专利名称：一种检测三聚氰胺的免疫层析试纸及其制备方法
技术领域：
本发明涉及三聚氰胺残留物的检测试剂，具体涉及一种检测三聚氰胺的免疫层析试纸及其制备方法。
背景技术：
三聚氰胺(Melamine)，俗称密胺、蛋白精，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，被用作化工原料。三聚氰胺对身体有害，不可用于食品加工或食品添加物。2008年10月8 日，卫生部、工业和信息化部、农业部、国家工商行政管理总局和国家质量监督检验检疫总局联合发布公告，制定三聚氰胺在乳与乳制品中的临时管理值婴幼儿配方乳粉中三聚氰胺的限量值为1. Omg/kg液态奶(包括原料乳)、奶粉、其它配方乳粉中三聚氰胺的限量值为2. 5mg/kg(L)。含乳15%以上的其它食品中三聚氰胺的限量值为2. 5mg/kg(L)，高于以上限量值的产品一律不得销售。目前现场筛查用检测试剂已可用三聚氰胺胶体金试纸进行检测，但因其灵敏度低不能很好满足要求，因此需要开发可在现场更为准确和快速的检测方法。基于抗原-抗体免疫学反应的侧流免疫层析检测技术(LFIAs)是20世纪90年代初发展起来的新兴技术，因其快捷方便的特性，非常适宜用于现场的快速监测。但目前该类技术多采用胶体金作为信号标记分子，受其灵敏度等的限制，只能用于定性检测。超顺磁性复合粒子具有良好的磁学特性，由于其受背景干扰�。乇鹗室擞诓缓判晕镏实纳镅返募觳�。胶体金和荧光标记分子用于测流免疫层析检测时，只可在其检测区膜表面观测到约10%的信号分子强度，而用超顺磁性复合粒子作为标记材料，则可检测到检测区膜三维立体结构中的所有磁信号分子，可极大提高灵敏度，并可用对应的磁信号检测仪达到定量测定，因此，超顺磁性复合粒子是近年来在LFIAs中受到关注的材料。然而，目前报道的生物检测用磁性纳米复合粒子多采用化学法如共沉淀法先制备得到有机相的磁性纳米粒子后，再采用硅(SiO2)或聚苯乙烯、聚丙烯酸、明胶等高分子材料对其表面进行稳定化包覆修饰，以得到稳定的、水溶性的磁性标记材料。但这些制备修饰方法往往较为繁琐复杂，得到的超顺磁性复合粒子在尺寸大小、生物相容性、饱和磁强度、外磁场响应速度、稳定性和标记效率等方面不能同时满足LFIAs的要求其尺寸多在200 300nm之间，由于磁珠颗粒偏大，在试纸上的泳动时间较慢，显色时间较长；而太小的粒子又无法提供足够的磁共振信号；另外还有生物相容性不稳定、磁珠容易聚合等问题；这些不足限制了超顺磁性复合粒子在LFIAs中的应用。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测三聚氰胺的免疫层析试纸。本发明提供的检测三聚氰胺的免疫层析试纸，包括含有超顺磁性复合粒子标记三聚氰胺抗体的样品垫、连接于所述样品垫一端的反应垫、连接于所述反应垫另一端的吸水垫；所述反应垫包被有相互分离的检测线和质控线，所述检测线含有三聚氰胺抗原，所述质控线含有能与所述三聚氰胺抗体特异结合的抗抗体。所述反应垫为硝酸纤维素膜；所述超顺磁性复合粒子标记三聚氰胺抗体为将三聚氰胺抗体和超顺磁性复合粒子的以肽键共价结合形成的聚合体；所述三聚氰胺抗体为三聚氰胺单克隆抗体或三聚氰胺多克隆抗体，所述三聚氰胺抗体具体为三聚氰胺单克隆抗体(郑州金赛尔生物科技有限公司，C010110)；所述三聚氰胺抗原为三聚氰胺半抗原与载体蛋白的偶联物；小分子抗原物质与载体蛋白偶联时，每个载体蛋白分子上所连接的半抗原的平均数目称为偶联比或结合比。为达到载体蛋白与NC膜的良好结合，同时又能最大程度地保证三聚氰胺半抗原空间位点的延展，选择合适的偶联比是非常重要的。偶联比的大小与半抗原功能基团的活性、位阻、反应投料比及反应条件有关。一般通过调节半抗原与载体的摩尔比、反应环境PH值、温度、离子强度等来控制偶联比。