专利名称：微泡和相关的微小rna的治疗用途的制作方法
微泡和相关的微小RNA的治疗用途相关申请的交叉引用本申请要求2010年8月13日提交的美国临时专利申请号61/373，715和2010年9月8日提交的美国临时专利申请号61/380，766的优先权，其每一个的全部内容通过引用并入本文。本申请涉及同日提交的名称为“细胞和分子疗法”(“Cellular and MolecularTherapies”)的美国申请,其全部内容通过引用并入本文。
背景技术：
微泡过去被认为是没有明显功能的细胞碎片。然而最近，越来越多的实验数据表明，微泡具有许多生物活性。例如，研究表明血小板衍生的微泡通过微泡上的表面蛋白(例如，CD154、RANTES 和 / 或 PF-4 ;参见 Thromb.Haemost.(1999)，82:794，或 J.Biol.Chem.(1999)，274:7545)而刺激选定的细胞。在其他实例中，报道了某些靶细胞上血小板微泡中生物活性脂质(例如，神经鞘氨醇-1-磷酸酯、HETE或花生四烯酸)的特定效应(参见例如，J.Biol.Chem.(2001)，276:19672 ;或 Cardiovasc.Res.(2001),49 (5):88)。而且，血小板微泡通过将某些微泡表面组分转移至被动员的细胞，从而增加被动员的CD34+内皮细胞的粘附(参见例如，Blood (2001)，89:3143)。已经有微泡的各种临床用途的提议。虽然这些提议的用途至少提供了一些有前景的观点，但依然存在几个很大程度上未解释的问题。例如，微泡的生物活性经常难以预测。而且，目前考虑的治疗用途通常需要 灭菌和抗病毒处理以预防接受含有微泡制剂的人被感染，这是耗时且没有效率的。因此，依然需要基于微泡的改进的组合物和使用方法。发明概述本发明提供了基于微泡的改进的方法和组合物，以用于治疗疾病、疾患或病症。具体地，本发明涵盖以下发现:微泡含有特定的微小RNA，所述微小RNA可以发挥参与细胞或组织再生、重塑、重建、重编程或转分化的细胞间调节子的功能。因此，本发明提供了基于微泡和/或相关的微小RNA的方法和组合物，提供了更可预测且有效的治疗结果。在一些实施方案中，本发明提供了治疗疾病、疾患或病症的方法，该方法包括给需要治疗的患者施用治疗有效量的微泡。在一些实施方案中，根据本发明的发明方法可用于治疗选自糖尿病、心肌梗死、肾病、创伤愈合、瘘管再生、神经再生(例如，CNS再生或外周神经系统再生)、乳房切除术之后的隆胸、与美容外科手术相关的病症及其组合的疾病、疾患或病症:。在一些实施方案中，本发明提供了在体内诱导组织修复、重塑、分化或转分化的方法，该方法包括给需要治疗的患者施用治疗有效量的微泡。在一些实施方案中，适合的微泡来源于与患病组织(即，靶组织)相同的组织。在一些实施方案中，适合的微泡来源于与患病组织(即，靶组织)不同的组织。在一些实施方案中，适合的微泡来源于胰脏细胞、肾细胞、肝细胞、脾细胞、淋巴结、子宫肌层细胞、外周血细胞、脐带血细胞、骨髓细胞、血清或其组合。在一些实施方案中，适合的微泡来源于胰腺衍生的探路者细胞。在一些实施方案中，适合的微泡来源于自体细胞。在一些实施方案中，适合的微泡来源于非自体细胞。在一些实施方案中，适合的微泡来源于非织造基底上生长的细胞。在一些实施方案中，非织造基底含有脂肪族聚酯纤维。在一些实施方案中，适合本发明的脂肪族聚酯纤维选自丙交酯(其包括乳酸D-、L-和内消旋丙交酯)、乙交酯(包括乙醇酸)、ε -己内酯、对二氧环己酮(1，4- 二氧杂环己烷-2-酮)、三亚甲基碳酸酯(1，3- 二氧杂环己烷-2-酮)的同聚物或共聚物及其组合。在一些实施方案中，适合的微泡来源于在氧压小于或等于5%的培养条件下生长的细胞。在一些实施方案中，适合的微泡来源于在室内空气氧条件下生长的细胞。在一些实施方案中，适合的微泡来源于生长至大约80-99%汇合的细胞。在一些实施方案中，适合的微泡来源于在血清饥饿条件下生长的细胞。在一些实施方案中，适合的微泡来源于在血清饥饿条件下生长约24小时的细胞。在一些实施方案中，适合的微泡来源于在血清充足条件下生长的细胞。在一些实施方案中，适合的微泡通过差速超速离心分离或纯化。在一些实施方案中，适合的微泡通过沉淀分离或纯化。在一些实施方案中，适合的微泡包含选自表I和表7-13所列的一种或多种微小RNA。在一些实施方案中，适合的微泡包含一种或多种微小RNA，所述一种或多种微小 RNA 选自 miRNA-122、miRNA-127、miRNA-133b、miRNA-323、miRNA-433、miRNA-451、miRNA-466h、miRNA_467c、miRNA_467e、miRNA-468、miRNA-491、miRNA-495、miRNA-546、miRNA-666、miRNA-680、miRNA-346、miRNA-136, miRNA-202、miRNA-369、miRNA-370、miRNA-375、miRNA_376b、miRNA-381、miRNA-434、miRNA-452、miRNA_465a、miRNA_465b、miRNA-470、miRNA_487b、miRNA-543、miRNA-547、miRNA-590、miRNA-741、miRNA-881、miRNA-206、miRNA_224、miRNA-327, miRNA-347 及其组合。在一些实施方案中，适合的微泡包含一种或多种微小RNA，所述一种或多种微小 RNA 选自 miRNA-122、miRNA-127、miRNA-133b、miRNA-323、miRNA-433、miRNA-451、miRNA-466h、miRNA_467c、miRNA_467e、miRNA-468, miRNA-491、miRNA-495, miRNA-546,miRNA-666、miRNA-680、miRNA-346 及其组合。在一些实施方案中，适合的微泡不含有miRNA-129-5p、miRNA-190, miRNA_203、miRNA-32、miRNA-34c、miRNA-376c、miRNA-384-3p、miRNA-499b、miRNA-455、miRNA-582-5p、miRNA-615-3p、miRNA-615-5p、miRNA-7b、miRNA-17-3p、miRNA-381 和 miRNA-505。在一些实施方案中，治疗有效量的微泡的范围是lfg-lmg/kg体重(例如，10fg-lmg/kg、100fg-lmg/kg、lpg-lmg/kg、10pg-lmg/kg、lOOpg-lmg/kg 体重)。在一些实施方案中,微泡通过静脉内、动脉内、肌肉内、皮下、经皮、皮内、颅内、鞘内、胸膜内、眼窝内、鼻内、口服、消化道内、结肠直肠和/或脑脊髓内施用。在一些实施方案中,微泡每天施用。在一些实施方案中，微泡每周施用。在一些实施方案中，微泡每两周施用。在一些实施方案中，微泡每月施用。
