专利名称：甲基化dna的检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种传感装置和方法，尤其涉及一种适合检测甲基化DNA的传感装置和方法。
背景技术：
在化学科学中，甲基化表示甲基基团加入到底物上或者原子或基团被甲基基团取代。甲基化是特定的甲基基团而不是更大的碳链取代氢原子的烷基化形式。这些术语通常用在化学、生物化学、土壤科学和生物科学中。在生物系统中，甲基化由酶催化；这种甲基化可以参与重金属的修饰，基因表达的调控、蛋白功能的调控，以及RNA代谢。重金属的甲基化也可以发生在生物系统外。组织样 品的化学甲基化也是减少特定组织学染色伪差(histological staining artefacts)的一种方法。脊椎动物中的DNA甲基化通常发生在CpG位点(胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤位点；即，在DNA序列中在该位点胞嘧啶后直接为鸟嘌呤)；这种甲基化导致胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶。Me-CpG的形成由DNA甲基转移酶催化。大部分哺乳动物的DNA有大约40%的CpG位点被甲基化，但存在富含GC (由大约65%的CG残基组成)的被称为CpG岛的特定区域，该区域内CpG位点不被甲基化。这些与56%的哺乳动物基因的启动子相关，所述哺乳动物基因包括所有无所不在地表达的基因。1-2%的人类基因组为CpG簇，并且在CpG甲基化和转录活性之间存在逆相关。DNA甲基化涉及在胞嘧啶嘧啶环的5位置或腺嘌呤嘌呤环的第6位氮(胞嘧啶和腺嘌呤为DNA的四个碱基中的两个)上加入甲基基团。这种修饰可以通过细胞分裂遗传。DNA甲基化通常在受精卵形成阶段被去除并且在发育阶段通过连续的细胞分裂被重建。DNA甲基化是高等生物中正常机体发育和细胞分化的重要部分。DNA甲基化稳定地改变细胞中基因的表达模式以便细胞能够“记得它们曾在何处”；换句话说，在胚胎发育期间程序化为胰岛的细胞在机体的整个生命中依然为胰岛，但没有持续的信号告诉它们需要依然为胰岛。另外，DNA甲基化抑制病毒基因和其它有毒元件(该有毒元件已随着时间整合到了宿主的基因组中)的表达。DNA甲基化也形成染色质结构的基�。馐瓜赴芄恍纬衫醋缘ヒ环峭槐涞腄NA序列的多细胞生命所必需的多数特征。DNA甲基化还在几乎所有类型的癌症发展中起着重要的作用。DNA甲基化涉及在DNA上加入甲基基团——例如，在胞嘧啶嘧啶环的第5位碳上——在这种情况下具有降低基因表达的特殊效果。在成人的体组织中，DNA甲基化通常发生在CpG 二核苷酸环境中；非CpG的甲基化在胚胎干细胞中是普遍的。亚硫酸氢盐测序法是利用亚硫酸氢盐处理DNA以确定它的甲基化模式。DNA甲基化是首次发现的表观遗传标记(epigenetic mark),并且仍然是研究最多的。它还参与转录活性的抑制。使用亚硫酸氢盐处理的DNA将胞嘧啶残基转变为尿嘧啶，但保留了不受影响的5-甲基胞嘧啶残基。因此，亚硫酸氢盐处理在DNA序列中引入了特定的改变，这种改变依赖于个体胞嘧啶残基的甲基化状态，产生有关DNA片段甲基化状态的单核苷酸分辨率信息(single-nucleotide resolutioninformation)。可以对改变的序列进行多种分析以获得这种信息。这种分析的目的因此变为区分由亚硫酸氢盐转变导致的单核苷酸多态性(胞嘧啶和胸腺嘧啶)。可以通过焦磷酸测序进行测序,这不同于双脱氧测序(Sanger sequencing),焦磷酸测序依赖于核苷酸掺入上释放的焦磷酸的检测，而不依赖于双脱氧核苷酸的链终止反应。