所述载体蛋白与所述三聚氰胺半抗原的偶联比为1 10 1 12，适于抗原的包被和三聚氰胺半抗原空间位点的延展，所述载体蛋白与所述三聚氰胺半抗原的偶联比具体为 1 12 ；所述与所述三聚氰胺抗体特异结合的抗抗体为羊抗鼠IgG抗体；所述三聚氰胺抗原和所述羊抗鼠IgG抗体的浓度均为lmg/ml。所述超顺磁性复合粒子标记三聚氰胺抗体按照如下方法制备1)将每2.5mg超顺磁性复合粒子、0.96mgl-乙基_ (3_ 二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)U. 15mg N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和Iml浓度为0. 1M、PH值为4. 7的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液(称取1. 066g MES,0. 45g NaCl溶于50ml纯水，调pH至4. 7)混勻，反应，得到活化后磁性粒子；2)将每2. 5mg步骤1)得到活化后磁性粒子、0. 15mg三聚氰胺抗体和0. 8ml浓度为50mM pH为8. 5的硼砂缓冲液混勻、反应，得到含有偶联后磁性粒子的反应液；3)向步骤2)得到的反应液中加入BSA混勻得到混合液、反应，得到含有封闭后磁性粒子的反应液；所述BSA在所述混合液中的浓度为5% (质量百分含量)。所述三聚氰胺抗原按照如下方法制备三聚氰胺-BSA的合成采用先将三聚氰胺分子转化为中间体，再与BSA进行偶联。 具体步骤为A)先取每63mg三聚氰胺、50mg琥珀酸酐和5ml吡啶混勻，反应，得到反应液a，再除去所述反应液a中吡啶，得到三聚氰胺中间体；再加入5ml DMF(N, N- 二甲基甲酰胺)溶解82mg所述三聚氰胺中间体，得到三聚氰胺中间体溶液；B)将每5ml步骤A)得到的三聚氰胺中间体溶液和20. 6mg DCC(N,N- 二环己基碳化二亚胺)混和，得到反应液b，再向所述反应液b中加入NHS(N-羟基丁二酰亚胺) 混勻、反应，得到活化后的三聚氰胺中间体溶液；C)取每IOOmg载体蛋白溶解于IOml浓度0. lmol/L,pH为8. 5的硼酸钠水溶液中得到载体蛋白硼酸溶液；D)将每5ml步骤B)得到的活化后三聚氰胺中间体溶液和IOml步骤C得到的载体蛋白硼酸溶液混勻、反应，得到反应液c。所述超顺磁性复合粒子标记三聚氰胺抗体的制备方法中步骤1)中，反应温度为37°C，反应时间为0. 5h ；步骤2)中，反应温度为25°C，反应时间为3. 5h ；步骤3)中，反应温度为37°C，反应时间为0.证。所述三聚氰胺抗原的制备方法中步骤A)中，所述反应温度为25°C，所述反应时间为Mi ；步骤B)中，所述混合温度为25°C，所述混合时间为15min，所述反应为先在25°C反应lh，再在4°C下反应1.5h;步骤D)中，所述反应温度为4°C，所述反应时间为3. ^！。所述超顺磁性复合粒子标记三聚氰胺抗体的制备方法中在所述步骤幻后，还包括将所述含有封闭后磁性粒子的反应液中的封闭后磁性粒子进行洗涤、悬�。玫匠炒判愿春狭Ｗ颖昙侨矍璋房固宓牟街瑁鱿吹右汉托∫壕�0. 02M pH为7. 4的PBS缓冲液。所述三聚氰胺抗原的制备方法中，在所述步骤D)后还包括将步骤D)得到的反应液c透析、冻干，得到三聚氰胺抗原；所述透析液为浓度为0. 02mol/L、pH为7. 4的PBS缓冲液，透析时间为Mh，每Mi