在一些实施方案中，本发明提供了通过施用从微泡获得、分离或纯化的一种或多种微小RNA来治疗疾病、疾患或病症的方法。在一些实施方案中，微泡来源于在血清饥饿条件下生长的细胞。在一些实施方案中，微泡来源于在血清饥饿条件下生长约24小时的细胞。在一些实施方案中，微泡来源于在血清充足条件下生长的细胞。在一些实施方案中，从微泡获得、分离或纯化的微小RNA在细胞和/或微泡中差异表达，所述细胞和/或微泡来源于在应激条件(例如，氧压、细胞培养汇合、培养基中的血清量，等)下生长的细胞。在一些实施方案中，本发明提供了治疗疾病、疾患或病症的方法，该方法包括给需要治疗的患者施用治疗有效量的一种或多种微小RNA，所述一种或多种微小RNA具有与SEQ ID NO: 1-72(例如，SEQ ID NO: 1-29)的任何一个至少 70% (例如，75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%)相同的序列。在一些实施方案中，一种或多种微小RNA具有与SEQ ID NO: 1-72 (例如，SEQ IDNO:1-29)的任何一个相同的序列。在一些实施方案中，本发明提供了治疗疾病、疾患或病症的方法，该方法包括给需要治疗的患者施用治疗有效量的一种或多种微小RNA，所述一种或多种微小RNA具有与表7-13中的序列的任何一个至少70% (例如，75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%)相同的序列。 在一些实施方案中，本发明提供了在体内诱导组织修复、重塑、分化或转分化的方法，该方法包括给需要治疗的患者施用治疗有效量的一种或多种微小RNA，所述一种或多种微小RNA具有与SEQ ID NO: 1-72 (例如，SEQ ID NO: 1_29)的任何一个至少70% (例如，75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%)相同的序列。在一些实施方案中，一种或多种微小RNA具有与SEQ ID NO: 1-72 (例如，SEQ ID NO: 1_29)的任何一个相同的序列。在一些实施方案中，本发明提供了在体内诱导组织修复、重塑、分化或转分化的方法，该方法包括给需要治疗的患者施用治疗有效量的一种或多种微小RNA，所述微小RNA具有与表7-13中的序列的任何一个至少 70% (例如，75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%)相同的序列。在一些实施方案中，根据本发明的发明方法可用于治疗选自糖尿病、心肌梗死、肾病、创伤愈合、瘘管再生、神经再生(例如，CNS再生或外周神经系统再生)、乳房切除术之后的隆胸、与美容外科手术相关的病症及其组合的疾病、疾患或病症。在一些实施方案中，一种或多种miRNA的治疗有效量的范围是lfg_lmg/kg体重(例如，10fg-lmg/kg、100fg-lmg/kg、lpg-lmg/kg、10pg-lmg/kg、100pg-lmg/kg 体重)。在一些实施方案中，一种或多种 miRNA通过静脉内、动脉内、肌肉内、皮下、经皮、皮内、颅内、鞘内、胸膜内、眼窝内、鼻内、口服、消化道内、结肠直肠和/或脑脊髓内施用。在一些实施方案中，一种或多种miRNA通过静脉内、动脉内、肌肉内、皮下、经皮、皮内、颅内、鞘内、胸膜内、眼窝内、鼻内、口服、消化道内、结肠直肠和/或脑脊髓内施用。在一些实施方案中，一种或多种miRNA每天、每周、每两周或每月施用。在一些实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含用于治疗各种疾病、疾患或病症的治疗有效量的微泡。在一些实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含用于治疗糖尿病、心肌梗死、肾病、创伤愈合、瘘管再生、神经再生(例如，CNS再生或外周神经系统再生)、乳房切除术之后的隆胸和/或与美容外科手术有关的病症及其组合的治疗有效量的微泡。在一些实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含一种或多种微小RNA以及药学可接受的载体，所述一种或多种微小RNA具有与SEQ ID NO: 1-72 (例如，SEQ IDNO: 1-29)的任何一个至少70% (例如，75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%)相同的序列。在某些实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含一种或多种微小RNA以及药学可接受的载体，所述一种或多种微小RNA具有与SEQ ID NO: 1-72 (例如，SEQ ID N0:l_29)的任何一个相同的序列。在某些实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含一种或多种微小RNA和药学可接受的载体，所述一种或多种微小RNA具有与表7-13中的序列的任何一个至少70% (例如，75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%)相同的序列。在某些实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含一种或多种微小RNA和药学可接受的载体，所述一种或多种微小RNA具有与表7-13中的序列的任何一个相同的序列。在一些实施方案中，一种或多种miRNA以治疗有效量存在，所述治疗有效量可治疗糖尿病、心肌梗死、肾病、创伤愈合、瘘管再生、神经再生(例如，CNS再生或外周神经系统再生)、乳房切除术之后的隆胸、与美容外科手术相关的病症或其组合。在一些实施方案中，本发明提供了用于鉴定诱导细胞生长和/或再生的miRNA的方法，该方法包括提供细胞，所述细胞在除去微泡的培养基中生长；向所述培养基添加miRNA ;确定与对照相比，所述miRNA的添加是否增加了细胞增殖速率，从而鉴定所述miRNA是否诱导细胞生长和/或再生。在一些实施方案中，所述细胞是胰腺衍生的探路者细胞。在一些实施方案中，所述细胞增殖速率通过倍增时间来确定。某些实施方案中，所述miRNA分离自微泡。在一些实施方案中，本发明提供了用于鉴定诱导细胞生长和/或再生的miRNA的方法，该方法包括:在生长至汇合的细胞中产生创伤区；用miRNA治疗所述细胞；确定与对照相比，在所述创伤区的被治疗的细胞的再生速率，从而鉴定所述miRNA是否诱导细胞生长和/或再生。在一些实施方案中，所述细胞是成纤维细胞或心肌细胞。在一些实施方案中，所述再生速率被定量确定。在一些实施方案中，所述对照是未经治疗、但在相同条件下生长的细胞。