使用Infinium II 平台的 Illumina 甲基化试验(Illumina Methylation Assay)利用“珠状芯片(BeadChip)”技术产生人类DNA甲基化的综合基因组图谱(comprehensivegenome wide profiling),与亚硫酸氢盐测序和焦磷酸测序相似。根据Staaf等 (2008), "Infinium II试验似乎在荧光检测中使用的两个通道之间存在染料强度偏差(dye intensity biases)。另外，即使数据通过在BeadStudio软件中使用的标准化算法(normalization algorithms)进行处理后这种偏差也没被消除。用于DNA甲基化生物标记分析的样品通常包括来自肿瘤的高浓度的背景DNA。然而，肿瘤来源的DNA因为通常以非常低的浓度存在而难以检测，而且能够被来自健康细胞的DNA大范围地污染。因此，常常需要对在大量未甲基化的背景DNA中的单拷贝的甲基化DNA具有灵敏检测能力的方法，以鉴定体液中异常甲基化的肿瘤来源的DNA。其后进行不同的分析步骤的不同类型的预处理的样品DNA的结合，导致了大量的测定DNA甲基化模式和图谱的技术。特别地，甲基化分析的方法分为3组基于限制性内切酶的、基于染色质免疫沉淀的(ChIP)或基于亲和力的以及亚硫酸氢盐转变(基于基因的)。基于限制性内切酶的方法通过结合甲基化敏感的限制性内切酶的使用和用于总甲基化分析的实验方法(RLGS，DMH等)使用甲基化敏感的限制性内切酶用于小/大范围的DNA甲基化分析，该方法可以应用于任何未知DNA序列的基因组。然而，需要大量的基因组DNA，使得当回收少量DNA时所述方法不适于样品的分析。另一方面，基于ChIP的方法对肿瘤中不同甲基化区域的鉴定是有效的，该方法通过使用针对蛋白质的抗体从溶液中沉淀出蛋白质抗原。这些方法是基于蛋白质的，广泛应用在癌症研究中。尽管这些优点，基于蛋白质的方法局限在特定位点的甲基(CH3)基团的检测，在通过限制性内切酶识别序列的频率获得的数据上有局限性，当抗体附着后需要额外扩增时变得复杂。MSP因其高分析灵敏度而著称，然而其能够被引物设计和PCR循环数影响，因此，存在由假阳性结果引起的风险，当在癌症早期识别中使用甲基化技术时，据称该风险是重大问题之一，所以，增加甲基化检测的特异性代表了在适当的早期识别试验的发展中重要
的一步。本发明的发明人认识到目前的方法具有高成本的所需手段去检测荧光，并且通常与标准高容量生产工艺例如CMOS工艺不兼容
发明内容
根据本发明的第一方面,提供一种离子敏场效应晶体管(ion sensitive fieldeffect transistor) (ISFET)在检测DNA样品中甲基化的核苷酸中的应用。根据本发明的第二方面，提供一种检测DNA样品中甲基化的核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤使用区别甲基化的和非甲基化的核苷酸的试剂处理DNA样品，以提供处理的DNA ；对所述处理的DNA进行扩增；以及
可选择地，对扩增的DNA进行测序；其中，ISFET监测在扩增和/或测序步骤中的链延伸反应期间一个或多个dNTP在DNA链上的添加。在扩增和合成测序期间，离子被释放或消耗。例如，当核苷酸加入到链延伸反应中·时氢离子被释放。可以通过ISFET引起的电信号输出的改变对这些离子进行检测。试剂可以是选择性地结合DNA样品中甲基化的核苷酸的甲基基团的抗体。然后可以将样品进行免疫沉淀反应，从而分离结合抗体的DNA片段(S卩，甲基化的片段)和未结合抗体的片段(即，未甲基化的片段)。在用试剂处理前，DNA样品可以经过一步或多步额外的加工。可以纯化DNA，或可以加工DNA以便将DNA链破碎为更小的片段。