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专利名称：利用单个发光粒子检测的光分析方法
技术领域：
本发明涉及一种光分析方法，其能够使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等可检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统，检测来自分散或溶解在溶液中的原子、分子或它们的聚合体(以下将它们称为“粒子”)、例如蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞等粒子状的对象物、或非生物学粒子的光，来获取在分析或解析它们的状态(相互作用、结合/离解状态等)时有用的信息，更详细地说，涉及一种能够使用如上所述的光学系统个别检测来自单个的发光的粒子的光并进行各种光分析的方法。此外，在本说明书中，发光的粒子(以下称为“发光粒子”)可以是其自身发光的粒子、或附加了任意的发光标识或发光探针的粒子中的任意一个，从发光粒子发出的光可以是萤光、磷光、化学发光、生物发光、散射光等。
背景技术：
由于近年来的光计量技术的发展，使用共焦显微镜的光学系统和还能够进行光子计数(单光子检测)的超高灵敏度的光检测技术，能够检测/测量单光子或萤光单分子水平的微弱光。因此，提出了各种使用这样的微弱光的计量技术对生物体分子等的特性、分子间相互作用、或结合/离解反应进行检测的装置或方法。例如，在萤光相关分光分析(Fluorescence Correlation Spectroscopy:FCS。例如参照专利文献 1-3、非专利文献 1-3)中，利用激光共焦显微镜的光学系统和光子计数技术，测量来自出入样本溶液中的微小区域(被称为显微镜的激光会聚的焦点区域-共焦区组织)内的荧光分子或被荧光标识的分子(荧光分子等)的萤光强度，根据由该测量得到的萤光强度的自相关函数的值所确定的在微小区域内萤光分子等的平均滞留时间(平移扩散时间)和滞留的分子的个数的平均值，获取萤光分子等的运动的速度或大小、浓度之类的信息，或检测分子的构造或大小的变化、分子的结合/离解反应或分散/聚合之类的各种现象。另外，在萤光强度分布分析(Fluorescence-1ntensity Distribution Analysis:FIDA。例如专利文献 4、非专利文献4)、光子计数直方图(Photon Counting Histogram:PCH。例如专利文献5)中，生成与FCS同样地计量出的出入共焦区组织内的萤光分子等的萤光强度的直方图，使统计性的模型公式拟合该直方图的分布，由此估算萤光分子等的固有的亮度的平均值和滞留在共焦区组织内的分子的个数的平均值，根据这些信息估计分子的构造或大小的变化、结合/离解状态、分散/聚合状态等。另外，除此以外，在专利文献6、7中，提出了根据利用共焦显微镜的光学系统计量出的样本溶液的萤光信号的时间经过来检测萤光性物质的方法。专利文献8提出了一种信号运算处理技术，其用于使用光子计数技术计量来自流通于流式细胞仪的萤光微粒子或固定在基板上的萤光微粒子的微弱光，来检测流体中或基板上的萤光微粒子的存在。特别是，根据FCS、FIDA等使用了利用共焦显微镜的光学系统和光子计数技术进行微小区域的萤光测量的技术的方法，需要测量的样本与以前相比可以是极低浓度且极微量(在一次测量中使用的量至多为几十UL左右)，测量时间也大幅缩短(在一次测量中多次反复进行秒级时间的计量)。因而，这些技术特别是在对医学、生物学的研究开发领域中经常使用的稀少或昂贵的样本进行分析的情况下，或在疾病的临床诊断、生理活性物质的筛选等检测体数多的情况下，期待成为与以前的生物化学方法相比能够廉价或迅速地执行实验或检查的强力工具。专利文献1:日本特开2005-098876专利文献2:日本特开2008-292371专利文献3:日本特开2009-281831专利文献4:专利第4023523号专利文献5:国际公开2008-080417专利文献6:日本特开2007-20565专利文献7:日本特开2008-116440专利文献8:日本特开平4-337446号公报非专利文献1:金城政孝、蛋白质核酸酶Vol.44、N0.9、1431-1438页1999年非专利文献2:F.J.Meyer-Alms> 突光相关谱(Fluorescence CorrelationSpectroscopy)、R.Rigler 编、Springer、柏林、2000 年、204-224 页非专利文献3:加藤则子及其它4名、遗传医学、Vol.6、N0.2,271-277页非专利文献4:卡斯柯(Kask)及其它3名、美国科学学院纪要、1999年、96卷、13756-13761 页(P.Kask, K.Palo, D.Ullmann, K.Gall PNAS96, 13756-13761(1999))

发明内容