在一些实施方案中，所述miRNA分离自微泡。在一些实施方案中，本发明提供了使用本文描述的方法鉴定的、诱导细胞生长和/或再生的miRNA。在本申请中，除非另外说明，“或”的使用表示“和/或”。如本申请使用的，术语“包括”以及该术语的变化 形式，例如“包括”和“包括”，不是要排除其他添加物、组分、整数或步骤。如本申请使用的，术语“约”和“大约”等同地使用。本申请中使用的、带有或不带有约/大约的任何数字表示涵盖相关领域普通技术人员所理解的任何正常波动。在某些实施方案中，除非另外说明或者与上下文明显矛盾，术语“大约”或“约”指落入所述参考值任一方向(大于或小于)的 25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小的值的范围(除了这些数字会超过可能值的100%的情况)。本发明的其他特征、目的和优势在随后的发明详述、附图和权利要求中将是明显的。然而，应该理解，在本发明中说明实施方案的发明详述、附图和权利要求仅作为示例给出，而非限制。本发明范围内的各种变化和修饰对于本领域技术人员而言将是明显的。附图简述附图仅用于举例说明的目的，而不是为了限制。
图1A和IB显示了亚汇合的大鼠I3DPC细胞的示例性扫描电子显微镜照片，所述细胞适于在含有去除牛微泡的胎牛血清(FBS)的培养基中生长。两张图片的细胞表面都可以观察到正在形成的微泡。图2A和2B显示了微泡(MV)对大鼠I3DPC细胞生长速率的示例性影响。图2A描绘了牛MV的去除对大鼠I3DPC细胞倍增时间的影响。(绘制在y轴上的是电阻抗；负值指示细胞死亡和由此导致的负增长)。在43小时进行MV去除。观察到对倍增时间的负影响，稍后恢复。图2B显示了添加衍生自大鼠rope细胞的MV后，大鼠rope倍增时间的剂量依赖性恢复。在48小时去除培养物的MV，然后在10小时后添加外源性MV。与正常恢复时间相t匕，接受外源性MV的细胞的倍增时间的快速恢复明显提前。图3显示了含有微泡的细胞培养基的示例性差速离心分级分离。图4显示了对比大鼠PC、MV级分和外体(exosome)级分的miRNA表达谱的示例性图表。图表显示了与血清充足条件下生长相比，在血清饥饿条件下生长24小时后，表达发生了改变的miRNA的数目。被分析的大鼠miRNA基因总数=584。被分析的人miRNA基因总数=761。展示的数据来自N=I，在TLDA卡上的单基因表达分析的实验。图5显示了针对大鼠PC、MV级分和外体级分绘制的miRNA表达的示例性图表的对t匕。图表显示了与血清充足条件下生长相比，在血清饥饿条件下生长24小时后基因表达增加的miRNA。被分析的大鼠miRNA基因总数=584。展示的数据来自N=I，在TLDA卡上的单基因表达分析的实验。图6显示了对比大鼠PC、大鼠MSC和人PC的miRNA表达谱的示例性图表。图表显示了与血清充足条件下生长相比，在血清饥饿条件下生长24小时后，表达发生了改变的miRNA的数目。被分析的大鼠miRNA基因总数=584。被分析的人miRNA基因总数=761。展示的数据来自N=I，在TLDA卡上的单基因表达分析的实验。图7显示了对比人PC和获自人PC的微泡(MV)的miRNA表达谱的示例性图表。图表显示了与血清充足条件下生长相比， 在血清饥饿条件下生长24小时后，表达发生了改变的miRNA的数目。被分析的人miRNA基因总数=761。展示的数据来自N=I，在TLDA卡上的单基因表达分析的实验。 图8显示了对比获自大鼠PC的MV和获自人PC的MV的miRNA表达谱的示例性图表。图表显示了与血清充足条件下生长相比，在血清饥饿条件下生长24小时后，表达发生了改变的miRNA的数目。被分析的大鼠和小鼠miRNA基因总数=584。被分析的人miRNA基因总数=761。展示的数据来自N=I，在TLDA卡上的单基因表达分析的实验。图9显示了获自大鼠PC的MV和获自人PC的MV的miRNA表达谱的示例性图表对t匕。图表显示了与血清充足条件下生长相比，在血清饥饿条件下生长24小时之后基因表达增加或减少的miRNA。被分析的大鼠和小鼠miRNA基因总数=584。展示的数据来自N=l，在TLDA卡上的单基因表达分析的实验。定义为了使本发明更容易被理解，下文首先定义了一些术语。在说明书通篇都对以下术语和其他术语的其他定义进行了说明。动物:如本文使用的，术语“动物”指动物界的任何成员。在一些实施方案中，“动物”指处于发育任何阶段的人。在一些实施方案中，“动物”指处于发育任何阶段的非人动物。在某些实施方案中，非人动物是哺乳动物(例如，啮齿类动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、绵羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟、爬行动物、两栖动物、鱼、昆虫和/或蠕虫。在一些实施方案中，动物可以是转基因动物、基因工程动物和/或克隆。
大约:如本文使用的，术语“大约”或“约”用于一个或多个所描述的值时，指类似于所述参考值的值。在某些实施方案中，除非另外说明或者与上下文明显矛盾，术语“大约”或“约”指落入所述参考值任一方向(大于或小于)的25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小内的值的范围(除了这种数字会超过可能值的100%的情况)。自身免疫疾患:如本文使用的，术语“自身免疫疾患”指由其免疫系统对机体自身组织的攻击导致的疾患。在一些实施方案中，自身免疫疾病是糖尿病、多发性硬化、卵巢早衰、硬皮病、干燥病、狼疮、脱毛病(秃病)、多腺体衰竭、格雷夫斯(Grave’ s)病、甲状腺机能减退、多发性肌炎、乳糜泻、克罗恩病、炎性肠病、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝炎、垂体机能减退、格林-巴利(Guillain-Barre)综 合征、心肌炎、艾迪生(Addison)病、自身免疫性皮肤病(例如，牛皮鲜)、葡萄膜炎(uveititis )、恶性贫血、风湿性多肌痛、古德帕斯丘(Goodpasture)综合征、甲状旁腺机能减退、桥本氏(Hashimoto)甲状腺炎、雷诺氏现象、风湿性多肌痛和类风湿性关节炎。自体的和非自体的:如本文使用的，术语“自体的”表示来自相同生物体。在本申请上下文中，该术语用于表示，相互称为“自体的”细胞和/或微泡的群体不含有可以被视为同种异体或异种的任何材料，也就是说衍生自“外来”细胞源。如本文使用的，术语“非自体的”表示不来自同一生物体。糖尿病:如本文使用的，术语“糖尿病”指由遗传性的不能产生胰岛素(I型)或获得性的胰岛素抵抗(2型)引起的、以血液中异常高水平葡萄糖为特征的代谢疾病。I型糖尿病是由胰岛素生成不足引起，并导致糖、脂肪和蛋白质异常代谢的严重的慢性糖尿病形式。