例如，DNA可以经超声处理(sonication)或限制性内切酶消化。试剂可以选择性地与甲基化的或未甲基化的核苷酸反应。在一种实施方式中，试剂含有亚硫酸氢盐(bisulf ite)，其仅将DNA样品中未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，不转变甲基化的胞嘧啶。在特定的实施方式中，试剂为亚硫酸氢钠。DNA的扩增可以使用PCR (聚合酶链反应)或等温扩增进行。甲基化的核苷酸可以通过对处理的DNA链进行定量PCR来检测。在DNA经亚硫酸氢盐(HSO3-离子，例如，亚硫酸氢钠，NaHSO3)处理的情况下，可以使用甲基化特异性引物进行PCR。甲基化特异性引物在原始DNA样品中对应于甲基化的胞嘧啶的位置加入鸟嘌呤。由于甲基化的胞嘧啶没有被亚硫酸氢盐转变为尿嘧啶，鸟嘌呤核苷酸将与未转变的胞嘧啶互补，允许引物结合到处理的DNA上，因此，仅能扩增来自甲基化的样品的处理的DNA链。可选择地，可以使用未甲基化特异性引物，这仅能扩增来自未甲基化的样品的处理的DNA链。这些引物在原始样品中对应于未甲基化的胞嘧啶的位置加入腺嘌呤而不是鸟嘌呤。由于未甲基化的胞嘧啶被亚硫酸氢盐转变为尿嘧啶，腺嘌呤将与尿嘧啶互补，允许引物结合到处理的DNA上，因此，仅能扩增来自未甲基化的样品的处理的DNA链。在特定的实施方式中，所述方法包括以下步骤使用将未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶的亚硫酸氢盐处理DNA样品，以提供处理的DNA ；以及使用甲基化特异性的或非甲基化特异性的引物对处理的DNA进行PCR扩增；其中，ISFET监测PCR过程中dNTPs在链延伸反应中的添加。便利地，这种方法允许在PCR反应过程中对DNA样品中甲基化的直接检测，不需要PCR产物的后续分析(例如，通过测序)，尽管如果需要，也可以进行测序。本发明还包括通过提供待测样品并用区分甲基化的和未甲基化的核苷酸的操作工序处理样品来检测DNA样品中甲基化的核苷酸的应用和方法。使用离子敏场效应晶体管(ISFET)检测所述工序的直接或间接结果。所述结果可以是化学反应的副产物。反应通常包括几千个分子都同时进行相同的反应。反应可以是DNA合成,并且离子电荷(ionic charge)的波动表明三磷酸双脱氧核甘酸(di-deoxynucleotide triphosphates) (ddNTP)和三憐酸脱氧核苷酸(dNTP)的插入。副产物的类型或量取决于一个或多个核苷酸的甲基化。待检测的DNA样品可以使用亚硫酸氢盐处理以将甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶。
处理的链可以经过创建DNA链的工序，DNA链中如果存在尿嘧啶，则尿嘧啶已经被胸腺嘧啶取代。处理的链可以经过扩增，例如，PCR或等温。在扩增期间制备了处理的链的许多拷贝(copies)。这些拷贝可以通过多种工序进行测序，在这些工序中离子被释放或消耗。例如，合成测序过程中，在核苷酸加入到链的过程中氢离子可能被释放。可以通过ISFET引起的电信号输出的改变对这些离子进行检测。甲基化的核苷酸可以通过对处理的链进行定量PCR进行检测。可以使用甲基化特异性引物，这使得仅能扩增来自甲基化样品的处理的链。可选择地或个别地，可以使用未甲基化特异性引物，这使得仅能扩增来自未甲基化的样品的处理的链。目前的方法允许在PCR过程中少数位置的甲基化状态的直接检测，不需要对产物进行后续分析。根据本发明的另一方面，提供一种测定DNA链中一个或多个甲基化的核苷酸的位置的方法。根据本发明的第四方面，提供一种测定DNA样品中甲基化的核苷酸的数量的方法。