发明要解决的问题在上述的FCS、FIDA等使用了共焦显微镜的光学系统和光子计数技术的光学分析技术中，所计量的光是从萤光单分子或多分子发出的光，但在该光的分析中，执行时序地测量出的萤光强度数据的自相关函数的运算或对直方图拟合之类的萤光强度的波动的计算等统计性的处理，并非个别地参照或分析来自各个萤光分子等的光的信号。即，在这些光分析技术中，对来自多个萤光分子等的光的信号统计性地进行处理，针对萤光分子等检测统计平均性的特性。因而，为了在这些光分析技术中得到统计上有意义的结果，样本溶液中的作为观测对象的萤光分子等的浓度或个数密度需要在平衡状态下是在一次的秒级长度的计量时间内能够进行统计性的处理的个数的萤光分子等出入微小区域内的水平，优选的是在微小区域内始终存在一个左右的萤光分子等的水平。实际上，共焦区组织的体积为IfL左右，因此，在上述的光分析技术中使用的样本溶液中的萤光分子等的浓度典型的是InM左右或其以上，在大幅低于InM时，在共焦区组织内不存在萤光分子等的时间产生而无法得到统计上有意义的分析结果。另一方面，在专利文献6 8所记载的萤光分子等的检测方法中，不包括萤光强度的波动的统计性的运算处理，即使样本溶液中的萤光分子等小于InM也能够检测萤光分子等，但无法达成定量地计算出在溶液中随机运动的萤光分子等的浓度或个数密度之类的情况。因此，本申请的申请人在日本特愿2010-044714和PCT/JP2011/53481中，提出了基于以下的新原理的光分析技术，即能够定量地观测比利用FCS、FIDA等包含统计性处理的光分析技术对作为观测对象的发光粒子的浓度或个数密度进行处理的水平低的样本溶液中的发光粒子的状态或特性。在该新的光分析技术中，如果清楚地进行描述，则与FCS、FIDA等同样地，在使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等能够检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统的情况下，一边使作为光的检测区域的微小区域(以下称为“光检测区域”)的位置在样本溶液中移动，即一边通过光检测区域对样本溶液内进行扫描，一边在光检测区域包含在样本溶液中分散且随机地运动的发光粒子时检测从该发光粒子发出的光，由此，能够对样本溶液中的发光粒子逐个地进行个别检测，来获取与发光粒子的计数、样本溶液中的发光粒子的浓度或个数密度有关的信息。根据该新的光分析技术(以下称为“扫描分子计数法”)，与FCS、FIDA等光分析技术同样地，需要测量的样本可以是微量的(例如几十UL左右)，另外，测量时间短，并且与FCS、FIDA等光分析技术的情况相比，能够检测更低的浓度或个数密度的发光粒子的存在，定量地检测其浓度、个数密度或其它特性。但是，在上述的扫描分子计数法中，一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边进行计量而得到的光强度值(或光子计数值)的时序的数据中，在观测到相当于来自发光粒子的光的光强度增大、即某个阈值以上的光的强度(典型的是吊钟状的曲线地)增大时，判定为在光检测区域内包含一个发光粒子，由此进行一个发光粒子的存在的检测。但是，在该结构中，在由于样本溶液中的发光粒子的浓度比较高而在光检测区域内暂时包含两个以上的发光粒子从而产生同时观测这些发光粒子的光的时间的情况下，即在光强度数据上表不来自多个发光粒子的光的信号一部分在时间上重叠的情况下，难以分别对各个发光粒子区别地进行检测，有可能无法准确地获取发光粒子的个数、或浓度、或个数密度等信息。实际上，如后面所记载的实施例所示那样，发现了在样本溶液中的发光粒子的浓度高时(约InM以上)，发光粒子的检测个数低于根据样本溶液中的发光粒子的浓度所预期的个数，发光粒子的检测个数的精度恶化。通过在显微镜的光学系统中变更激励光的聚光状态或针孔的直径而缩小光检测区域，使得暂时包含在光检测区域内的发光粒子的个数实质上始终为一个以下，由此能够解决由该光检测区域中暂时包含两个以上发光粒子的状态发生所引起的问题，但实际上，难以进行用于缩小光检测区域的光学系统的变更和调整，另外装置的结构有可能变得复杂。但是，关于该点，本发明的发明人发现:在光强度数据中提高用于判别与发光粒子对应的光强度增大的阈值时，能够减小“表观的光检测区域”，能够得到与实际减小光检测区域的大小大致同等的作用效果。一般，在实施扫描分子计数法的光分析装置中，从单个发光粒子释放并到达光检测器的光的强度因发光粒子在光检测区域中的位置而不同，典型的是在发光粒子的位置位于光检测区域的大致中心区域时，光强度最大(以下将光检测区域内的发光粒子的光强度最大的位置称为“最大强度点”)，随着发光粒子的位置趋于接近光检测区域的周缘，光强度逐渐降低。即，从光检测区域内的发光粒子释放而被检测出的光的强度分布具有强度从最大强度点向周缘降低的大致吊钟状的曲线，光检测区域移动过程中的发光粒子的通过路径越是接近光检测区域的最大强度点，则对应的光的信号的强度越高。因而，与某个阈值以上的强度的光的信号对应的发光粒子的通过路径位于包含光检测区域内的最大强度点的比光检测区域狭小的区域内，通过该比光检测区域狭小的区域以外的发光粒子的光的强度低于上述阈值。而且，越是增大在光强度数据上用于判别表示与发光粒子对应的光的信号的阈值，则与所选择的信号对应的发光粒子的通过位置越是限定在更狭小的区域内。换言之，通过增大或变更用于判别发光粒子的信号的阈值，能够进行“表观的光检测区域(即检测发光粒子的区域、或产生被检测为发光粒子的信号的信号的发光粒子通过的区域)”的缩小或调节(参照下述(注))。根据本发明人发现的见解，只要对测量数据的分析处理的校正，即使在样本溶液中的发光粒子的浓度高时，也能够划定使暂时包含的发光粒子的个数实质上始终为一个以下的区域，能够个别检测通过该区域内的单个发光粒子，能够高精度地获取发光粒子的个数、浓度、个数密度等信息。