通常出现在儿童或青春期的疾病特征为血液和尿液中糖水平升高、烦渴、尿频、酸中毒和消瘦。I型糖尿病还称为胰岛素依赖型糖尿病。2型糖尿病是通常首先出现在成年期的较轻的糖尿病形式，并会因肥胖和怠惰的生活方式而加重。该疾病通常没有症状，通常由指示葡萄糖耐受不良的测试所诊断，并且通过饮食改变和运动养生来治疗。2型糖尿病还称为非胰岛素依赖性糖尿病。对照:如本文使用的，术语“对照”的含义是对比结果的标准，这在其领域可被理解。通常，在通过隔离变量以确定这些是变量的实验中，使用对照用于增加实验的完整性。在一些实施方案中，对照是与测试反应或测定同时进行的反应或测定，以提供对比物。在一个实验中，应用“测试”(即，测试了变量)。在另一个实验中，没有应用被测试的变量，“对照”。在一些实施方案中，对照是历史对照(即，之前进行的测试或测定的对照，或者之前已知的量或结果)。在一些实施方案中，对照是或包括印刷或以其他方式储存的记录。对照可以是阳性对照或阴性对照。在一些实施方案中，对照还被称为参考。美容外科手术:如本文使用的，术语“美容外科手术”指不涉及疾病疗法、但是涉及个体美容外观、特别是个体的皮肤或头发外观的改善的手术。美容外科手术的例子包括导致皮肤皱纹减少、皮肤紧实度增加、头发生长或光泽增加、灰发减少、秃病(特别是男性秃病)情况下的头发再生、头发生长(特别是面部毛发生长)的减少、乳房大小或形状的美容提闻和脂肪团减少。未加工的:如本文使用的，当术语“未加工的”与生物样品一起使用时，指基本上未精制状态的样品。例如，未加工的样品可以是细胞裂解物或活检组织样品。未加工的样品可以溶液或作为干制品存在。其衍生物:如本文使用的，术语“其衍生物”当与微泡或细胞一起使用时，指保留原始的至少一些生物活性(特别是诱导分化的能力和/或提供治疗益处的能力)的原始微泡或细胞群的级分或提取物(特别是含有RNA和/或DNA和/或蛋白质的那些)。该术语还包括复合的、包封的或配制的微泡或细胞(例如，已经被包封、复合或配制以促进施用的微泡)。衍生物的例子包括裂解物、冻干物(lyophiIates)和匀浆。功能障碍:如本文使用的，术语“功能障碍”指异常功能。分子(例如，蛋白)的功能障碍可以由与此类分子相关的活性增加或减少引起。分子的功能障碍可以由于分子本身或者直接或间接地与分子相互作用或调解分子的其他分子相关的缺陷引起。功能的:如本文使用的，“功能的”生物分子是分子表现出其特征的性质和/或活性形式的生物分子。功能衍生物:如本文使用的，在核苷酸序列(例如，微小RNA)的功能衍生物的上下文中，术语“功能衍生物”指保留了与原始序列基本类似的生物活性(功能或结构)的分子。功能衍生物或等同物可以是天然衍生物或者合成制备。示例性的功能衍生物包括具有一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加的核苷酸序列，但条件是保留了核酸的生物活性(例如，微小RNA)。炎症:如本文使用的，术语“炎症”包括许多疾患中存在的炎性病症，其包括但不限于:系统炎症反应(SIRS);阿尔茨海默病(和相关病症和症状，包括:慢性神经炎症、胶质激活；增加的小神经胶质；神经炎斑块形成；和对疗法的响应)；肌萎缩性侧索硬化(ALS)、关节炎(和相关病症和症状，包括但不限于:急性关节炎、抗原诱导的关节炎、与慢性淋巴细胞性甲状腺炎相关的关节炎、胶原诱导的关节炎、幼年型关节炎；类风湿性关节炎、骨关节炎、预后和链球菌诱导的关节炎、脊柱关节病、痛风性关节炎)、哮喘(和相关病症和症状，包括:支气管哮喘； 慢性阻塞性气道疾�。宦宰枞苑尾�、青少年哮喘和职业性哮喘)；心脑血管疾病(和相关病症和症状，包括粥样硬化；自身免疫性心肌炎、慢性心脏缺氧、充血性心脏衰竭、冠状动脉病、心肌病和心肌细胞功能障碍，包括:主动脉平滑肌细胞的活化；心肌细胞凋亡；和心肌细胞功能的免疫调节；糖尿病和相关病症和症状，包括自身免疫性糖尿病、胰岛素依赖性(I型)糖尿病、糖尿病性牙周炎、糖尿病性视网膜病和糖尿病性肾病) ’胃肠道炎症(和相关病症和症状，包括乳糜泻、相关骨质疏松、慢性结肠炎、克罗恩病、炎性肠病和溃疡性结肠炎)；胃溃疡；肝炎，例如病毒性和其他类型的肝炎、胆固醇结石和肝纤维化、HIV感染(和相关病症和症状，包括变性反应、神经变性反应和HIV相关的霍奇金疾病)、川崎(Kawasaki)综合征(和相关疾病和病症，包括皮肤粘膜淋巴结综合征、颈部淋巴节肿大、冠状动脉损伤、水肿、发热、白细胞增多、轻度贫血、脱皮、疹、结膜发红、血小板增多；多发性硬化、肾病变(和相关疾病和病症、包括糖尿病性肾病、终末期肾病、急性和慢性肾小球肾炎、急性和慢性间质性肾炎、狼疮肾炎、古德帕斯丘(Goodpasture)综合征、血液透析生存和肾缺血再灌注损伤)、神经变性疾病(和相关疾病和病症，包括急性神经变性、IL-1在衰老和神经变性疾病中的诱导、IL-1诱导的下丘脑神经元的塑性和慢性应激性高反应性)、眼病变(和相关疾病和病症、包括糖尿病性视网膜病、格雷夫斯(Graves)眼病和葡萄膜炎、骨质疏松(和相关疾病和病症，包括肺泡、股骨、桡骨、椎骨或腕骨骨质流失或骨折发生、绝经后骨质流失、积聚、骨折发生率或骨质流失率)、中耳炎(成人或儿童)、胰腺炎或胰腺泡炎、牙周疾病(和相关疾病和病症，包括成人、早期发作和糖尿病)；肺�。苑尾 ⒙员邱佳�、透明膜病、婴儿猝死综合综(SIDS)中的缺氧和肺�。还谧囱芑蚱渌芤浦参锏脑傧琳环缡。ɡ喾缡怨亟谘�、风湿性阿少夫(AschofT)体、风湿性疾病和风湿性心肌炎；甲状腺炎，包括慢性淋巴细胞性甲状腺炎；尿道感染，包括慢性前列腺炎、慢性骨盆疼痛综合征和尿石病。免疫疾患，包括自身免疫疾病，例如斑秃、自身免疫性心肌炎、格雷夫斯病、格雷夫斯眼病、硬化性苔藓、多发性硬化、牛皮鲜、系统性红斑狼疮、系统性硬化症、甲状腺疾病(例如，甲状腺肿和淋巴瘤性甲状腺肿(桥本氏甲状腺炎、淋巴结样甲状腺肿)、睡眠障碍和慢性疲劳综合征和肥胖症(非糖尿病性或者与糖尿病相关的)。对感染性疾病的抗性，例如利什曼原虫病、麻风、莱姆病、莱姆心炎、疟疾、脑型疟疾、脑膜炎、与疟疾相关的肾小管间质肾炎)，其由细菌、病毒(例如巨细胞病毒、脑炎、EB病毒、人类免疫缺陷病毒、流感病毒)或原生病毒(例如，恶性痕原虫、锥虫)所引起。对创伤的反应，包括脑外伤(包括中风和缺血、脑炎、脑病、癫痫、围产期脑损伤、延长的热性惊厥、SIDS和蛛网膜下出血)、低出生体重(例如脑性麻痹)、肺损伤(急性出血性肺损伤、古德帕斯丘综合征、急性缺血再灌注损伤)、职业和环境污染物(例如对毒性油综合征矽肺病的敏感性)引起的心肌功能障碍、辐射创伤，和创伤愈合反应(例如烧伤或热创伤、慢性创伤、手术创伤和脊髓损伤)的效率。激素调节，包括生育力/繁殖力、怀孕可能性、早产发生率、产前和产后并发症，包括早产低出生体重、脑性麻痹、败血病、甲状腺机能减退、氧依赖、颅异常、早发性停经。