专利名称：一种重组人单纯疱疹病毒ii蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程、疫苗研制和诊断试剂等领域，具体地涉及一种人单纯疱疹病毒II蛋白及其应用。
背景技术：
单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus, HSV)呈球形，基因组为一线性DNA分子， 由共价连接的长片段(L)和短片段(S)组成。30多种不同蛋白组成病毒结构蛋白(如衣壳蛋白、囊膜蛋白)，保护HSV的DNA，在HSV的致病作用和诱导机体免疫应答中起重要作用。
病人是传染源，主要通过直接密切接触和性接触传播。HSV经口腔、呼吸道、生殖道粘膜和破损皮肤等多种途径侵入机体。人感染非常普遍，感染率达80% 90%，常见的临床表现是粘膜或皮肤局部集聚的疱疹，偶而也可发生严重的全身性疾病，累及内脏。
HSV还可通过胎盘感染，影响胚胎细胞有丝分裂，易发生流产、造成胎儿畸形、智力低下等先天性疾病。约40% 60%的新生儿在通过HSV感染的产道时可被感染，出现高热、呼吸困难和中枢神经系统病变，其中60% 70%受染新生儿可因此而死亡，幸存者中后遗症可达95%。此外一些调查研究表明HSV可能与唇癌、外阴癌及子宫颈癌有关(Kriebs JM. Understanding herpes simplex virus-transmission，diagnosis，and considerations in pregnancy management. J Midwifery Womens Health.2008May-Jun ； 53(3) :202-8)。建立HSV感染的快速、准确检测方法是预防HSV感染的关键所在。
目前疱疹病毒感染诊断方法有病毒分离(Tmchev S，Shentov B. Herpes simplex virus infection in pregnancy and transmission to neonatal. Akush Ginekol(Sofiia). 2005 ；44(6) :31_5.)、PCR 法(Kimberlin DW. Diagnosis of herpes simplex virus in the era of polymerase chain reaction. Pediatr Infect Dis J. 2006Sep ；25 (9) :841-2.)和血清学检查(Eing BR, Lippelt L，Lorentzen EU, et al. Evaluation of confirmatory strategies for detection of type-specific antibodies against herpes simplex virus type 2.Journal of Clinical Microbiology. 2002,40(2) :407-413 ；Strick L, Wald A.Type-specific testing for herpes simplex virus[J]. Expert Rev Mol Diagn，2004，4(4) =443-453 ；Martins TB, Welch RJ, Hill HR, Litwin CM. Comparison of a Multiplexed HSV Type-specific IgMSerology Assay to ELISA, Immunoblot and Western Blot.Clin Vaccine Immunol. 2008Nov 19.)。血清学检查简便快速的特性使其在临床上得到广泛应用。本发明提供了一种用基因工程方法生产的重组抗原，能够避免由于蛋白质抗原纯度低或特异性差造成假阳性而降低检测特异性等问题，为人疱疹病毒感染的检测提供更为特异、准确的原料。
在全球范围内，目前缺乏有效治疗病毒感染药物的情况下，通过接种疫苗预防病毒感染成为一种重要的医学干预手段。同时，HSV疫苗的研制也是进行HSV研究的重要领域之一。本发明提供的HSV蛋白抗原具有高特异性、强免疫原性和尽量完整的抗原决定簇，在HSV疫苗研制领域具有实际应用价值。 发明内容
(一)要解决的技术问题
本发明的目的是提供一种重组人单纯疱疹病毒II蛋白，本发明的另一目的是提供该重组人单纯疱疹病毒II蛋白在制备检测试剂盒中的应用。
(二)本发明的技术方案
本发明提供了一种编码人单纯疱疹病毒II蛋白的重组DNA，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。同时提供了由该重组DNA序列编码的人单纯疱疹病毒II蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