根据本发明的进一方面，提供一种检测甲基化的DNA的装置，所述装置包括在第一基材上的ISFET，以及具有使DNA样品与ISFET接触的微流控室的第二基材。装置可以包括亚硫酸氢盐。装置可以进一步包括用于进行PCR的温度循环器。装置可以包括单个反应室或多个反应室。每个反应室可以包括ISFET。在具体的实施方式中，提供4个室，每个室包括ISFET。每个室可以包括用于PCR反应的不同的dNTP或不同的引物或探针。在本发明的一方面，提供一种测量DNA甲基化的装置，所述装置包括能与含有DNA的第一样品接触(exposable)的第一离子敏场效应晶体管(ISFET);能与含有DNA的第二样品接触的第二 ISFET ；以及提供输出信号的电路，所述输出信号源自第一和第二 ISFET的信号。第二样品可以为具有已知甲基化量的参比样品。第一样品可以为甲基化的样品，并且可以与第二样品进行比较，所述第二样品可以为未甲基化的样品。输出信号可以为第一和第二 ISFET的信号的比。装置可以还包括多个第一 ISFET，每个ISFET与具有不同甲基化簇的样品接触。
ISFET可以倾向于在弱反型区(weak inversion region)中运转。ISFET和电路可以被集成在基材上，ISFET的晶体管形成部分电路。ISFET的信号可以为电流，并且电路的输出信号可以为所述电流的比。上述装置的输出信号可以与阈值信号比较，以指示在目的位点与相当的甲基化值相关的潜在的诊断或治疗的结果。在本发明的任一方面中都可以发生链延伸和氢离子释放，导致ISFET的电输出和信号的离散波动。这可以和例如这里所描述的对照进行比较。例如，ISFET的电输出和信号可以与和探针互补的靶序列缺失的情况进行比较。在添加dNTPs后监测ISFET的电输出
信号。
现仅参照附图通过实施例的方式描述本发明的具体实施方式
，其中图I阐明了与a)常规的ISFET布置和b)浮栅ISFET接触的样品溶液。图2a显示了 IFSET宏观模型；图2b显示了 CMOS ISFET宏观模型；图3显示了在商业CMOS技术中的典型工艺流程；图4为显示超甲基化频率、不同肿瘤抑制基因和不同肿瘤类型之间关系的3维代表图；图5显示了在正常细胞和肿瘤细胞中转录的甲基化的效应；图6例证了经亚硫酸氢盐处理后并进行PCR的DNA样品中依照本发明的实施方式的甲基化的和未甲基化的DNA的转变；图7显示了 DNA样品中依照本发明的实施方式的测定甲基化量化指标(metricsquantifying)的步骤的顺序；图8图解显示了基于(a)免疫沉淀反应和(b)亚硫酸氢盐转变的甲基化检测的方法;图9和10显示了使用亚硫酸氢盐处理和已知分析方法检测DNA序列的方法中的步骤；图11图解显示了本发明实施方式的方法；图12显示了依照本发明实施方式的甲基化的细胞的图解；图13显示了依照本发明的实施方式结合ISFET以提供输出信号的电路；以及图14显示了包括多个如图13显示的提供输出信号的电路的电路系统。
具体实施例方式在一个实施方式中，并参照图11提供待测的DNA样品，纯化并将其放入微流控室中，使其与ISFET接触。亚硫酸氢盐处理改变DNA样品，使得未甲基化的胞嘧啶位点变为尿嘧啶。使用PCR扩增处理的样品。在产生的DNA拷贝中尿嘧啶位点变为胸腺嘧啶。将拷贝变性，并将探针杂交到目的区(例如，肿瘤启动子区)。进行合成测序，每次添加一个不同的dNTP到室中。在加入dNTP到待定位点的过程中氢离子被释放。鸟嘌呤与甲基化的胞嘧啶合并，腺嘌呤与原始的胸腺嘧啶和对应于尿嘧啶(对应于未甲基化的胞嘧啶)的胸腺嘧啶合并。在每个已知的dNTP添加的过程中，监测ISFET的电输出信号。在可选择的实施方式中；提供待测样品，纯化并将其放入微流控室中，使其与ISFET接触。