患者对移植的反应(排斥或接受)、急性期反应(例如发热反应)、一般的炎症反应、急性呼吸窘迫反应、急性全身性炎症反应、创伤愈合、粘合、免疫炎症反应、神经内分泌反应、发热发展和抵抗、急性期反应、应激反应、疾病易感性、重复运动应激、网球肘和疼痛管理和反应。诱导物:如本文使用的，术语“诱导物”指应用至细胞时能够诱导所述细胞的分化命运改变的任何分子或其他物质。体外:如本文使用的，术语“体外”指在人工环境下发生的事件，例如在试管或反应容器中、在细胞培养中、等，而不是在多细胞生物体内。体内:如本文使 用的，术语“体内”指在多细胞生物体例如非人动物内发生的事件。分离的:如本文使用的，术语“分离的”指:(1)已经与其最初生成时伴随它的组分(无论是天然和/或实验环境中)的至少一些分离，和/或(2)已经通过人工生成、制备和/或生产的物质和/或实体。分离的物质和/或实体可以与最初伴随其的其他组分的至少约10%、约 20%、约 30%、约 40%、约 50%、约 60%、约 70%、约 80%、约 90%、约 95%、约 98%、约 99%、基本上100%或100%分离。在一些实施方案中，分离的物质是超过约80%、约85%、约90%、约91%、约 92%、约 93%、约 94%、约 95%、约 96%、约 97%、约 98%、约 99%、基本上 100% 或 100% 纯的。如本文使用的，如果物质基本上不含其他组分，则是“纯的”。如本文使用的，术语“分离的细胞”指不包含于多细胞生物体中的细胞。微小RNA:如本文使用的，术语“微小RNA (miRNA)”指转录后调节子，其通常结合靶信使RNA转录物(mRNA)的三个初始未翻译区(3’ UTR)中的互补序列，所述结合通常导致基因沉默。通常，miRNA是短的核糖核酸(RNA)分子，例如21或22个核苷酸长。术语“微小RNA”和“miRNA”可互换地使用。微泡:如本文使用的，术语“微泡”指包含从各种类型的细胞衍生的质膜片段的膜颗粒。通常，微泡具有约IOnm至约5000nm (例如，约50nm至1500nm、约75nm至1500nm、约 75nm 至 1250nm、约 50nm 至 1250nm、约 30nm 至 lOOOnm、约 50nm 至 lOOOnm、约 IOOnm 至lOOOnm、约50nm至750nm等)的直径(或当颗粒不是球形时的最大尺寸)。通常,微泡的膜的至少一部分直接获自细胞(还称为供体细胞)。适合用于本发明的微泡可以通过膜反转、胞吐、脱落、气泡和/或出芽而起源于细胞。根据产生方式(例如，膜反转、胞吐、脱落或出芽)，本文包含的微泡可以表现出不同的表面/脂质特征。微泡的可选名称包括但不限于外体、核外体、膜颗粒、外体样颗�：偷蛲鲂∨�。如本文使用的，有时使用的缩写形式的“MV”是指微泡。探路者(Pathfinder)细胞:如本文使用的，术语“探路者细胞”指具有诱导或刺激组织修复、再生、重塑或分化能力的细胞。通常，探路者细胞诱导或刺激组织修复、再生、重塑或分化，而不是作为新组织自身的来源。在一些实施方案中，探路者细胞还称为“祖细胞”。如本文使用的，有时使用缩写形式“PC”是指探路者细胞。受试者:如本文使用的，术语“受试者”指人或任何非人动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。人包括产前和产后形式。在许多实施方案中，受试者是人。受试者可以是患者，其指疾病诊断或治疗的医疗提供者所面对的人。术语“受试者”在本文可与“个体”或“患者”互换使用。受试者可以罹患或易感于疾病或疾患，但是可以或可以不表现出疾病或疾患的症状。基本上:如本文使用的，术语“基本上”指表现出所关注的特征或性质的总的或接近总的范围或程度的定性条件。生物领域的普通技术人员将理解，生物和化学现象几乎不会彻底完成和/或反应完全，或实现或避开绝对的结果，即使有也非�：奔�。因此，术语“基本上”在本文用于记录许多生物和化学现象中固有的缺乏完全的可能性。罹患:“罹患”疾病、疾患和/或病症的个体已经被诊断或者表现出疾病、疾患和/或病症的一种或多种症状。
易感于:“易感于”疾病、疾患和/或病症的个体还未被诊断出疾病、疾患和/或病症。在一些实施方案中，易感于疾病、疾患和/或病症的个体可能不表现出疾病、疾患和/或病症的症状。在一些实施方案中，易感于疾病、疾患和/或病症的个体将发展疾病、疾患和/或病症。在一些实施方案中，易感于疾病、疾患和/或病症的个体将不发展疾病、疾患和/或病症。治疗有效量:如本文使用的，术语“治疗有效量”的治疗剂表示当施用给罹患或易感于疾病、疾患和/或病症的个体时，足以治疗、诊断、预防和/或延迟疾病、疾患和/或病症的症状发作的量。本领域普通技术人员将理解，治疗有效量通常通过包括至少一个单位剂量的给药方案来施用。治疗剂:如本文使用的，短语“治疗剂”指当施用给受试者时具有治疗效应和/或引发期望的生物和/或药理学效应的任何物质。在一些实施方案中，本发明的治疗剂指如本发明所述的肽抑制剂或其衍生物。转分化:如本文使用的，术语“转分化”指非干细胞转化成不同类型细胞的过程，或者已经分化的干细胞在其已经确定的分化途径之外产生细胞的过程。通常，转分化包括成熟细胞类型(或分化的细胞类型)的去分化和然后再分化。治疗:如本文使用的，术语“治疗”、“治疗”或“治疗”指用于部分或完全减轻、缓解、缓和、抑制、预防特定疾病、疾患和/或病症的一种或多种症状或特征，或者延迟其发作、减少其严重度和/或减少其发生的任何方法。治疗可以施用给不表现出疾病征兆和/或仅表现出疾病早期征兆的受试者，目的是减少发生与疾病相关的病变的风险。某些实施方案的详述本发明特别提供了，在其他方面，基于微泡或微泡相关的微小RNA的改进的组合物和方法，其用于诱导组织修复、重塑、重建、分化或转分化和/或用于治疗相关疾病、疾患和病症。以下章节详细描述了本发明的各个方面。章节的使用不是要限制本发明。每个章节可以应用于本发明的任何方面。在本申请中，除非另外说明，“或”的使用表示“和/或”。1.微泡如本文使用的，术语“微泡”指包含来自各种类型的细胞的质膜片段的膜颗粒。通常，微泡是具有约IOnm至约5000nm (例如，约50nm至1500nm、约75nm至1500nm、约75nm至 1250nm、约 50nm 至 1250nm、约 30nm 至 lOOOnm、约 50nm 至 lOOOnm、约 IOOnm 至 lOOOnm、约50nm至750nm等)直径(或当颗粒不是球形时的最大尺寸)的小颗粒。通常，微泡的膜的至少一部分直接获自细胞(还称为供体细胞)。适合用于本发明的微泡可以通过膜反转、胞吐、脱落、气泡和/或出芽而从细胞起源。根据产生方式(例如，膜反转、胞吐、脱落或出芽)，本文包含的微泡可以表现出不同的表面/脂质特征。微泡的可选名称包括但不限于外体、核外体、膜颗粒、外体样颗�：偷蛲鲂∨�。设想微泡可以用作RNA和蛋白分子能够穿行于细胞之间的手段。