本发明还提供了一种人单纯疱疹病毒II蛋白的表达载体pETjSa-HSVII，它是将 SEQ ID NO 1所示所述的重组DNA序列插入到质粒pET_28a上得到的重组质粒，其质粒图谱如附图2所示。将表达载体pET-28a-HSV导入大肠杆菌中，得到表达人单纯疱疹病毒II 蛋白的工程菌株。
本发明利用SEQ ID NO :1所示核苷酸序列通过基因工程方法制备人单纯疱疹病毒 II蛋白可以通过如下步骤实现
1)获得具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；
2)将该核苷酸序列导入质粒，优选pET_28a质粒；
3)将该质粒导入原核宿主细胞，优选大肠杆菌宿主细胞，更优选BL21(DE!3)菌株中；
4)在有利于所述核苷酸序列表达的条件下培养所述宿主细胞；
5)回收、纯化及复性所表达的重组蛋白。
本发明提供的检测人单纯疱疹病毒II感染的试剂盒，其组分中的抗原是本发明所述的重组人单纯疱疹病毒蛋白。用于标记人单纯疱疹病毒II蛋白的标记物选自胶体金、 辣根过氧化物酶(HR)。
本发明所述的采用胶体金标记抗原的试剂盒中，抗人IgG抗体划线包被浓度为 2. Omg/ml,HSVII抗原胶体金复合物在浓缩原液到稀释一倍之间包被载金垫，抗人IgG抗体划线量为1. O μ 1/cm，胶体金结合物喷点量为20. O μ 1/cm，兔抗单纯疱疹病毒II型抗体包被量为1. O μ 1/cm，包被浓度为5. Omg/ml。
以下将更详细的描述本发明的技术方案
本发明公开了一种编码人单纯疱疹病毒II蛋白的如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列，利用该核苷酸序列制备人单纯疱疹病毒II蛋白的方法，由该方法制备的包含SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的人单纯疱疹病毒II蛋白，以及包含该蛋白的组合物和试剂盒，同时还公开了它们在检测人单纯疱疹病毒感染的应用。
SEQ ID NO :1所示核苷酸序列可以通过本领域常规的方法制备，优选根据目的片段的DNA序列，即HSVII的gG上目的肽段的cDNA序列和质粒上的酶切位点，设计PCR引物 P1，P2，P3和P4。引物Pl和P2用于扩增是gG第571位到第1185位核苷酸，P3和P4用于扩增gG第1528位到第2076位核苷酸。引物Pl和P4分别带有NdeI和XhoI的酶切位点， 并共同对应于gG上述片段的5’末端3’末端。
引物序列如下
Pl:ATCGCATATGGGTCTGTTGTGGGTAGAGGT
P2 GGCCATCTCGTCGGGGGGAGTAGT
P3 :CTCCCCCCGACGAGATGGCCACAGCCGCCAACGTTTCGGT
P4 :ATCGCTCGAGTTAGTTACGCACGCTCGGGTGC
以引物Pl和P2扩增gG目的DNA片段的第571位到第1185位核苷酸，以引物P3 和P4扩增gG目的DNA片段的第15 位到第2076位核苷酸。以第一轮PCR扩增得到的两段目的DNA片段为模板，加入引物Pl和P4，扩增gG的DNA片段。目的基因重组片段gG。
本发明对上述核苷酸序列的核酸分子采用适当载体和宿主细胞表达时可以大大提高表达产率。
本发明的一个实施方案涉及应用如SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列制备人单纯疱疹病毒II蛋白的方法。根据常规方法，可将含编码人单纯疱疹病毒II蛋白的如SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的核酸分子连接到一个表达载体中，然后通过常规方法转化细胞。通常，优选原核生物用于DNA序列的起始克隆和用于本发明的载体构建。例如，大肠杆菌等肠科杆菌。
编码本发明蛋白的核酸与pET_28a形成的杂合质粒具有高度的稳定性，有利于本发明的蛋白的表达。
在本发明的一个实施方案中，如图2所示，制备含有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的核酸分子和pETj8a质粒的表达构建体，并将该构建体转化BL21 (DE3)，经IPTG诱导培养后，收集菌体。可采用常规的纯化方法纯化所得到的蛋白。
本发明的一个实施方案涉及用上述方法制备、纯化的人单纯疱疹病毒II蛋白，该蛋白具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列。