更换一次透析液。所述三聚氰胺半抗原为三聚氰胺；所述载体蛋白为BSA;由于三聚氰胺是小分子物质，其分子表面特性不利于与反应区即NC膜的直接结合，需要将其与载体蛋白进行偶联后才能借助于载体蛋白的表面特性而达成与NC膜的良好结合。可用作载体蛋白的有各种动物的血清白蛋白，如牛血清白蛋白(BovineSerum Albumin，BSA)、人血清白蛋白(Human Serum Albumin，HSA)，还有钥孔血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin，KLH)、甲状腺球蛋白、兔血清白蛋白(RSA)、卵清蛋白(Ovalbumin, OVA)、纤维蛋白原或兔和鸡的丙种球蛋白等。研究发现，BSA理化性质稳定，赖氨酸含量高， 自由氨基多，在不同的PH和离子强度下均有较大的溶解度，在含有有机溶剂(如吡啶、DMF 等)的情况下均可和半抗原进行偶联，且在偶联后仍保持可溶状态，是作为载体蛋白的极佳选择，故本发明选用BSA作为偶联蛋白。所述超顺磁性复合粒子为!^e3O4纳米粒子；由于该超顺磁性复合粒子要由上述反应板中的样品垫泳动至反应板中间的测试区实现抗原-抗体的特异结合和标记反应，其粒径太大(> 300nm)在试纸上的泳动时间长，显色时间慢；在偶联时较容易发生聚集，并容易产生非特异反应；粒径太小则磁强度又往往不够。所述超顺磁性复合粒子的粒径为60 300nm，所述粒径具体为80 200nm，所述粒径尤其优选为IOOnm ；其粒径的偏差(CV)在10 30%之间，较好为10 20%之间， 优选15%。超顺磁性复合粒子的饱和磁强度及其外磁场响应速度直接决定了检测灵敏度及其精确性的高低，传统方法制备的超顺磁性复合粒子的饱和磁强度通常都< 30emU/g，外磁
7场响应速度则在100 200秒。为提高其灵敏度及准确性，所述超顺磁性复合粒子的磁饱和强度为30 80emu/g，对应的外磁场响应速度为20 100秒，所述超顺磁性复合粒子的磁饱和强度具体为35 70emu/g，对应的外磁场响应速度为20 50秒，所述超顺磁性复合粒子的磁饱和强度尤其优选为40emu/g，对应的外磁场响应速度为20秒；为用于三聚氰胺残留物检测，超顺磁性复合粒子表面需带有易于与三聚氰胺抗体偶联的基团，这些基团可以是羧基、氨基等基团，优化的基团是带羧基的表面官能团，通常采用化学方法连接抗体，即用EDC和NHS活化超顺磁性复合粒子后，再与抗体发生羧合反应而完成偶联反应。在将三聚氰胺抗体和超顺磁性复合粒子的以肽键共价结合形成的聚合体前，还包括将超顺磁性复合粒子表面官能团即羧基的活化。超顺磁性复合粒子表面的羧基含量不同会影响到检测的灵敏度，为提高灵敏度，所述官能团具体为羧基，所述羧基的含量为50 500 μ mol/g,所述羧基的含量具体为50 300 μ mol/g,所述羧基的含量尤其优选为 80 μ mol/g ；在免疫检测中，抗体的性能指标对于检测的准确性至关重要，通常而言，特异性强、亲和力高的抗体，可以显著地提高检测的准确性。研究发现，为提高灵敏度，所述三聚氰胺抗体亲和常数为IO6 IO8M-1 ；所述三聚氰胺抗体亲和常数具体为IO7 IO8M-1 ；所述三聚氰胺抗体亲和常数尤其优选为IO8MA本发明的另一个目的是提供一种制备检测三聚氰胺的免疫层析试纸的方法。本发明提供的方法包括如下步骤I、分别制备样品垫和含有检测线和质控线的反应垫；II、将步骤I得到的样品垫、步骤I得到的含有检测线和质控线的反应垫与吸水垫依次粘贴到背板上，得到检测三聚氰胺的免疫层析试纸；所述含有检测线和质控线的反应垫按照如下方法制备将所述三聚氰胺抗原和所述与三聚氰胺抗体特异结合的抗抗体分别喷在反应垫的两端不同区域，形成检测线和质控线，得到含有检测线和质控线的反应垫；所述样品垫按照如下方法制备将所述超顺磁性复合粒子标记三聚氰胺抗体喷到玻璃纤维纸上，得到样品垫。在所述样品垫制备方法中在将所述超顺磁性复合粒子标记三聚氰胺抗体喷到所述玻璃纤维纸上前，还包括预处理所述玻璃纤维纸和预处理所述超顺磁性复合粒子标记三聚氰胺抗体的步骤所述预处理所述玻璃纤维纸为将所述玻璃纤维纸在缓冲液中浸泡1小时，所述缓冲液按照如下方法制备将每aiilTritonX100、10g BSA、50g蔗糖和950ml 浓度为0. 