亚硫酸氢盐处理改变样品，使得未甲基化的胞嘧啶位点变为尿嘧啶。使用PCR扩增处理的样品。在产生的DNA拷贝中尿嘧啶位点变为胸腺嘧啶。在目的为检测甲基化胞嘧啶的位点设计具有鸟嘌呤的探针，或在目的为检测未甲基化的胞嘧啶(尿嘧啶)的位点设计具有腺嘌呤的探针，所述探针杂交到扩增的DNA的变性 的单链拷贝上。一起添加多个dNTP到室中，或每次一个。在多个dNTP加入到探针的3’端或链延伸的过程中氢离子被释放。在存在和探针互补的靶序列的情况下，将发生链延伸和氢离子释放，导致ISFET的电输出和信号的离散波动。这可以与和探针互补的靶序列缺失的情况下进行比较。在添加dNTPs后监测ISFET的电输出信号。在另一种实施方式中提供待测样品，纯化并将其放入微流控室中，使其与ISFET和用于所述室热循环的装置接触。亚硫酸氢盐处理改变样品，使得未甲基化的胞嘧啶位点变为尿嘧啶。在目的为检测甲基化的胞嘧啶(尿嘧啶)的位点设计具有鸟嘌呤的或在目的为检侧未甲基化的胞嘧啶(尿嘧啶)的位点设计具有腺嘌呤的一对扩增引物，将所述引物随同扩增试剂、聚合酶和过量的dNTPs添加到所述室中。热循环样品进行PCR，并且随着热循环的进行监测ISFET的电输出信号。在PCR的链延伸阶段多个dNTPs加入到探针的3’端，在该过程中氢离子被释放。在和探针互补的靶序列存在的情况下，将发生链延伸和氢离子的释放，导致ISFET的电输出信号的离散波动，这可以与和探针互补的靶序列缺失的情况进行比较。然而，因为扩增混合物将缓冲氢离子的释放，所以为了产生电输出信号响应在靶DNA存在的情况下在扩增过程中来自链延伸的PH上升的变化，必须进行超过阈值循环数的扩增用于克服样品的缓冲能力。上述任何实施方式可以合并步骤，或以不同的顺序弓I进试剂。监测波动发生的时间和波动的量级以允许对DNA进行测序，这转而决定原始样品中甲基化的或未甲基化的胞嘧啶的位置。电信号可以与具有参比ISFET的对照室的参比信号或参比电极进行比较。信号的不同将表明在序列位置已知核苷酸的加入与未加入。处理的样品的序列可以与对照的序列或之前的样品进行比较以确定样品中甲基化的胞嘧啶的数量和位置。例如，胸腺嘧啶替换胞嘧啶(分别通过加入腺嘌呤替换鸟嘌呤)的存在可能表明了原始样品在特定位点包括未甲基化的胞嘧啶。样品DNA的甲基化发生在已知为信使RNA启动子的区域，并且可以影响DNA的表达。样品中甲基化的DNA的量以及原始DNA的甲基化百分比将影响来自ISFET的信号输出的量级。这种信号提供甲基化量的指示以及提供甲基化发生在何处，例如，预测肿瘤存在的概率。
方法可以结合或不结合热循环使用。例如，可以使用热循环并利用测序酶(例如，taq聚合酶或重组的T7聚合酶)以促进最优化。在使用T7聚合酶的情况下，可以提高速度和改善监测核苷酸插入的准确性。例如，可以调节试剂混合物的pH。pH的降低将导致更多氢离子的产生，但也将趋于结束(kill off)反应。试验表明pH6. 8为适宜的pH值。将在试剂混合物中加入镁以激活酶。试剂的浓度是可以改变的。表I中列出了典型的热循环顺序。
持续时间作用95。C30iDNA模板的变性
55。CWs引物的退火
72。C60sDNA延伸和终止
·
表I循环测序在热循环仪中的操作使得以最少的操作进行测序工序的多次重复。这使得信噪比升高并且容易描述难以阅读的区域(例如，富含GC区或单核苷酸重复区)。ISFET以源区和漏区的MOSFET结构为基�。哂杏刹伪鹊缂峁┑脑冻陶ぃ霾伪鹊缂┞队诘缃庵嗜芤褐杏腭詈显诨咀爸猛ǖ郎系幕舾械木堤宓缛萁哟�。尽管有时如此描述，但ISFET的定义并不只限于如图Ia中所示的没有金属栅的结构。更通常的情况下，ISFET被定义为具有阈值电压由离子浓度变化调节的离子敏感栅(ion-sensitive gate)结构的任意FET。