(注)能够认为发光粒子在样本溶液中三维地均等分散，因此在移动中的光检测区域内包含两个以上的发光粒子时，发光粒子的信号的峰值点(信号强度的极大点)重叠的情况非常稀少，在大多数情况下，各个信号的峰值点相互错开，因此，重叠的信号的最大值并不比一个发光粒子的信号的峰值强度大。另外，通过表观的光检测区域以外的发光粒子越是远离表观的光检测区域，则其个数越多，但光的强度比通过表观的光检测区域内的发光粒子低。因而，能够认为即使通过与某个阈值对应的表观的光检测区域外的两个以上的发光粒子的光重叠，该光的信号的强度的最大值在大多数情况下低于阈值，不被检测为发光粒子的信号，检测为发光粒子的信号的信号在大多数情况下是通过了表观的光检测区域中的发光粒子的信号。这样，本发明的一个课题是提供一种新的方法，其用于利用上述的见解避免在扫描分子计数法中由于在光检测区域内暂时包含多个发光粒子导致发光粒子的检测个数的精度恶化。另外，本发明的另一个课题是利用上述的见解，在扫描分子计数法中，在样本溶液中的发光粒子的浓度高的情况下，避免发光粒子的检测个数的精度恶化，扩大能够良好地计量发光粒子的检测个数的发光粒子的浓度范围。用于解决问题的方案根据本发明，通过以下的方法达成上述的课题，该方法是一种光分析方法，其使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光，其特征在于，包括如下步骤:通过变更显微镜的光学系统的光路使光检测区域的位置在样本溶液内移动；一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动，一边测量来自光检测区域的光的强度，来生成光强度数据；在光强度数据上个别检测表示发光粒子的光的信号，其中，在个别检测表示发光粒子的光的信号的步骤中，选择性地检测具有超过阈值的强度的信号作为表示发光粒子的光的信号，设定上述阈值使得选择性地检测表示来自包含在光检测区域内的比该光检测区域狭小的区域中的发光粒子的光的信号。在该结构中，“在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子”是指在样本溶液中分散或溶解的原子、分子或它们的聚合体等发出光的粒子，只要是不固定在基板等上而自由地在溶液中进行布朗运动的粒子，就可以是任意的粒子。该发光粒子典型的是萤光性粒子，但也可以是通过磷光、化学发光、生物发光、光散射等来发出光的粒子。共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的“光检测区域”是指在这些显微镜中检测光的微小区域，在从物镜提供照明光的情况下，相当于该照明光会聚的区域(在共焦显微镜中，特别地根据物镜和针孔之间的位置关系来确定。在发光粒子没有照明光而发光的情况下，例如通过化学发光或生物发光来发光的粒子的情况下，在显微镜中不需要照明光)。另外，在本说明书中，在“信号”这样的情况下，只要没有特别限定，是指表示来自发光粒子的光的信号。从上述可知，在作为本发明的基本结构的扫描分子计数法中，首先一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动，即一边通过光检测区域扫描样本溶液内，一边依次进行光的检测。这样，在移动的光检测区域包含了随机运动的发光粒子时，检测来自发光粒子的光，由此，期待检测出一个发光粒子的存在。因此，在依次检测出的光中个别检测来自发光粒子的光的信号，由此依次个别检测每一个粒子的存在，获取与粒子在溶液内的状态有关的各种信息。这时，在本发明中，基于以上所述的见解，即发光粒子的信号的强度因该发光粒子通过光检测区域的通过位置而不同这样的见解，设定阈值使得选择性地检测表示来自包含在光检测区域内的比该光检测区域狭小的区域中的发光粒子的光的信号。根据该结构，通过任意地变更阈值的设定，能够调整“表观的光检测区域”的大�。芄谎≡裥缘丶觳馔ü饧觳馇蚰诘娜我馓囟ㄇ虻姆⒐饬Ｗ拥拇嬖凇Ａ硗猓缫丫得鞯哪茄湫偷氖牵庸饧觳馇蚰诘姆⒐饬Ｗ邮头哦患觳獬龅墓獾那慷确植际谴臃⒐饬Ｗ邮头哦患觳獬龅墓獾那慷却庸饧觳馇蚰诘淖畲笄慷鹊阆蚬饧觳馇虻闹茉到档偷姆植迹捶⒐饬Ｗ拥奈恢么幼畲笄慷鹊阍绞墙咏饧觳馇虻闹茉翟蚬馇慷仍绞墙档偷姆植�(特别在发光粒子是被照射激励光而释放光的粒子、根据激励光的会聚区域划定光检测区域的情况下，从光检测区域中的发光粒子释放而被检测出的光的强度分布与光检测区域内的激励光的强度分布一致)。因而，越是增大阈值，则能够将“表观的光检测区域”锁定成(包含最大强度点的)越狭小的区域。另外，优选的是在扫描分子计数法中，典型的是通过个别检测单个发光粒子的信号来得到发光粒子的个数、浓度等信息，因此，上述本发明的结构中，优选设定阈值使得暂时包含在比光检测区域狭小的区域(表观的光检测区域)中的发光粒子的个数实质上为一个以下。关于该点，例如可以基于理论上依设计估计出的光检测区域的大小确定阈值，使得暂时包含在表观的光检测区域中的发光粒子的个数为一个以下，但通常难以高精度地确定光检测区域的大小的理论值，因此可以通过多次反复进行试行实验，来确定给出暂时包含的发光粒子的个数为一个以下的表观的光检测区域的阈值。此外，从后文所示的实施例可知，即使不将阈值设定成使暂时包含在表观的光检测区域中的发光粒子的个数为一个以下，也能够获取发光粒子的个数、浓度等信息。在本发明中，重要的是应该理解到能够通过适当地设定阈值来适当地设定表观的光检测区域的大小这一点。