02M、pH为7. 4的PBS缓冲液混合得到缓冲液，调PH到7. 4，并定容到1000ml。所述浸泡的时间为1小时，浸泡的温度为37°C ；所述预处理所述超顺磁性复合粒子标记三聚氰胺抗体为将所述超顺磁性复合粒子标记三聚氰胺抗体稀释，所述稀释倍数为50倍。所述稀释液为预处理玻璃纤维纸中所用的缓冲液。所述反应垫为硝酸纤维素膜。在步骤I后，步骤II前，还包括干燥步骤I得到的样品垫与步骤I得到的含有检测线和质控线的硝酸纤维素膜的步骤。
所述试纸在检测样品中残留三聚氰胺中的应用也是本发明保护的范围，所述样品具体为奶粉或牛奶。本发明的技术原理本发明的三聚氰胺检测试剂与超顺磁性复合粒子标记的免疫层析检测技术相关， 是采用超顺磁性复合粒子作为标记材料，进行快速免疫层析测定的一类方法，该技术整合了磁性纳米材料化学合成、标记技术、测流免疫层析技术等相关领域的研究。本发明之所以能检测三聚氰胺，在于采用了一种基于超顺磁性复合粒子标记的测流免疫层析检测的方法，即将三聚氰胺抗原和抗鼠IgG抗体分别喷涂于位于反应板中间的测试区(由硝酸纤维素膜即NC膜构成)的测试线(T线)和质控线(C线)处，反应板下端的样品垫上喷涂超顺磁性复合粒子标记的抗三聚氰胺抗体，反应板上端则连接有吸水垫， 整个反应板的构成如图1所示。基于测流免疫层析的原理，加入待测样品后，样品中的三聚氰胺与T线处喷涂的三聚氰胺抗原竞争结合磁标三聚氰胺抗体，在T线处形成抗原-抗体二元磁标免疫复合物，多余的磁标三聚氰胺抗体则在C线处与抗鼠IgG形成的磁标免疫复合物。用磁性试纸判读仪测定T线处超顺磁性微球的磁强强度，通过与设定的阈值比对而确定其阳性或阴性结果，C线测定结果则作为该测定方法的质控内标。其具体的技术步骤包括(一 )超顺磁性复合粒子标记探针的制备采用适合的纳米超顺磁性复合粒子，活化其表面的羧基后，采用化学偶联的方式将三聚氰胺抗体定向连接到该超顺磁性复合粒子表面。( 二)测试区T线和C线处抗原/抗体的包被采用专门的喷膜仪器，于测试区的T线处喷涂三聚氰胺抗原，于C线处喷涂抗鼠 IgG抗体。(三)样品垫处标记探针的包被采用专门的喷涂仪器，于样品垫特定位置处喷涂超顺磁性微球标记的抗三聚氰胺抗体。(四)反应板的组装成型按照反应板的结构图(见图1)要求，于塑料支撑背板中间粘贴作为测试区的硝酸纤维素(NC)膜，于NC膜的T线端粘贴样品垫，C线端粘贴吸水垫。在其上面粘贴透明保护膜。采用专门的试纸分切机，将整块反应板分切为一定宽带的纸条，用装有干燥剂的专门的铝箔袋进行包装。(五)抗原-抗体磁标免疫复合物的形成于上述组装成型的反应板的加样孔处加入待测样品，样品中的三聚氰胺与T线处喷涂的三聚氰胺抗原竞争结合磁标三聚氰胺抗体，在T线处形成抗原-抗体二元磁标免疫复合物，多余的磁标三聚氰胺抗体则在C线处与抗鼠IgG形成的磁标免疫复合物。(六)磁标免疫复合物磁场强度检测用磁性试纸判读仪测定T线处超顺磁性微球的磁场强度，通过与设定的阈值比对而确定其阳性或阴性结果，C线测定结果则作为该测定方法的质控内标。本发明采用的超顺磁性复合粒子是购自深圳市泰勒斯科技有限公司，产品目录号为MP-2(聚马来酸十六醇酯(PMAH)修饰的水溶性纳米晶TEM照片见图2)，所采用的制备方法是将用化学法制得的油溶性I^e3O4溶解在有机试剂中得到溶液A，将双亲性齐聚物溶于3 次蒸馏水中并调节PH为8 10得溶液B，常温下将溶液B注入溶液A中，混合液进行充分搅拌并使有机溶剂挥发，进行离心分离，将离心分离的产物干燥后即可得水溶性的超顺磁性复合粒子。用该法制备获得的磁性粒子饱和磁强度高、磁响应快、磁珠尺寸均勻、单分散性好、稳定性强、涌动时间快，可很好地满足LFIAs的检测要求。