本发明的一个实施方案涉及包含本发明人单纯疱疹病毒II蛋白的组合物和试剂盒。所述组合物或试剂盒可制备成检测人单纯疱疹病毒感染的试剂或试剂盒形式，在临床上用于方便、快速和准确的风疹病毒感染。任何生物学样品，只要它们含有人单纯疱疹病毒 II抗体，就可用本发明蛋白，包含该蛋白的组合物或试剂盒来检测。
本文所述“试剂盒”是指利用本发明蛋白完成人单纯疱疹病毒感染检测而组配制成的成套试剂。该试剂盒用于诊断人单纯疱疹病毒感染。本发明试剂盒可包括其它多个容器，其中可分别含有检测所用的标准品，抗体或经过标记的抗体、酶，底物或缓冲液等。在该试剂盒中，还包括标签和包装插页用以提供试剂盒的使用说明。还可包括符合用户需要的其它材料，如微量滴定板等。
在用于人单纯疱疹病毒II感染检测的试剂盒中，本发明的人单纯疱疹病毒II蛋白也可以是经过标记的。具体可使用酶、金属螯合物等标记。优选的标记性酶例如，辣根过氧化物酶，过氧化物酶，碱性磷酸酶等。优选的金属物质有胶体金等。
与上述标记物结合的方法是已知的。当标记物为酶时，其底物和显色剂可用于测定其活性。当使用过辣根过氧化物酶时，以3' ,3' ,5' ,5'，-四甲基联苯胺作为底物溶液，并使用TMB显色系统。当使用过氧化物酶时，以H2A作为底物溶液，并以邻苯二胺、4-氨基氨替比林等作为显色剂。当使用碱性磷酸酶时，可用邻硝基苯磷酸、对硝基苯磷酸等作为底物。
(三)有益效果
采用本发明提供的重组人单纯疱疹病毒II蛋白制备的诊断试剂盒，与市场上的同类试剂盒相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，很好的满足了人单纯疱疹病毒II感染临床诊断的需要。本发明提供的HSVII蛋白抗原具有高特异性、强免疫原性和尽量完整的抗原决定簇，在HSVII疫苗研制领域具有实际应用价值。
图IPCR扩增产物的凝胶电泳图2表达质粒pET-28a_HSVII的构建流程图。
图3是诱导后菌体12% SDS-PAGE电泳图，其中M表示Marker，1表示目的蛋白。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。
实施例1人单纯疱疹病毒蛋白的制备
1. 1人单纯疱疹病毒蛋白抗原表位筛选及目的基因克隆
通过计算机分析人单纯疱疹病毒的全部氨基酸序列筛选出人单纯疱疹病毒II的型特异性蛋白gG的优势抗原表位，包括人单纯疱疹病毒gG从N-末端第191位到第395位的205个氨基酸和第510位到第692位的183个氨基酸。所述重组蛋白质的DNA序列如SEQ ID No.l所示，其中，gG目的肽段DNA序列是gG第571位到第1185位核苷酸和第15 位到第2076位核苷酸。
根据目的片段的DNA序列，即HSVII的gG上目的肽段的cDNA序列和质粒上的酶切位点，设计PCR引物Pl，P2，P3和P4。引物Pl和P2用于扩增是gG第571位到第1185位核苷酸，P3和P4用于扩增gG第15 位到第2076位核苷酸。引物Pl和P4分别带有NdeI 和B10I的酶切位点，并共同对应于gG上述片段的5’末端3’末端。
引物序列如下
Pl:ATCGCATATGGGTCTGTTGTGGGTAGAGGT
P2 GGCCATCTCGTCGGGGGGAGTAGT
P3 :CTCCCCCCGACGAGATGGCCACAGCCGCCAACGTTTCGGT
P4 :ATCGCTCGAGTTAGTTACGCACGCTCGGGTGC
以上引物由(华美生物技术有限公司)合成。
以人单纯疱疹病毒培养物(中国预防医学科学院病毒研究所赠)为模板，以引物 Pl和P2扩增gG目的DNA片段的第571位到第1185位核苷酸，以引物P3和P4扩增gG目的DNA片段的第15 位到第2076位核苷酸。以第一轮PCR扩增得到的两段目的DNA片段为模板，加入引物Pl和P4，扩增gG的DNA片段。目的基因重组片段gG。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如附图1所示。切割含目的DNA条带的胶块，用DNA快速纯化试剂盒 (购自六合通-北京 TAKARA 公司，产品名称TAKARA MiniBEST Plasmid purification)回收目的DNA，操作按产品说明书进行。
1. 2表达载体pET-28a-HSVII的构建及鉴定
pET_28a载体(购自华美生物技术有限公司)与PCR扩增产物gG目的DNA片段经 NdeI 和 XhoI 双酶切，产物纯化(采用 TAKARA MiniBEST Plasmidpurification 试剂盒， 购自六合通-北京TAKARA公司)后经T4DNA连接酶与载体连接，连接产物转化入大肠杆菌 BL2KDE3)感受态(购自华美生物技术有限公司)，涂布于含卡那霉素的LB平板上37°C倒置培养过夜，次日挑选平板上生长的菌落，碱裂解法抽提质粒，琼脂糖凝胶电泳选择可疑重组质粒作为模板进行PCR扩增，对有扩增产物的重组子质粒经内切酶NdeI和B10I双酶切、 鉴定，其中有3个重组子为阳性重组子。从3个阳性重组子中选一个阳性重组子送赛百胜公司测序鉴定，结果表明该质粒上确实插入了目的基因，且插入方向正确，将此重组质粒命名为表达质粒pET-28a-HSVII。