在上述的本发明的实施方式之一中，可以对选择性地检测出的信号的个数进行计数，来对包含在比光检测区域狭小的区域(表观的光检测区域)中的发光粒子的个数进行计数(粒子的计数)。在该情况下，能够通过将检测出的发光粒子的个数和光检测区域的位置的移动量相组合，得到与样本溶液中的鉴定出的发光粒子的个数密度或浓度有关的信息。具体地说，例如可以计算多个样本溶液的个数密度或浓度的比、或者相对于作为浓度或个数密度的基准的标准样本溶液的相对的个数密度或浓度的比，或者使用相对于作为浓度或个数密度的基准的标准样本溶液的相对的个数密度或浓度的比确定绝对的个数密度值或浓度值。或者，只要通过任意的方法、例如以规定的速度移动光检测区域的位置等确定出光检测区域的位置的移动轨迹的全部体积和/或表观的光检测区域的全部体积，就能够具体地估算出发光粒子的个数密度或浓度。另外，作为本发明的另一个方式，也能够基于从光检测区域中的发光粒子释放而被检测出的光的强度分布，根据通过粒子的计数确定出的发光粒子的个数，计算在设定了与进行该粒子的计数时的阈值不同的其它阈值的情况下应该检测出的发光粒子的个数。如后文的具体实施方式
部分所记载的那样，能够根据通过粒子的计数确定出的发光粒子的个数近似地确定从光检测区域中的发光粒子释放而被检测出的光的强度分布。而且，当确定了从光检测区域中的发光粒子释放而被检测出的光的强度分布时，能够预测与任意的阈值对应的表观的光检测区域的大小。能够认为通过表观的光检测区域内的发光粒子的个数与该表观的光检测区域的大小成比例，因此根据与进行粒子的计数时的阈值对应的表观的光检测区域的大小和与其它阈值对应的表观的光检测区域的大小之比，计算出在设定了其它阈值时应该检测出的发光粒子的个数。当得到了在设定了与进行该粒子的计数时的阈值不同的其它阈值的情况下应该检测出的发光粒子的个数时，容易比较使用互不相同的阈值检测出的粒子的个数，在得到与发光粒子的个数密度或浓度等有关的信息时有利。此外，可以使用在设定了与进行粒子的计数时的阈值不同的其它阈值的情况下应该检测出的发光粒子的个数，确定发光粒子的个数密度或浓度。进一步地，作为本发明的再一个方式，也可以在设定阈值使得暂时包含在比光检测区域狭小的区域中的发光粒子的个数实质上为一个以下的情况下，检测选择性地检测出的表示来自发光粒子的光的信号的个数为规定个数的阈值，根据检测出的阈值的大小确定发光粒子的个数密度或浓度。如后文的具体实施方式
部分所记载的那样，根据选择性地检测出的信号个数和表观的光检测区域的大小而给出发光粒子的个数密度或浓度，其中，信号个数和表观的光检测区域的大小都是阈值的函数(阈值越高，则信号个数和表观的光检测区域的大小均越降低)，能够通过从光检测区域中的发光粒子释放而被检测出的光的强度分布的参数来表示表观的光检测区域的大小。因而，能够通过阈值、从光检测区域中的发光粒子释放而被检测出的光的强度分布的参数以及选择性地检测出的信号个数，来表示发光粒子的个数密度或浓度，只要检测出给出某个选择性地检测出的信号个数的阈值，就能够确定发光粒子的个数密度或浓度。实际上，根据后文记载的实验例，可知能够根据给出某个选择性地检测出的信号个数的阈值来确定发光粒子的个数密度或浓度。该方式能够在扫描分子计数法中有利于检测任意的样本溶液中的发光粒子的个数密度或浓度地进行使用。关于上述的本发明的结构中的使光检测区域的位置移动的步骤，可以根据发光粒子的特性或样本溶液中的个数密度或浓度，适当地变更样本溶液内的光检测区域的位置的移动速度。从发光粒子检测出的光的形态能够根据其特性或样本溶液中的个数密度或浓度而变化。特别当光检测区域的移动速度变快时，从一个发光粒子所能得到的光量降低，因此优选的是适当地变更光检测区域的移动速度，使得能够高精度或高灵敏度地计量来自一个发光粒子的光。进一步地，关于上述的使光检测区域的位置移动的步骤，优选的是将样本溶液内的光检测区域的位置的移动速度设定得比发光粒子的扩散移动速度(由布朗运动造成的粒子的平均移动速度)高。如上述说明的那样，在本发明的方法中，光检测区域检测从一个发光粒子发出的光，来个别检测发光粒子。但是，发光粒子由于在溶液中进行布朗运动而随机地移动，在多次出入光检测区域的情况下，有可能从一个发光粒子多次检测(表示其存在的)信号，难以使检测出的信号与一个发光粒子的存在对应起来。因此，如上所述，将光检测区域的移动速度设定得比发光粒子的扩散移动速度高，由此能够使一个发光粒子与一个信号相对应。此外，扩散移动速度因发光粒子的不同而变化，因此如上所述，优选的是根据发光粒子的特性(特别是扩散系数)适当地变更光检测区域的移动速度。可以以任意的方式进行光学系统的光路的变更以移动光检测区域的位置。例如可以使用在激光扫描型光学显微镜中采用的检电镜变更光路，来变更光检测区域的位置。可以任意地设定光检测区域的位置的移动轨迹，例如可以从圆形、椭圆形、矩形、直线以及曲线中选择。此外，在本发明中，构成为变更光学系统的光路使光检测区域的位置移动，由此光检测区域的移动迅速，并且在样本溶液中实质上不发生机械振动、流体力学的作用，因此样本溶液中的发光粒子不会受到力学作用的影响，能够在(没有伪像的状态且)稳定的状态下进行光的计量(例如在使样本发生流动的情况下，难以始终赋以一样的流速，并且装置结构复杂，另外所需要的样本量大幅增加，并且由于流动所造成的流体力学的作用而溶液中的发光粒子或其它物质有可能变质或变性)。另外，不需要构成为使样本溶液流通，因此能够与FCS、FIDA等的情况同样地在微量(IuL 几十y L左右)的样本溶液中进行计量和分析。