所述的抗原-抗体磁标免疫复合物，是指加入检测样品后，经竞争结合，在T线处形成的三聚氰胺抗原-磁标三聚氰胺抗体免疫复合物，以及在C线处形成的抗鼠IgG 二抗抗体-磁标三聚氰胺抗体免疫复合物。所述的磁标免疫复合物的磁场强度，是指在T线和C线处分别滞留下的结合磁珠的数量用美国Quantum Dot的超顺磁共振检测仪MAR测定后所得到的数值。通过优化竞争反应的条件，研究发现，经大量测定不同来源如尿样、血液及组织样品提取液等的正常样本，可确定出各不同来源正常样本的测定均值，以此作为临界值(cutoff)来确定T线检测样本的阳性或阴性结果。C线测定结果则作为该测定方法的质控内标。三聚氰胺的化学名称为2，4，6-三氨基-1，3，5-三嗪。本发明的实验证明，通过对超顺磁性复合粒子、三聚氰胺抗原和三聚氰胺抗体分子特性的研究，通过对多种超顺磁性复合粒子制备、包覆及表面修饰条件的优化，选择适合的超顺磁性复合粒子与特异性的抗体进行定向共价化学偶联，获得功能性的磁性标记探针，并通过优化竞争性免疫反应的各种条件，达到对三聚氰胺残留药物的客观检测，实现了对三聚氰胺残留药物的快速和高灵敏测定。具有如下优点灵敏度高、特异性强、快速、简便，可实现客观化测定。
图1为磁性试纸结构示意2为水溶性超顺磁性复合粒子电镜3为三聚氰胺磁性试纸检测值与浓度标准曲线图
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、三聚氰胺残留物磁性标记快速检测试纸的制备(一 )超顺磁性复合粒子标记三聚氰胺抗体的制备采用粒径为lOOnm、磁饱和强度为40emu/g，对应的外磁场响应速度为20秒、表面羧基含量为80 μ mol/g的超顺磁性复合粒子(超顺磁性!^e3O4纳米粒子)(购自深圳市泰勒斯科技有限公司，产品目录号为MP-2)标记三聚氰胺抗体。具体方法是1)取2. 5mg的上述磁性粒子用0. IM的MES缓冲液(称取1.066g MES、0. 45g NaCl 溶于50ml纯水，调pH至4. 7)洗涤并用0. 4T的磁架分离富集后，用Iml浓度为0. 1Μ、ρΗ值为4. 7的MES缓冲液重悬，加入0. 96mg (终浓度为5mM)的1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基) 碳二亚胺(EDC)和1. 15mg (终浓度为IOmM) N-羟基丁二酰亚胺(NHS)于其中。反应温度为37°C，反应半小时后，得到活化后磁性粒子；2)用50mM pH = 8. 5的硼砂缓冲液洗涤，取0. 15mg三聚氰胺单克隆抗体(郑州金赛尔生物科技有限公司，C010110，三聚氰胺抗体效价106，三聚氰胺抗体亲和常数为IO8M4和2. 5mg活化后磁性粒子混合到0. 8ml 50mMpH = 8. 5的硼砂缓冲液(称取 1. 9gNa2B407. IOH2O溶于IOOml纯水，调pH至8. 5)中充分混勻。室温(25°C )下反应3. 5小时，让抗体和磁性粒子形成稳定的肽键共价结合，得到含有偶联后磁性粒子的反应液；3)反应结束后，向步骤2)得到的反应液中加入终浓度为5% (质量百分含量)的 BSA(Sigma-aldrich,85041C)对剩余活性氨基位点进行封闭，反应在37°C下进行0. 5小时， 得到含有封闭后磁性粒子的反应液；完成后，用PH = 7. 4的0. 02M PBS缓冲液(称取2. 3g Na2HPO4^O. 524g NaH2PO4. H20,8. 77g NaCL 溶于 IL 纯水，调 pH 至 7. 4)洗涤，重悬后 4°C保存待用，得到超顺磁性复合粒子标记三聚氰胺抗体。( 二)三聚氰胺抗原的合成三聚氰胺半抗原为三聚氰胺(北京恒元启天化工技术研究院， 29921CDCT-C14861400)。三聚氰胺-BSA的合成采用先将三聚氰胺分子转化为中间体，再与BSA进行偶联。具体步骤为1)取63mg (0. 