不希望受任何特定理论束缚，设想来源于胰腺衍生的探路者细胞(PDPC)的微泡可以通过特定mRNA、miRNA和/或蛋白的转移而刺激修复过程。然而，在本发明之前，还没有对与微泡相关的特定微小RNA进行过表征。如微小RNA和实施例章节中所讨论的，本发明的发明人已经开发了有效的体外测定来分析和鉴定微小RNA。令人意外地，本发明人发现某些微小RNA特异性地存在于微泡(即，仅存在于微泡中而不存在于细胞中)。该发现首次证明，微泡不只包含随机取样的胞质或内体内容物。本发明设想，特异性地存在于微泡中的那些微小RNA可以是对于诱导组织修复、重塑、重建、分化或转分化而言重要的细胞内调节子。供体细朐在本发明中使用的微泡可以获自任何类型的细胞。如本文使用的，产生微泡的细胞也称为供体细胞。适合的供体细胞可以包括原核细胞、古细菌细胞、真菌细胞以及单细胞和多细胞真核细胞。在一些实施方案中，微泡获自真核细胞(例如，来自多细胞生物体和特别是脊椎动物细胞(例如，哺乳动物)的真核细胞)。而且，应该发现，供体细胞可以是具有核的或者没有核的。因此，适合的供体细胞包括淋巴细胞(例如，多核的、多形核淋巴细胞等)、成纤维细胞、肝细胞以及红细胞和血小板。适合的供体细胞可以来自就其细胞系而言任何所需的发育阶段。例如，适合的供体细胞可以包括干细胞(其可以或可以不发育成特定细胞系)、部分分化的干细胞和完全分化的细胞。在一些实施方案中，适合的供体细胞可以是人类胚胎干细胞衍生的间充质干细胞。在一些实施方案中，适合的供体细胞是探路者细胞。如本文使用的，术语“探路者细胞”涵盖具有诱导或刺激组织修复、再生、重塑或分化的能力的多能细胞。探路者细胞可以获自许多类型的组织的任何一种，包括但不 限于胰腺、肾、淋巴结、肝、脾、子宫肌层、血细胞(包括来自外周血和脐带血)和骨髓。
适合的供体细胞还可以处于其个体细胞年龄的任何阶段，范围从刚从其祖细胞分离到衰老或甚至死亡的细胞。在一些实施方案中，微泡的脱落可以伴随凋亡性起泡(其可以来自质膜和/或核)。因此，供体细胞可以包括凋亡前的供体细胞或注定凋亡的细胞。而且，设想，适合的供体细胞还包括非患病细胞和患病细胞，其中患病细胞可能受一种或多种病原体和/或病症影响。例如，患病供体细胞可以被病毒、细胞内颗粒或细菌感染。在其他实例中，患病细胞可以是代谢病变细胞(例如，由于遗传缺陷、由于酶、受体和/或转运体功能障碍、或者由于代谢损伤)、赘生性细胞、或者具有一个或多个突变的细胞，所述突变使细胞易感于不受控制的细胞生长。类似地，供体细胞可以是天然的(例如，获自活检)、培养的(例如天然或永生的)或被治疗的。例如，供体细胞可以是被化学和/或机械治疗的，从而表现出细胞特异性应激反应的供体细胞。在一些实施方案中，适合的供体细胞可以用天然或合成配体治疗，细胞具有针对所述配体的受体或其他互补结构。在一些实施方案中，供体细胞还可以用改变代谢、细胞生长、细胞分化、细胞结构和/或分泌的至少一种的药物或化合物治疗。在一些实施方案中，适合的供体细胞是重组细胞。例如，重组供体细胞可以包含通过重组DNA技术引入的一种或多种核酸分子。所有已知的引入核酸的方式被认为适合本发明所述用途(例如，病毒转染、化学转染、电穿孔、弹道转染等)。当核酸是DNA时，设想DNA可以被整合入供体细胞的基因组，或者DNA可以作为染色体外单位驻留在细胞内。这种DNA可以用作RNA生成的模板，RNA生成可以具有调节和/或蛋白编码功能。类似地，当核酸是RNA时，这种RNA可以用作调节实体(例如，通过反义或干扰)和/或用作蛋白编码实体。如本文使用的，核酸涵盖所有已知的核酸类似物(例如，硫代磷酸酯类似物、肽核酸类似物等)。适合的供体细胞可以有任何所需的来源，包括内皮、间皮和外皮来源。因此，适合的供体细胞包括腺体、器官、肌肉、结构组织等中存在的那些。适合的供体细胞相对于受体而言可以是异源的(或非自体的)或自体的。例如，适合的供体细胞可以来源于与受体组织(例如，待治疗的疾病组织) 相同或不同的组织。作为非限制性实例，获自供体细胞，例如成纤维细胞的微泡可用于治疗受体的患病胰腺组织。在一些实施方案中，供体细胞可来源于不同的生物体(即，非自体的)。例如，供体细胞可以是猪胰腺细胞，而受体是人胰腺的。在一些实施方案中，微泡获自全血、血清、血浆或者任何其他生物流体，包括尿液、腹水、乳奶、泪液、脊髓液、羊水等，其可以获自活的哺乳动物。可选地，微泡还可以获自储存的材料(例如，生物流体、组织、器官等)。这种储存可以包括在降低的温度(例如，4° C)下储存或者甚至以冷冻形式储存。类似地，微泡还可以获自体外来源，并且最为通常地是获自细胞或组织培养物(参见下文的组织培养条件章节)或者甚至器官培养物。细胞培养条件在一些实施方案中，微泡获自培养的供体细胞。例如，适合的供体细胞可以在含有细胞营养素的液体培养基中培养，并且在其中控制温度和/或气体组成的环境下孵育。如本领域普通技术人员所理解的，特定的细胞培养条件可以根据使用的细胞类型而变化。例如，已经描述了探路者细胞的细胞培养条件。参见，例如，国际专利公布W02006120476，其全部内容在此通过引用并入。适合探路者细胞培养的示例性培养基是补充了胎牛血清(例如，10%)的CMRL1066培养基(Invitrogen)。在一些实施方案中，培养基中补充了谷氨酰胺或含谷氨酰胺的混合物，例如GLUTAMAX (Invitrogen)和/或抗生素(例如，两性霉素、青霉素和/或链霉素)。在一些实施方案中，细胞被培养以使得它们附着在表面上。在一些这样的实施方案中，细胞在表面上单层生长。在一些实施方案中，细胞生长至它们汇合，即，直至它们覆盖它们在上面生长的整个表面，并且表面上没有其他地方供细胞生长。在一些实施方案中，细胞生长至它们接近但还未汇合，即，直至它们覆盖它们在上面生长的表面的大部分，但是依然还有一定的细胞生长的空间。在一些实施方案中，细胞生长至大约或超过50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或更多汇合，其中x%汇合被定义为生长表面大约x%的覆盖率。在一些实施方案中，细胞生长至它们大约50-99% (例如，60-99%、70-99%、75-99%、80-99%、85-99%、90-99% 或 95-99%)汇合。在一些实施方案中，细胞在可能影响细胞的一种或多种性质的基底上生长，所述性质例如微泡生成速率、细胞增殖速率或miRNA表达模式。在一些实施方案中，细胞在非织造基底上生长，所述非织造基底例如由纤维构成的非织造织物。如本文使用的，术语“非织造织物”包括，但不限于通过不同于纺织或编织的方法生产的粘合织物、成型织物或工程化织物。在一些实施方案中，术语“非织造织物”指通常为平板形式的多孔纺织样材料，主要或完全由纤维构成，所述纤维例如以网、片或毛毡组装的人造纤维。非织造织物的结构基于例如通常或多或少随机排列的人造纤维的排列。非织造织物可以通过纺织工业已知的许多技术产生。各种方法可以产生卡片、湿法成网、熔喷、纺粘或气流成网的无纺物。