应该理解为:本发明的方法典型地用于分析或解析蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞等粒子状的生物学对象物在溶液中的状态，但也可以用于分析或解析非生物学的粒子(例如原子、分子、胶束(micelles)、金属胶体等)在溶液中的状态，这样的情况也属于本发明的范围。发明效果总之，在本发明的方法中，在扫描分子计数法中，发光粒子的信号的强度因该发光粒子在光检测区域内的通过位置而不同，因此着眼于能够通过变更用于判别发光粒子的信号的阈值的设定来调整“表观的光检测区域”的大小这一点，尝试通过适当地设定阈值，由此划定“表观的光检测区域”(光检测区域内的比该光检测区域狭小的区域)，选择性地检测表示来自包含在该“表观的光检测区域”中的发光粒子的光的信号。根据本发明的结构，在发光粒子的信号检测中所参照的区域(表观的光检测区域)与实际的光检测区域相比相对狭�。虼税诟们蚰诘姆⒐饬Ｗ拥母鍪礁鲆陨系目赡苄员仁导实墓饧觳馇蚰诘姆⒐饬Ｗ拥母鍪礁鲆陨系目赡苄缘停虼四芄桓既返丶屏康ジ龇⒐饬Ｗ拥母鍪袢∮敕⒐饬Ｗ拥呐ǘ然蚋鍪芏鹊扔泄氐男畔�。因而，即使在样本溶液中的发光粒子的浓度比较高、从而实际的光检测区域内的发光粒子的个数为两个以上的可能性变高的情况下，也能够通过适当地设定阈值来实现在发光粒子的信号检测中所参照的区域内暂时包含的发光粒子的个数为一个以下的状态，因此，能够个别检测单个发光粒子，对其个数进行计数，或者获取与浓度或个数密度等有关的信息。换言之，根据本发明，能够使可高精度地应用扫描分子计数法的发光粒子的浓度范围或个数密度范围扩大到高浓度或高密度侧。这样，根据本发明的方法，期待扩大能够利用扫描分子计数法的样本溶液的范围，扩大分子间相互作用的观测和分析等扫描分子计数法的应用范围。通过以下的本发明的优选实施方式的说明，能够了解本发明的其它目的和优点。


图1的(A)是执行本发明的方法的光分析装置的内部构造的示意图。图1的(B)是共焦区组织(共焦显微镜的观察区域)的示意图。图1的(C)是变更反射镜7的朝向使光检测区域的位置在样本溶液内移动的机构的示意图。图2的(A)、⑶分别是说明应用本发明的方法的扫描分子计数法中的光检测的原理的示意图和所计量的光强度的时间变化的示意图。图3是说明依照本发明的方法通过适当地设定用于判别发光粒子的信号的阈值来设定表观的光检测区域的原理的图。(A)是从显微镜的光的行进方向观察到的光检测区域的截面的示意图，示意性地示出在光检测区域CV内暂时包含两个以上的发光粒子的状态。(B)是在(A)的情况下计量的时序的光强度数据的例子的示意图。(C)是说明从光检测区域中的发光粒子释放而被检测出的光的强度分布、阈值以及表观的光检测区域之间的关系的图。左上是从光检测区域内的发光粒子释放而被检测出的光的强度分布，右下是光检测区域CV、表观的光检测区域qCVl、qCV2的示意立体图，左下是从光检测区域的移动方向观察到的光检测区域CV、表观的光检测区域qCVl、qCV2的示意截面图。图4是以流程图的形式表示依照本发明的方法执行的扫描分子计数法的处理步骤的图。图5的(A)、(B)分别是表示在发光粒子一边进行布朗运动一边横穿光检测区域时、和在由于以比发光粒子的扩散移动速度快的速度使样本溶液内的光检测区域的位置移动而发光粒子横穿光检测区域时的粒子的运动的方式的模型图。图5的(C)是说明用于依照扫描分子计数法根据所计量的时序光强度数据(光子计数的时间变化)检测发光粒子的存在的处理步骤中的检测信号的信号处理过程的例子的图。图6示出所计量的光子计数数据的实测例子(直方图表)、对数据进行平滑处理而得到的曲线(虚线)以及在脉冲存在区域中拟合的高斯函数(实线)。在图中，附加为“噪声”的信号作为由噪声或异物造成的信号而被忽略。图7是通过依照本发 明的方法执行的扫描分子计数法(实施例1)针对包含各种浓度的发光粒子的样本溶液计量出的被检测为发光粒子的信号的脉冲数的图表。(A)、(B)分别是针对发光粒子的浓度绘制在检测发光粒子的信号时设定为阈值=0.5(pC/10i!S)(在10 ys期间检测出的光子个数)以及阈值=2.0 (pc/10 ys)的情况下的脉冲数所得到的图，(C)是针对发光粒子的浓度绘制各种阈值下的脉冲数所得到的图(横轴和纵轴是对数)。图8的(A)是根据阈值与发光粒子的信号数之间的关系得到的从光检测区域中的发光粒子释放而被检测出的光的强度分布，图8的(B)是针对发光粒子的浓度绘制根据图8的(A)的光的强度分布将设定高的阈值所得到的发光粒子的脉冲数换算为设定低的阈值时应该得到的脉冲数的情况下的脉冲数所得到的图。图9是针对发光粒子的浓度绘制脉冲数为20时的阈值所得到的图。图中，黑点是阈值，实线是针对阈值的拟合曲线。图10是在现有的计算萤光强度的波动的光分析技术中得到的光子计数(光强度)的时间变化的例子，(A)是样本内的粒子的浓度为能够提供足够的计量精度的程度的情况，(B)是样本内的粒子的浓度相比于(A)的情况大幅降低的情况。附图标记说明1:光分析装置(共焦显微镜)；2:光源；3:单模光纤；4:准直透镜；5、14a:分色镜；6、7、11:反射镜；8:物镜；9:微板；10:皿(样本溶液容器)；12:聚光镜；13:针孔；14:屏蔽滤波器；15:多模光纤；16:光检测器；17:反射镜偏转器；17a:台位置变更装置；18:计算机。