5mmol)三聚氰胺于玻璃瓶中，加入50mg琥珀酸酐和5ml吡啶使之完全溶解，在室温(25°C)下搅拌反应他，通过旋转蒸发仪除去吡啶，用氮气吹干残余吡啶后得到三聚氰胺中间体；取制备好的三聚氰胺中间体82mg (约0. 2mmol)溶解于5ml DMF中使之充分溶解，得到三聚氰胺中间体溶液；2)将5ml步骤1)得到的三聚氰胺中间体溶液加入20. 6mg DCC (N, N-二环己基碳化二亚胺)(约0. Immol)在室温(25°C )下活化15min，加入NHS (N-羟基丁二酰亚胺)28. 6mg (约0. 2mmol)在室温下反应lh，之后转入4°C下反应1.证，得到活化后的三聚氰胺中间体溶液；3)取IOOmg BSA溶解于IOml 0. lmol/L, pH为8. 5的硼酸钠溶液中，得到BSA硼
酸溶液；4°C下保存待用；4)将5ml活化的三聚氰胺-DMF在冰浴下通过分液漏斗缓慢逐滴加入IOml BSA溶液中4°C反应3. 5h；5)产物于0. 02mol/L,pH = 7. 5PBS中透析M小时，每Mi换次透析液。所得产品用冻干机冻干，于_20°C保存，得到三聚氰胺抗原。(三)三聚氰胺磁标快速检测试纸的制备采用0. 02M PBS (pH = 7. 4)缓冲液，将羊抗鼠IgG抗体(长沙博优生物科技有限公司，ABGAM-0500)和上述(二)得到的三聚氰胺抗原的浓度均配制为浓度lmg/ml，选用 BioDot的XYD050喷膜系统中的BioJet喷头将羊抗鼠IgG抗体喷至硝酸纤维素膜(NC膜) 的控制线(Control Line，C线)位置，将上述(二)得到的三聚氰胺抗原喷至检测线(Test Line，T线)位置，于相对湿度为10%以下的干燥车间进行抽湿4小时后干燥待用。用含 2% TritonXlOOU% BSA、1 %蔗糖的0. 02M PBS(pH = 7. 4)溶液浸泡玻璃纤维纸1小时，浸泡的温度为37°C，于同样的抽湿条件进行抽湿4小时后，用上述膜处理缓冲液按50倍稀释顺磁性复合粒子标记的三聚氰胺抗体后，采用BioDot的XYB050喷膜系统中的AirJet喷头将此稀释磁标抗体喷涂至上述处理过的玻璃纤维素膜上制备形成样品垫，于同样的抽湿条件进行干燥。在10万级洁净和干燥的车间中把上述干燥好的NC膜、磁垫、吸水纸、背板和保护膜按图1所示进行搭配组装后，采用BioDot的CM4000裁切系统将贴好的纸板裁切为5mm/条的宽度，装入检测用夹片待用，得到检测三聚氰胺的免疫层析试纸。该试纸的结果示意图如图1所示。实施例2、三聚氰胺残留物的免疫层析试纸灵敏度、交叉反应和准确度的检测。1、灵敏度的测定称取适量三聚氰胺(MEL，北京恒元启天化工技术研究院，四921⑶CT-C14861400)， 以甲醇溶解配制为100mg/ml的标准储备溶液。用0. 02M的PBS(pH = 7.4)稀释配制为0、l、2、5、10、25、50、100、200ug/L的标准溶液，分别加入由实施例1得到的检测三聚氰胺的免疫层析试纸中，并采用超顺磁共振检测仪MAR (Magna Biosciences, 8094-101-01&8094-101-02)读取。检测步骤检测前先将待检测样品恢复室温(25°C )，用精确移液器取待检测样品100 μ 1垂直缓慢滴入磁性试纸条的加样端，然后滴入50ul冲洗液(0. 02M, pH 7.4, PBS)，20分钟后用MAR进行测试。其检测结果如下表1所示。从检测结果数据中可以发现三聚氰胺浓度为lug/L时检测值与Oug/L时的检测值有交叉，当浓度为2ug/L时检测值与Oug/L值可以完全区分开， 且浓度曲线R2 = 0. 9884，线性较好，说明试纸的检测灵敏度能达到2ug/L。三聚氰胺磁性试纸检测值与浓度曲线图如图3所示。表1三聚氰胺不同浓度样品的磁性试纸检测值
权利要求