1. 3表达人单纯疱疹病毒II型蛋白的工程菌的构建
将表达质粒pET-28a-HSVII用化学转化法((美)J.萨姆布鲁克 (JosephSambrook),(美)D.W.拉塞尔(DavidW. Russell)著，黄培堂等译.分子克隆实验指南.科学出版社，2002.)转入大肠埃希氏菌BL21(DE3)菌株(购自华美生物技术有限公司)，涂布于含卡那霉素的LB平板上37°C倒置培养过夜，次日挑选平板上生长的菌落用含卡那霉素的LB培养基培养，用IPTG诱导表达5小时，诱导后的菌体用12% SDS-PAGE分析 (同上文献)，结果如附图3所示，确定表达人单纯疱疹病毒蛋白的菌株即为所需的工程菌株，用甘油冷冻保存。
1. 4重组人单纯疱疹病毒II型蛋白的表达制备及纯化
诱导培养已构建的表达人单纯疱疹病毒II型蛋白的大肠埃希氏菌，用IPTG诱导表达5小时，离心收集菌体，以1 10(W/V)加入菌体裂解液(50mmpH 8. OTris-Cl，50mm NaCl，50%甘油)，加入磁力搅拌转子搅拌30分钟，经超声破菌(冰�。β�200W，超声3秒， 间隔5秒，超声80次)、组氨酸亲和柱(300ml 200mm的NiCl2过柱，流速5ml/min ；500ml PBS 缓冲液洗注，流速lOml/min ；超声离心后的上清液用200ml PBS稀释后上样，流速;3ml/min ； 500ml PBS缓冲液洗注，流速5ml/min ；用分别含咪唑20mm、50mm、100mm、200mm各IOOml的 PBS缓冲液洗脱，紫外检测仪280nm检测吸收值，收集洗脱峰；SDS-PAGE电泳检测纯化组分)得到纯化的重组蛋白。
1. 5 重组蛋白 Western-blot 验证
为验证重组HSVII型蛋白质与抗HSV抗血清反应性及重组目的基因获得表达并具有抗原性，用Western-blot法进行了测试。阳性血清为10份兔抗HSVII抗体阳性血清 (购自北京百安天地医药科技有限公司)和30份人抗HSVII抗体阳性血清(经ELISA法检测证实)。阴性血清为10份对照正常兔血清和30份人抗HSVII抗体阴性血清(经ELISA 法检测证实)。结果如表1。
表1重组蛋白Western-blot验证结果
权利要求
1.一种编码人单纯疱疹病毒II蛋白核酸，如SEQ ID NO 1所示。
2.包含权利要求1所述核酸的人单纯疱疹病毒II蛋白的表达载体，其特征在于它是将权利要求1所述的核酸插入到质粒pET-28a上得到的重组pET-28a-HSVII质粒。
3.一种人单纯疱疹病毒II蛋白，其特征在于它由权利要求1所述的核酸编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
4.一种重组人单纯疱疹病毒II蛋白的制备方法，其特征在于应用权利要求1的重组 DNA构建表达载体，并在该载体所适合的原核宿主细胞中表达权利要求1所述重组DNA编码的重组人单纯疱疹病毒II蛋白。
5.一种表达人单纯疱疹病毒II蛋白的工程菌株，其特征在于它含有权利要求3所述的表达载体pET-28a-HSV，宿主菌为大肠杆菌。
6.一种检测人单纯疱疹病毒II感染的试剂盒，其特征在于其组分中的抗原是根据权利要求2所述的人单纯疱疹病毒II蛋白。
7.根据权利要求2所述的人单纯疱疹病毒II蛋白在制备检测试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种人单纯疱疹病毒II重组蛋白，还提供了该重组蛋白在制备检测试剂盒中的应用。采用本发明提供的人单纯疱疹病毒II蛋白制备的诊断试剂盒，与市场上的同类试剂盒相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，很好的满足了人单纯疱疹病毒II感染临床诊断的需要。
文档编号G01N33/569GK102492699SQ20111041344
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月13日 优先权日2011年12月13日
发明者张晓刚, 毕大伟, 王健, 王志新, 陈廷友 申请人:北京英诺特生物技术有限公司
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