具体实施例方式以下，详细说明本发明的优选实施方式。光分析装置的结构本发明的方法能够通过如下的光分析装置来实现:在基本结构中，如图1的(A)示意性地示例那样，由能够执行FCS、FIDA等的共焦显微镜的光学系统和光检测器组合而成。参照图1的(A)，光分析装置I由光学系统2 17以及用于控制光学系统的各部的动作并且获取并解析数据的计算机18构成。光分析装置I的光学系统可以与普通的共焦显微镜的光学系统相同，在此，使从光源2发射并在单模光纤3内传播的激光(Ex)在光纤的出射端成为以由固有的NA决定的角度发散的光而被发射，通过准直器4成为平行光，被分色镜5、反射镜6、7反射，入射到物镜8。典型的是在物镜8的上方配置有微板9，该微板9排列有注入了 I U L 几十U L的样本溶液的样本容器或皿10，从物镜8射出的激光在该样本容器或皿10内的样本溶液中形成焦点，形成光强度强的区域(激励区域)。在样本溶液中分散或溶解有作为观测对象物的发光粒子，典型的是附加有萤光色素等发光标识的分子，当发光粒子进入到激励区域时，在其间激励发光粒子而释放出光。所释放的光(Em)通过物镜
8、分色镜5，被反射镜11反射而在聚光镜12聚光，通过针孔13。此外，如本领域技术人员所了解的那样，针孔13配置在与物镜8的焦点位置共轭的位置，由此仅从如图1的⑶示意性地表示的激光的焦点区域、即激励区域内发出的光通过针孔13，遮断来自焦点面以外的光。图1的(B)所例示的激光的焦点区域通常是具有IfL IOfL左右的有效体积的本光分析装置中的光检测区域，被称为共焦区组织。在共焦区组织中，典型的是光强度以区域中心为顶点的高斯型分布或洛仑兹型分布，其有效体积是将光强度为1/e2的面作为边界的大致椭圆球体的体积。这样，通过了针孔13的光经过分色镜14a，透过屏蔽滤波器14(在此只选择特定波长频带的光成分)，被导入到多模光纤15，到达对应的光检测器16，在被转换成时序的电信号后，输入到计算机18，以后面说明的方式进行用于光分析的处理。作为光检测器16，优选的是使用能够在光子计数中使用的超高灵敏度的光检测器，由此，能够检测来自一个发光粒子的光、例如来自一个或多个萤光色素分子的微弱光。另外，在上述的光分析装置的光学系统中，还设置有用于变更光学系统的光路来通过光检测区域扫描样本溶液内、即使焦点区域(即光检测区域)的位置在样本溶液内移动的机构。作为该用于使光检测区域的位置移动的机构，例如如图1的(C)示意性地例示的那样，可以采用变更反射镜7的朝向的反射镜偏转器17。该反射镜偏转器17可以与在通常的激光扫描型显微镜中装备的检电镜装置相同。另外，为了实现所希望的光检测区域的位置的移动图案，在计算机18的控制下与光检测器16所进行的光检测协调地驱动反射镜偏转器17。可以从圆形、椭圆形、矩形、直线、曲线或它们的组合中任意地选择光检测区域的位置的移动轨迹(可以使得在计算机18中的程序中能够选择各种移动图案)。此外，虽然没有图示，但也可以通过使物镜8上下移动来使光检测区域的位置在上下方向上移动。如上所述，根据不是移动样本溶液而是变更光学系统的光路使光检测区域的位置移动的结构，在样本溶液内不会实质地产生机械振动、流体力学作用，能够排除力学作用对观测对象物的影响，实现稳定的计量。此外，作为追加的结构，也可以在显微镜的台(未图示)设置用于移动微板9的水平方向位置的台位置变更装置17a，以变更所观察的皿10。可以由计算机18控制台位置变更装置17a的动作。在发光粒子通过多光子吸收而发光的情况下，上述光学系统被用作多光子显微镜。在该情况下，只在激励光的焦点区域(光检测区域)释放光，因此可以去除针孔13。在发光粒子通过磷光或散射而发光的情况下，能够直接使用上述的共焦显微镜的光学系统。另外，在发光粒子通过化学发光、生物发光现象而与激励光无关地发光的情况下，可以省略用于生成激励光的光学系统2 5。进一步地，可以在光分析装置I中如图示那样设置多个激励光源2，可以使得能够根据激励发光粒子的光的波长而适当地选择激励光的波长。同样地，也可以具备多个光检测器16，在样本中包含波长不同的多种发光粒子的情况下，可以使得能够根据波长分别检测来自这些发光粒子的光。本发明的方法的原理如发明内容所记载的那样，本发明的方法如果清楚地进行描述，则如上所述，在共焦显微镜(或多光子显微镜)进行光检测时，发光粒子的信号的强度因该发光粒子在光检测区域内的位置而不同，基于通过设定用于判别发光粒子的信号的阈值来使“表观的光检测区域”的大小变化这样的原理，在扫描分子计数法中，通过适当地设定阈值来调整“表观的光检测区域”的大小。而且，优选的是，设定用于判别发光粒子的信号的阈值，使得暂时包含在“表观的光检测区域”内的发光粒子的个数为一个以下，即使得被检测为发光粒子信号的信号各自与单个发光粒子对应，或者使得可靠地个别检测单个发光粒子，在该状态下对通过光检测区域扫描样本溶液内的期间的发光粒子的个数进行计数，试着以更高精度获取发光粒子的浓度或个数密度等信息。以下，说明扫描分子计数法和本发明的方法的原理。1.扫描分子计数法的原理FCS、FIDA等分光分析技术与现有的生物化学的分析技术相比，其优点在于所需要的样本量极少且能够迅速地执行检查。但是，在FCS、FIDA等分光分析技术中，在原理上，根据萤光强度的波动来计算发光粒子的浓度、特性，因此为了得到高精度的测量结果，要求如图10的(A)示意性地描绘的那样样本溶液中的发光粒子的浓度或个数密度在计量萤光强度的过程中始终是在光检测区域CV内存在一个左右的发光粒子的水平，如该图的右侧所示那样在计量时间中始终检测到有意义的光强度(光子计数)。