1.一种检测三聚氰胺的免疫层析试纸，包括含有超顺磁性复合粒子标记三聚氰胺抗体的样品垫、连接于所述样品垫一端的反应垫、连接于所述反应垫另一端的吸水垫；所述反应垫包被有相互分离的检测线和质控线，所述检测线含有三聚氰胺抗原，所述质控线含有能与所述三聚氰胺抗体特异结合的抗抗体。
2.根据权利要求1所述的试纸，其特征在于 所述反应垫为硝酸纤维素膜；所述超顺磁性复合粒子标记三聚氰胺抗体为三聚氰胺抗体和超顺磁性复合粒子的肽键共价结合形成的聚合体；所述三聚氰胺抗体为三聚氰胺单克隆抗体或三聚氰胺多克隆抗体，所述三聚氰胺抗体具体为三聚氰胺单克隆抗体；所述三聚氰胺抗原为三聚氰胺半抗原与载体蛋白的偶联物； 所述载体蛋白与三聚氰胺半抗原的偶联比为1 8 1 10，具体为1 10; 所述与所述三聚氰胺抗体特异结合的抗抗体为羊抗鼠IgG抗体； 所述三聚氰胺抗原和所述羊抗鼠IgG抗体的浓度均为lmg/ml。
3.根据权利要求1或2所述的试纸，其特征在于所述超顺磁性复合粒子标记三聚氰胺抗体按照如下方法制备1)将每2.5mg超顺磁性复合粒子、0. 96mgl-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、 1. 15mg N-羟基丁二酰亚胺和Iml浓度为0. 1Μ、ρΗ值为4. 7的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液混勻，反应，得到活化后磁性粒子；2)将每2.5mg步骤1)得到活化后磁性粒子、0. 15mg三聚氰胺抗体和0. 8ml浓度为50mM PH为8. 5的硼砂缓冲液混勻、反应，得到含有偶联后磁性粒子的反应液；3)向步骤2)得到的反应液中加入BSA混勻得到混合液、反应，得到含有封闭后磁性粒子的反应液；所述BSA在所述混合液中的浓度为5% (质量百分含量)。 所述三聚氰胺抗原按照如下方法制备A)先取每63mg三聚氰胺、50mg琥珀酸酐和5ml吡啶混勻，反应，得到反应液a，再除去所述反应液a中吡啶，得到三聚氰胺中间体；再加入5ml N，N-二甲基甲酰胺溶解82mg所述三聚氰胺中间体，得到三聚氰胺中间体溶液；B)将每5ml步骤A)得到的三聚氰胺中间体溶液和20.6mg N,N- 二环己基碳化二亚胺混和，得到反应液b，再向所述反应液b中加入28. 6mgN-羟基丁二酰亚胺混勻、反应，得到活化后的三聚氰胺中间体溶液；C)取每IOOmg载体蛋白溶解于IOml浓度0.lmol/L,pH为8. 5的硼酸钠水溶液中得到载体蛋白硼酸溶液；D)将每5ml步骤B)得到的活化后三聚氰胺中间体溶液和IOml步骤C得到的载体蛋白硼酸溶液混勻、反应，得到反应液c。
4.根据权利要求1-3中任一所述的试纸，其特征在于 所述超顺磁性复合粒子标记三聚氰胺抗体的制备方法中 步骤1)中，反应温度为37°C，反应时间为0.5h;步骤2)中，反应温度为25°C，反应时间为3.5h;步骤3)中，反应温度为37°C，反应时间为0.5h。所述三聚氰胺抗原的制备方法中步骤A)中，所述反应温度为25°C，所述反应时间为6h ；步骤B)中，所述混合温度为25°C，所述混合时间为15min，所述反应为先在25°C反应 lh，再在4°C下反应1.5h;步骤D)中，所述反应温度为4°C，所述反应时间为3. 5h。
5.根据权利要求1-4中任一所述的试纸，其特征在于所述超顺磁性复合粒子标记三聚氰胺抗体的制备方法中在所述步骤3)后，还包括将所述含有封闭后磁性粒子的反应液中的封闭后磁性粒子进行洗涤、悬�。玫匠炒判愿春狭Ｗ颖昙侨矍璋房固宓牟街瑁鱿吹右汉托∫壕ǘ任�0. 02M pH为7. 4的PBS缓冲液。所述三聚氰胺抗原的制备方法中在所述步骤D)后还包括将步骤D)得到的反应液c透析、冻干，得到三聚氰胺抗原。