离子敏感栅结构可以纯粹由如图Ia所示的无机或有机绝缘膜组成，或由包括连接到被离子敏感绝缘膜覆盖的一个或多个金属层上的电浮动多晶娃栅的叠栅(stacked gate)结构组成。在优选的实施方式中，具有氮化硅绝缘层的pH敏感的ISFETs是根据后者叠栅结构的标准CMOS工艺制造的。这是文献[1-4]中普遍报道的确定技术，它具有在标准半导体厂不需要修改工序流程、额外的掩膜步骤或任何后处理步骤的可大量制造的优点。基于CMOS的pH-ISFET结构使用钝化层(passivation layer)作为绝缘层与待测pH的电解质溶液接触，所述钝化层一般为氮化硅或氧氮化硅，并使用在给定的CMOS工艺中可获得的一个或几个金属层的浮动叠栅，所述浮动叠栅连接在基本场效应晶体管的多晶硅栅和钝化层之间(图lb)。应用于参比电极的任意电压通过电解质电容性稱合(capacitively-coupled)到绝缘体的表面，在这个界面上来自离子的pH依赖型电荷调节通道电流。这引起了在ISFETID-VGS信号-光特性(transfer characteristic)中可观察到的变化,这可以表示为其阈值电压(Vth)的调节。在钝化表面上积累的CMOS ISFET pH依赖型电荷电容性耦合到其下方的浮栅结构上，所述浮栅结构转而穿过栅氧化层(gate oxide)电容性稱合到基本场效应晶体管的源极和漏极终端之间的通道上。因此，当通过参比电极(通常是Ag/AgCl或在微分应用中的Pt伪-电极)倾向于ISFET时，在绝缘体表面上离子浓度的变化调节ISFET的电输出。可以使用CMOS铸造厂(图3)的标准工艺步骤。应用于参比电极的任意电压通过电解质电容性耦合到绝缘体的表面，在这个界面上来自离子的pH依赖型电荷调节通道电流。这引起了在ISFET信号-光特性中可观察到的变化，这可以表示为其阈值电压(Vth)的调节。如果ISFET的阈值电压的定义是参照其远程栅(G)，参比电极，它可以表示为掩饰它的装置的固有的MOSFET阈值电压和参比电极和顶部金属层之间的与多晶硅栅接触的电势的结合(图2b)。Vth(ISFET) — Vth(MOSFET)+Vchem ⑴Vchem = Y +2. 3 a UTpH(2)其中，Y为所有pH不依赖型化学势组，并且UT为如[5]中描述的热电压kT/q或RT/F。以及更详细地，Vth(MOSFET)—小 ms+2 Φ f_ (Qss+Qsc)/Coz (3)
和
权利要求
1.离子敏场效应晶体管在检测DNA样品中甲基化的核苷酸中的应用。
2.一种检测DNA样品中甲基化的核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤 使用区别甲基化的和非甲基化的核苷酸的试剂处理DNA样品，以提供处理的DNA ； 对所述处理的DNA进行扩增；以及 可选择地，对扩增的DNA进行测序； 其中，ISFET监测在扩增和/或测序步骤中的链延伸反应期间一个或多个dNTP在DNA链上的添加。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述试剂是选择性地结合DNA样品中甲基化的核苷酸的甲基基团的抗体。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，将所述处理的DNA进行免疫沉淀反应，从而分离结合抗体的DNA和未结合抗体的DNA。
5.根据权利要求3或4所述的方法，该方法进一步包括在使用所述试剂处理前，将所述DNA样品进行加工以便将所述DNA破碎为更小的片段的初始步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述加工为超声处理。