在发光粒子的浓度或个数密度更低的情况下，例如如图10的(B)所描绘的那样，在发光粒子只是偶尔进入到光检测区域CV内的水平的情况下，如该图的右侧所示例的那样，只在计量时间的一部分内出现有意义的光强度的信号(光子计数)，难以高精度地计算出光强度的波动。另外，在与计量中始终是在光检测区域内存在一个左右的发光粒子的水平相比发光粒子的浓度大幅降低的情况下，在光强度的波动的运算中，容易受到背景的影响，为了得到足够进行运算的量的有意义的光强度数据而计量时间变长。因此，本申请的申请人在日本特愿2010-044714和PCT/JP2011/53481中，提出了基于以下的新原理的“扫描分子计数法”:即使在发光粒子的浓度低于如上所述的在FCS、FIDA等分光分析技术中要求的水平的情况下，也能够检测发光粒子的个数密度或浓度等特性。
作为在扫描分子计数法中执行的处理，如果清楚地描述，则驱动用于使光检测区域的位置移动的机构(反射镜偏转器17)来变更光路，如在图2中示意性地描绘的那样，一边使光检测区域CV的位置在样本溶液内移动，即一边通过光检测区域CV扫描样本溶液内，一边执行光检测。这样，例如如图2的(A)那样，在光检测区域CV移动的期间(图中为时间t0 t2)，在通过存在一个发光粒子的区域时(tl)，从发光粒子释放出光，如在图2的(B)中所描绘的那样，在时序的光强度数据上出现有意义的光强度(Em)的脉冲状的信号。这样，执行上述的光检测区域CV的位置的移动和光检测，检测其间出现的每一个如图2的⑶所示例的脉冲状的信号(有意义的光强度)，由此个别检测发光粒子，对其个数进行计数，由此能够获取与存在于所计量的区域内的发光粒子的个数、浓度或个数密度有关的信息。在该扫描分子计数法的原理中，不进行如萤光强度的波动的计算那样的统计性的运算处理，而是检测每一个发光粒子，因此即使在应该观测的粒子的浓度低至无法通过FCS、FIDA等以足够的精度进行分析的程度的样本溶液中，也能够获取与粒子的浓度或个数密度有关的彳目息。2.本发明的“表观的光检测区域”的大小的调节的原理在上述的扫描分子计数法中，在样本溶液中的发光粒子的个数密度高的情况下，在光检测区域内暂时包含两个以上的发光粒子的可能性变高。例如，如图3的(A)示意性地描绘的那样，在光检测区域CV的移动过程中发光粒子a溜出光检测区域之前，发光粒子^进入光检测区域内时，如图3的(B)的右方所示那样，在时序光强度数据上，发光粒子a的信号与发光粒子P的信号一部分相互重叠。在该情况下，发光粒子a、^的信号的曲线如在图中用虚线所示的那样，成为难以分别检测这两个发光粒子的信号的形状，有时将该相互重叠的两个以上的发光粒子的信号检测为一个发光粒子的信号。实际上，可知在样本溶液中的发光粒子的个数密度高的情况下，典型的是在高到约InM程度时，通过扫描分子计数法检测为发光粒子的光的信号个数大幅地少于根据实际的浓度所预期的个数，能够认为该信号个数的降低是由于将相互重叠的两个以上的发光粒子的信号作为一个发光粒子的信号来进行计数。作为排除如上所述的相互重叠的两个以上的发光粒子的信号而个别检测各单个发光粒子来生成时序光强度数据的一个方法，能够考虑如在图3的(A)中用虚线所描绘的那样，缩小光检 测区域，实现在光检测区域内暂时包含的发光粒子个数实质上始终为一个以下的状态。但是，光检测区域的缩小存在原理上的局限(无法将区域的大小缩小到光的波长以下)，另外装置的结构变得复杂，因此实际上缩小光检测区域是极其困难的。但是，根据本发明，只要对根据时序光强度数据检测发光粒子的光的信号时的信号处理进行校正，就能够如在图3的(A)中用虚线描绘的那样，选择性地检测通过光检测区域内的比该光检测区域狭小的区域的发光粒子的光的信号，将相互重叠的两个以上的发光粒子的信号检测为一个发光粒子的信号的可能性大幅降低。在光检测区域中，从通过光检测区域的发光粒子释放并到达光检测器的光的强度因发光粒子在光检测区域中的位置而不同，例如，在发光粒子是被照射照明光而发光的粒子的情况下，照明光在光检测区域内的光的强度典型的是在光检测区域(聚光区域)的大致中心处最大，从该最大强度点向大致放射方向降低。因而，发光粒子的光强度在发光粒子横穿光检测区域的大致中心时为最大，随着发光粒子的位置趋于接近光检测区域的周缘，光强度逐渐降低。即，从光检测区域内的发光粒子释放而被检测出的光的强度的分布如图3的(C)的左上所示例的那样，呈吊钟状的分布，例如如图3的(A)所描绘的那样，通过在图中用虚线描绘的区域的发光粒子Y的光强度比通过用虚线描绘的区域以外的发光粒子
a、^的光强度高(参照图3的(B))。这样，在清楚地描述时，如果参照发光粒子的信号的强度，则能够大致确定发光粒子在光检测区域内的通过范围。而且，在根据时序光强度数据检测发光粒子的信号时，设定阈值，如果只将具有超过该阈值的强度的信号检测为有意义的信号，则能够只“挑出”与通过了给出该阈值以上的光强度的区域的发光粒子对应的信号。另外，在如图3的(C)的左上那样按照IthO — Ithl — Ith2的顺序提高阈值的情况下，挑出的发光粒子所通过的区域如图3的(C)的左下和右下的截面图和立体图所描绘的那样，按照CV — qCVl — qQV2的顺序缩小。换言之，在时序光强度数据的信号的分析处理中，通过设定某个阈值(例如Ithl、Ith2)，来划定检测单个发光粒子的区域、即“表观的光检测区域”(例如qCVl、qCV2)，能够选择性地只检测通过该表观的光检测区域内的发光粒子的信号。