与血样进口连通，并通过自动生成浓度梯度的孩i通道网络与两个溶液 进口连通；所述自动生成浓度梯度的微通道网络包括平行排列的若干组混合通 道，从第一组到最后一组，所包含的混合通道的数量依次递增，每组中所有混合 通道的入口 、以及上一组中所有混合通道的出口均连接在一个总通道上，每个混 合通道和下一组中与该混合通道相邻的两个混合通道成品字形排列，且每个混合 通道的出口与下 一组中与该混合通道相邻的两个混合通道的入口之间的总通道 长度相等，最后一组中各混合通道的出口对应连到所述若干检测池，第 一组包括 三个混合通道，第一组混合通道的总通道于两个不同位置与所述两个溶液进口连 通，且一个溶液进口与第一组中前两个混合通道的入口之间的通道长度相等，另 一个溶液进口与第 一组中后两个混合通道的入口之间的通道长度相等。
全文摘要
一种用于检验红细胞渗透脆性的微流控芯片，包括芯片主体，芯片主体上设置两个溶液进口和一个血样进口，芯片主体内设置若干检测池，它们通过血样微通道与血样进口连通，并通过自动生成浓度梯度的微通道网络与两个溶液进口连通。基于微流控芯片的红细胞渗透脆性检验方法，包括步骤a.将血样通过血样进口输入微流控芯片内的不同检测池中；b.将两种不同浓度的NaCl溶液以相同的流速同时从所述两个溶液进口输入微流控芯片内，与检测池中的血样混合；c.用显微镜观察并拍摄检测池中的红细胞照片；d.从红细胞照片中识别每个检测池中完整红细胞并计数。本发明可以减少用血量，减少人工干预，检测速度快，检测结果客观、准确。
文档编号G01N33/483GK101464458SQ20081021835
公开日2009年6月24日 申请日期2008年12月12日 优先权日2008年12月12日
发明者叶大田, 周亚浩, 雷 李 申请人:清华大学深圳研究生院