6.根据权利要求1-5中任一所述的试纸，其特征在于所述三聚氰胺半抗原为三聚氰胺；所述载体蛋白为BSA;所述超顺磁性复合粒子为Fe3O4纳米粒子；所述超顺磁性复合粒子的粒径为60 300nm，所述粒径具体为80 200nm，所述粒径尤其优选为IOOnm ；所述超顺磁性复合粒子的磁饱和强度为30 80emu/g，对应的外磁场响应速度为20 100秒，所述超顺磁性复合粒子的磁饱和强度具体为35 70emu/g，对应的外磁场响应速度为20 50秒，所述超顺磁性复合粒子的磁饱和强度尤其优选为40emu/g，对应的外磁场响应速度为20秒；所述超顺磁性复合粒子表面的羧基含量为50 500ymol/g，所述超顺磁性复合粒子表面的羧基含量具体为50 300 μ mol/g，所述超顺磁性复合粒子表面的羧基含量尤其优选为80 μ mol/g;所述三聚氰胺抗体亲和常数为IO6 IO8M-1 ；所述三聚氰胺抗体亲和常数具体为IO7 IO8M-1 ；所述三聚氰胺抗体亲和常数尤其优选为IO8MA
7.一种制备检测三聚氰胺的免疫层析试纸的方法，包括如下步骤I、分别制备样品垫和含有检测线和质控线的反应垫；II、将步骤I得到的样品垫、步骤I得到的含有检测线和质控线的反应垫与吸水垫依次粘贴到背板上，得到检测三聚氰胺的免疫层析试纸；所述含有检测线和质控线的反应垫按照如下方法制备将权利要求1-6中试纸中的所述三聚氰胺抗原和权利要求1-6中试纸中的所述与三聚氰胺抗体特异结合的抗抗体分别喷在反应垫的两端不同区域，形成检测线和质控线，得到含有检测线和质控线的反应垫；所述样品垫按照如下方法制备将权利要求1-6中试纸中的所述超顺磁性复合粒子标记三聚氰胺抗体喷到玻璃纤维纸上，得到样品垫。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于在所述样品垫制备方法中在将所述超顺磁性复合粒子标记三聚氰胺抗体喷到所述玻璃纤维纸上前，还包括预处理所述玻璃纤维纸和预处理所述超顺磁性复合粒子标记三聚氰胺抗体的步骤所述预处理所述玻璃纤维纸为将所述玻璃纤维纸在缓冲液中浸泡1小时， 所述缓冲液按照如下方法制备将每anlTritonXlOOUOg BSA、50g蔗糖和950ml浓度为0. 02M、pH为7. 4的PBS缓冲液混合得到缓冲液，调pH到7. 4，并定容到1000ml。 所述浸泡的时间为1小时，浸泡的温度为37°C ；所述预处理所述超顺磁性复合粒子标记三聚氰胺抗体为将所述超顺磁性复合粒子标记三聚氰胺抗体稀释，所述稀释倍数为50倍； 所述反应垫为硝酸纤维素膜。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于在步骤I后，步骤II前，还包括干燥步骤I得到的样品垫与步骤I得到的含有检测线和质控线的硝酸纤维素膜的步骤。
10.权利要求1-6任一所述试纸在检测样品中残留三聚氰胺中的应用，所述样品具体为奶粉或牛奶。
全文摘要
本发明公开了一种检测三聚氰胺的免疫层析试纸及其制备方法。本发明提供的检测三聚氰胺的免疫层析试纸，包括含有超顺磁性复合粒子标记三聚氰胺抗体的样品垫、连接于所述样品垫一端的硝酸纤维素膜、连接于所述硝酸纤维素膜另一端的吸水垫；所述硝酸纤维素膜包被有相互分离的检测线和质控线，所述检测线含有三聚氰胺抗原，所述质控线含有能与所述三聚氰胺抗体特异结合的抗抗体。本发明的实验证明，用本发明提供的试纸检测三聚氰胺，灵敏度高、特异性强、快速、简便，可实现客观化测定。
文档编号G01N33/531GK102353773SQ201110157278
公开日2012年2月15日 申请日期2011年6月13日 优先权日2011年6月13日
发明者吴峰, 袁航, 马岚 申请人:清华大学深圳研究生院
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