此外，如上所述，在根据信号的强度的高低来选择发光粒子的信号的情况下，在两个以上的发光粒子同时进入到光检测区域且这些发光粒子的信号的峰值(最大值)的时间几乎没有错开时，无论这些发光粒子是否正在通过表观的光检测区域，这些发光粒子的信号都可能不相互区别地被检测为一个发光粒子的信号。但是，发光粒子在样本溶液中三维地分散，因此两个发光粒子同时进入光检测区域的情况(限于发光粒子的个数密度相当低)是稀少的，另外，光检测区域内的发光粒子的所检测出的光的强度分布是吊钟状的分布，发光粒子的位置越是接近光检测区域的周缘，则发光粒子的强度越是降低，因此即使假设两个发光粒子大致同时进入光检测区域而它们的信号所重叠的信号的强度的最大值增大，在大多数情况下，能够认为比位于光检测区域的中心附近的单个发光粒子的光的强度低(越是高光强度， 则发光粒子个数越少，因此高光强度的发光粒子重叠的概率大幅地少于低光强度的发光粒子重叠的概率)。因而，如上所述，通过适当地设定阈值，来实质上排除被检测为一个发光粒子的信号的相互重叠的两个以上的发光粒子的信号。

在上述的本发明的适当地设定阈值来调节表观的光检测区域的大小的结构中，根据以下的关系式使阈值和表观的光检测区域的大小关联起来。即，如图3的(C)的左上所示例的那样，在能够用高斯函数来近似从光检测区域内的发光粒子释放而被检测出的光的强度的分布的情况下，使用光强度分布的最大值Imax(Imax相当于单个发光粒子的最大光强度)、分布的半峰半宽《、强度的背景Ibg以及表观的光检测区域的截面半径(离最大强度点的距离)r，通过下式来表示阈值Ith。[式I]
权利要求
1.一种光分析方法，其使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测来自在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子的光，其特征在于，包括如下步骤: 通过变更上述光学系统的光路使上述光学系统的光检测区域的位置在上述样本溶液内移动； 一边使上述光检测区域的位置在上述样本溶液内移动一边测量来自上述光检测区域的光的强度，来生成光强度数据； 在上述光强度数据上个别检测表示发光粒子的光的信号， 其中，在上述个别检测表示发光粒子的光的信号的步骤中，选择性地检测具有超过阈值的强度的信号作为上述表示发光粒子的光的信号，设定上述阈值使得选择性地检测表示来自包含在上述光检测区域内的比该光检测区域狭小的区域中的发光粒子的光的信号。
2.根据权利要求1所述的光分析方法，其特征在于， 从上述光检测区域内的发光粒子释放而被检测出的光的强度分布是从上述发光粒子释放而被检测出的光的强度从上述光检测区域内的最大强度点向上述光检测区域的周缘降低的分布。
3.根据权利要求1所述的光分析方法，其特征在于， 设定上述阈值使得暂时包含在比上述光检测区域狭小的上述区域中的发光粒子的个数实质上为一个以下。
4.根据权利要求3所述的光分析方法，其特征在于，还包括如下步骤: 对选择性地检测出的上述信号的个数进行计数，来确定包含在比上述光检测区域狭小的上述区域中的发光粒子的个数。
5.根据权利要求4所述的光分析方法，其特征在于，还包括如下步骤: 根据所确定的上述发光粒子的个数确定该发光粒子的个数密度或浓度。
6.根据权利要求4所述的光分析方法，其特征在于， 基于从上述光检测区域中的发光粒子释放而被检测出的光的强度分布，根据所确定的上述发光粒子的个数计算在设定了与上述阈值不同的其它阈值的情况下应该检测出的上述发光粒子的个数。
7.根据权利要求6所述的光分析方法，其特征在于，还包括如下步骤: 根据计算出的上述发光粒子的个数确定该发光粒子的个数密度或浓度。
8.根据权利要求3所述的光分析方法，其特征在于， 确定使选择性地检测出的表示来自发光粒子的光的上述信号的个数为规定个数的阈值，根据上述阈值的大小确定上述发光粒子的个数密度或浓度。
9.根据权利要求1所述的光分析方法，其特征在于， 上述发光粒子是通过被照射激励光而释放光的粒子，从上述光检测区域中的发光粒子释放而被检测出的光的强度分布与上述光检测区域内的上述激励光的强度分布一致。
10.根据权利要求1 9中的任意一项所述的光分析方法,其特征在于， 上述光检测区域的位置以比上述样本溶液中的发光粒子的扩散移动速度快的速度移动。
全文摘要
提供如下一种方法在使用了共焦显微镜或多光子显微镜的光测量的扫描分子计数法中，避免由于多个发光粒子暂时包含在光检测区域内而发光粒子的检测个数的精度恶化。在本发明的光分析技术中，在一边通过变更共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的光路使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边在测量光的强度而生成的光强度数据中，在以选择性地将具有超过阈值的强度的信号检测为表示发光粒子的光的信号的方式个别检测表示发光粒子的光的信号时，设定阈值使得选择性地检测表示来自包含在光检测区域内的比该光检测区域狭小的区域中的发光粒子的光的信号。
文档编号G01N21/64GK103119421SQ20118004554
公开日2013年5月22日 申请日期2011年9月16日 优先权日2010年9月21日
发明者田边哲也 申请人:奥林巴斯株式会社