示例性的方法和基底描述于美国专利申请公布号20100151575，其教导通过引用并入本文。非织造织物的密度可以根据加工条件而变化。在一个实施方案中，非织造织物具有约60mg/mL至约350mg/mL的密度。在一些实施方案中，非织造基底是生物相容的和/或生物可吸收的。可以使用的适合的生物相容性、生物可吸收的聚合物的实例包括聚合物，所述聚合物选自:脂肪族聚酯、聚(氨基酸)、共聚(醚-酯)、聚亚烷基草酸酯、聚酰胺、聚(亚氨基碳酸酯)、聚原酸酯、聚氧酯、聚酰胺酯、含胺基的聚氧酯、聚(酸酐)、聚磷腈及其混合物。在一些实施方案中，脂肪族聚酯是单体的同聚物和/或共聚物及其聚合物混合物，所述单体选自丙交酯(其包括乳酸、D-、`L-和内消旋丙交酯)、乙交酯(包括乙醇酸)、ε -己内酯、对二氧环己酮(1，4- 二氧杂环己烷-2-酮)、三亚甲基碳酸酯(1，3- 二氧杂环己烷-2-酮)、三亚甲基碳酸酯的烷基衍生物、δ -戊内酯、β -丁内酯、Y -丁内酯、ε -癸内酯、羟基丁酸酯(重复单元)、羟基戊酸酯(重复单元)、1，4- 二氧杂环庚烷-2-酮(包括其二聚体1，5，8，12-四氧杂环十四烷_7，14- 二酮)、1，5- 二氧杂环庚烷-2-酮、6，6- 二甲基-1，4- 二氧杂环己烷-2-酮。在另一个实施方案中，脂肪族聚酯包括但不限于丙交酯(其包括乳酸、D-、L-和内消旋丙交酯)、乙交酯(包括乙醇酸)、ε -己内酯、对二氧环己酮(1，4-二氧杂环己烷-2-酮)、三亚甲基碳酸酯(1，3- 二氧杂环己烷-2-酮)的同聚物或共聚物及其组合。在一些实施方案中，脂肪族聚酯是单体的同聚物和/或共聚物及其组合，所述单体选自丙交酯(其包括乳酸、D-、L-和内消旋丙交酯)、乙交酯(包括乙醇酸)、ε -己内酯、对二氧环己酮(1，4- 二氧杂环己烷-2-酮)、三亚甲基碳酸酯(1，3- 二氧杂环己烷-2-酮)。而在另一实施方案中，脂肪族聚酯是单体的同聚物和/或共聚物及其组合，所述单体选自丙交酯(其包括乳酸、D-、L-和内消旋丙交酯)、乙交酯(包括乙醇酸)和对二氧环己酮(1，4- 二氧杂环己烷-2-酮)。适合的织物的非限制性实例包括含有脂肪族聚酯纤维的那些，例如包含丙交酯(例如，乳酸、D-、L-和内消旋丙交酯)、乙交酯(例如，乙醇酸)、ε-己内酯、对二氧环己酮(1，4- 二氧杂环己烷-2-酮)、三亚甲基碳酸酯(1，3- 二氧杂环己烷-2-酮)及其组合。例如，适合的织物可以含有乙交酯-丙交酯共聚物(PGA/PLA);丙交酯-乙交酯共聚物(PLA/PGA) ;1，3丙二醇(PDO)和/或其混合物。在一些实施方案中，细胞在已经以特定方式构造以赋予表面特殊的性质(例如，某些物质的排斥或吸弓丨、减少的蛋白吸附、等)的固体表面上生长，其反过来可以影响此类表面上细胞的行为。例如，细胞可以在纳米构造的表面(纳米表面)上生长。参见例如US7, 597, 950 ；Sun^ (2009Combining nanosurface chemistry and microfluidics formolecular analysis and cell biology, ^Analytica Chimica Acta,650 (I):98-105 ;其每一个的全部内容在此通过弓I用并入。可以例如通过本领域已知的许多方法的任何一种来产生纳米结构和其他构造的表面，所述方法包括砂磨、化学蚀刻、喷砂和/或去湿。在一些实施方案中，细胞在悬液中生长。可以使用各种生长培养基来培养供体细胞。生长培养基一般指用于培养活细胞的任何物质或制品。在一些实施方案中，生长培养基是肾生长培养基。在一些实施方案中，生长培养基是DMEM培养基。在一些实施方案中，细胞在不含血清的培养基中生长。在一些实施方案中，细胞在已经从培养基组分去除微泡的培养基中生长至少一段时间。例如，含有胎牛血清的培养基可以去除了牛微泡。可选地或此外，使用去除了微泡(例如，牛微泡)的商业上可获得的培养基。在一些实施方案 中，细胞在37° C或大约37° C下生长。在一些实施方案中，细胞在5%C02或大约5%C02存在下生长。在一些实施方案中，细胞在室内空气氧条件下生长。在一些实施方案中，细胞在其中氧压小于或等于5%02的条件下生长。在一些实施方案中，细胞在正常氧(例如，约5%02)条件下生长。在一些实施方案中，细胞在缺氧条件(例如，低氧例如〈5%、〈4%、〈3%、<2% 或 <1%02)下生长。在一些实施方案中，供体细胞在血清饥饿条件下生长。如本文使用的，术语“血清饥饿”包括但不限于血清充足、无血清培养基或条件。各种血清饥饿条件是本领域已知的并且可用于实施本发明。在一些实施方案中，细胞可以在血清饥饿条件下生长约6、约12、约
18、约24、约30、约36、约42、约48小时或更长。在一些实施方案中，细胞可以在其中血清浓度小于或等于10%、小于或等于9%、小于或等于8%、小于或等于7%、小于或等于6%、小于或等于5%、小于或等于4%、小于或等于3%、小于或等于2%、小于或等于1.5%、小于或等于1%或小于或等于0.5%的条件下生长。在一些实施方案中，细胞可以在血清浓度是0% (B卩，血清不存在)的条件下生长。在一些实施方案中，细胞可以在血清浓度随时间逐步减少的条件下生长。例如，在一些实施方案中，细胞可以在血清浓度为约2%至约11% (例如，约2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%或11%)并且随后在一个或多个步骤内减少至血清浓度约0%至约5% (例如，约 0%、0.5%、1%、1.5%、2%、3%、4% 或 5%)的条件下生长。微泡的制各可以使用本领域已知的分离或富集微泡的各种方法来实施本发明。如本文使用的，与微泡配合使用的术语“分离”或“分离”与术语“富集”或“富集”可互换使用，并且指与获得的生物样品中微泡级分相比，使得样品中微泡级分增加的一个或多个过程步骤。因此，可以将微泡纯化至均匀，纯化为至少90% (针对非微泡颗粒物质)、至少80%、至少70%、至少60%、至少50%、至少40%、至少30%或至少20% (或甚至更少)。例如，可以利用微泡的物理性质来使它们与培养基或其他来源材料分离。例如，微泡可以基于电荷(例如，电泳分离)、大小(例如，过滤、分子筛等)、密度(例如，规则或梯度离心)、斯维德贝格(Svedberg)常数(例如，有或没有外力的沉降，等)而被分离。在一些实施方案中，通过离心(例如，超速离心)分离或纯化微泡。可以理解的是，可以使用各种离心条件(例如，速度、离心力、离心时间等)来获得分离或纯化的微泡的所需级分。例如，在一些实施方案中，可以在足以沉淀较大微泡(例如，大约IOOOnm或更大)的相当低的离心力(例如，大约16，OOOx g)下离心样品。在一些实施方案中，可以在足以沉淀较小尺寸(例如，小于IOOOnm)的较大离心力(例如，大约120，OOOx g)下离心样品(例如，通过最初低速旋转得到的上清液)。