7.根据权利要求2所述的方法，其中，所述试剂含有亚硫酸氢盐，所述亚硫酸氢盐仅将DNA样品中未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶。
8.根据权利要求2-7中任意一项所述的方法，其中，使用PCR进行所述处理的DNA的扩士豳>曰ο
9.根据权利要求8所述的方法，该方法从属于权利要求7，其中，使用甲基化特异性引物进行PCR，所述甲基化特异性引物仅能扩增由甲基化的DNA产生的处理的DNA链。
10.根据权利要求8所述的方法，该方法从属于权利要求7，其中，使用非甲基化特异性引物进行PCR，所述非甲基化特异性引物仅能扩增由未甲基化的DNA产生的处理的DNA链。
11.一种检测DNA样品中甲基化的核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤 使用将未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶的亚硫酸氢盐处理DNA样品，以提供处理的DNA ；以及 使用甲基化特异性的或非甲基化特异性的引物对所述处理的DNA进行PCR扩增； 其中，ISFET监测PCR过程中dNTPs在链延伸反应中的添加。
12.测量DNA甲基化的装置，所述装置包括 能与含有DNA的第一样品接触的第一离子敏场效应晶体管； 能与含有DNA的第二样品接触的第二 ISFET ;以及 提供输出信号的电路，所述输出信号源自第一和第二 ISFET的信号。
13.根据权利要求12所述的装置，其中，所述第一样品为甲基化的样品，并且与第二样品进行比较，所述第二样品为未甲基化的样品。
14.根据权利要求12所述的装置，其中，所述第二样品为具有已知甲基化量的参比样品O
15.根据权利要求12所述的装置，其中，所述第二样品。
16.根据权利要求12所述的装置，其中，所述输出信号为第一和第二ISFET的信号的比。
17.根据权利要求12所述的装置，其中，所述装置还包括多个第一ISFET，每个ISFET能与具有不同甲基化簇的样品接触。
18.根据权利要求12-17中任意一项所述的装置，其中，所述ISFET倾向于在弱反型区中运转。
19.根据权利要求12-18中任意一项所述的装置，其中，所述ISFET和电路被集成在基材上,所述ISFET的晶体管形成部分电路。
20.根据权利要求19所述的装置，其中，所述ISFET的信号为电流，并且所述电路的输出信号为所述电流的比。
21.根据权利要求12-20中任意一项所述的装置，其中，将所述输出信号与阈值信号进行比较，以指示在目的位点与相当的甲基化值相关的潜在的诊断或治疗的结果。
22.根据权利要求12-21中任意一项所述的装置，用于权利要求I的应用或用于根据权利要求2-11中任意一项所述的方法。
全文摘要
描述了离子敏场效应晶体管(ISFET)在检测DNA样品中甲基化的核苷酸中的应用。一种检测DNA样品中甲基化的核苷酸的方法，可以包括以下步骤使用区别甲基化的和非甲基化的核苷酸的试剂处理DNA样品，以提供处理的DNA；对所述处理的DNA进行扩增；以及可选择地对扩增的DNA进行测序。将ISFET用于监测在扩增和/或测序步骤中的链延伸反应期间一个或多个dNTP的添加。还提供了合适的装置。
文档编号G01N27/414GK102892902SQ201180023455
公开日2013年1月23日 申请日期2011年3月14日 优先权日2010年3月12日
发明者克里斯特弗·图马佐, M·卡罗佛诺 申请人:Dna电子有限公司
专业数控铣床产品供应商
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