在一些实施方案中，使用该方法制备的微泡制品可以含有非常小的颗粒，例如尺寸范围从约IOnm至IOOOnm (例如，约50-1000nm、75-1000nm、100-1000nm、10-750nm、50-750nm、100-750nm、100-500nm)的颗粒。示例性的微泡分级分离示意图描述于图3。在一些实施方案中，这种小的颗粒还称为外体、外体样囊泡和/或膜颗粒。在一些实施方案中，这种级分被称为外体级分。在一些实施方案中，通过沉淀分离或纯化微泡。要理解，可以使用各种沉淀条件以获得分离或纯化的微泡的所需级分。例如，各种试剂盒可用于外体沉淀，例如Ex0Quickn^PExo-Quick-TC (可获自System Biosciences,山景城,加利福尼亚州)并且可根据本发明使用。可选地或此外，分离可基于一种或多种生物性质，并且可以采用表面标志物(例如，表面标志物可用于沉淀、与固相的可逆结合、FACS分离、特异性配体结合、非特异性配体结合，例如膜联蛋白V，等)。在进一步设想的方法中，微泡还可以使用化学和/或物理方法融合，包括PEG诱导的融合和/或超声融合。在一些实施方案中，微泡获自条件培养基，所述培养基来自产生微泡的细胞培养物。
合成微泡在一些实施方案中，适合本发明的微泡可以是合成产生的。合成的微泡通常包括获自供体细胞的一种或多种膜组分。在一些实施方案中，合成微泡包括至少一种本文描述的微小RNA。例如，合成微泡可以通过供体细胞的分解(例如,通过去污剂、超声、剪切力、等)和使用未加工品或者至少部分富集的膜级分，以重构一个或多个微泡来制备。在一些实施方案中，外源的微小RNA可以被添加至微泡。I1.微小 RNA在一些实施方案中，微泡包含一种或多种特定的微小RNA。如本文使用的，微泡特异性微小RNA包括仅存在于微泡中而不存在于细胞中的那些微小RNA，和与细胞相比基本上富集在微泡中的那些微小RNA。微泡特异性微小RNA包括从微泡分离或纯化的，或者使用重组或化学技术合成的微小RNA。例如，可以通过编码相关分子的DNA序列的体外转录产生微小RNA分子。可以使用适合的RNA聚合酶启动子例如T7、T3或SP6将这种DNA序列并入许多载体。如本文使用的，术语“微小RNA (miRNA)”指转录后调节子，其通常结合至靶信使RNA转录物(mRNA)的三个主要的未翻译区(3’ UTR)中的互补序列，通常导致基因沉默。通常，miRNA是短的核糖核酸(RNA)分子。例如，微小RNA长度可以是大约18-25个核苷酸(例如，大约18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸的长度)。设想，例如，除了其他功能外，可以单独或组合使用微泡特异性微小RNA来诱导或刺激组织或细胞生长、重塑、重建、分化和/或转分化。因此，例如，本发明提供了，除了其他方面以外，鉴定微泡特异性微小RNA或可以诱导或刺激组织或细胞生长、重塑、重建、分化和/或转分化的任何微小RNA的方法。在一些实施方案中，根据本发明的发明方法可以包括以下步骤的一个或多个:提供细胞，所述细胞在去除了微泡的培养基中生长，向培养基添加miRNA，并确定与对照相比，miRNA的添加是否增加了细胞增殖速率，从而鉴定miRNA是否诱导细胞生长和/或再生。在一些实施方案中，使用倍增时间(例如，例如使细胞培养容器中的细胞群倍增所花费的时间)作为细胞增殖速率的指示。细胞增殖测定是本领域已知的，并且可以采用许多这种测定的任何一种来测定细胞增殖速率。例如，可以使用本领域已知的标准细胞计数技术来计数细胞数目(例如,每体积培养基；或者对于整个细 胞培养容器，等)。在一些这种细胞技术方法中，用染料标记细胞以易于检测。在评估细胞增殖的一些方法中，使细胞形成已知体积的悬液，并且使用标准分光光度技术测量至少一份细胞悬液的密度(例如，光学密度)。一些细胞增殖测定测量DNA合成。例如，标记的核苷酸或核苷酸类似物(例如，BrdU (溴脱氧尿苷)、氚标记的胸苷等的加入可用于细胞增殖测定。一些细胞增殖测定测量代谢酶对底物的转化。例如，“MTT”测定测量四唑盐WST-1被细胞线粒体脱氢酶裂解成甲臜。在一些实施方案中，还测量并考察了细胞活力，从而仅计数有活力的细胞。例如，排除台盼蓝染料的能力被视为膜完整性的标志，并由此可作为细胞活力的标志，并且细胞计数方法通常包括使用台盼蓝。在一些实施方案中，用于鉴定如本发明所述微小RNA的发明方法可以包括以下步骤的一个或多个:在生长至汇合的细胞中产生创伤区；用miRNA治疗所述细胞；和确定与对照相比，在所述创伤区的被治疗的细胞的再生速率，从而鉴定所述miRNA是否诱导细胞生长和/或再生。可以通过本领域已知的方法测量汇合细胞培养物中创伤区的再生。在一些实施方案中，定量测量再生。例如，可以使用例如XCELLIGENCE 系统(Roche Applied Science)
定量测量再生。在一些实施方案中，方法以高通量方式进行，例如平行测试许多miRNA。多孔板(例如，24-孔、48-孔、96-孔、324-孔、等)可以促进这种平行测试，因为每个miRNA可以在单个孔中测试。可以在培养物中生长的任何类型的细胞可用于本发明方法。例如，可以使用本文描述的各种供体细胞。在一些实施方案中，适合的细胞包括胰腺衍生的探路者细胞、成纤维细胞和心肌细胞。可以使用本文描述的发明方法测试各种候选miRNA。例如，可以使用分离自微泡的miRNA。可选地或此外，已经在文献或其他实验中鉴定miRNA为潜在目标(例如，鉴定为与疾病、转分化、潜在治疗应用等相关)的miRNA可用于本发明方法以确定这种miRNA诱导细胞生长和/或再生。在一些实施方案中，使用miRNA文库。例如，可根据本发明方法使用从表达文库收集克隆的miRNA，以鉴定诱导细胞生长和/或再生的一种或多种miRNA。在一些实施方案中，使用来自所关注类型的细胞的miRNA表达文库。在测定步骤中的适当对照包括，但不限于在相同的条件下生长的未治疗的细胞(例如，没有添加miRNA的细胞)，和/或除添加了“对照”miRNA外，其他条件都相同的条件下生长的细胞。如果使用“对照”miRNA，所述“对照”miRNA —般对细胞生长和/或再生具有已知作用。在一些实施方案中，使用了超过一种对照。在一些实施方案中，使用了阴性对照(预期不会诱导细胞生长和/或再生的miRNA)。在一些实施方案中，使用了阳性对照(预期能诱导细胞生长和/或再生的miRNA)。在一些实施方案中，使用了阳性对照和阴性对照。表I显不了特异性地存在于微泡中的不例性微小RNA。在一些实施方案中，发现 miRNA-122、miRNA-127, miRNA_133b、miRNA-323、miRNA-433, miRNA-451、miRNA_466h、miRNA-467c、miRNA_467e、miRNA-468, miRNA-491、miRNA-495, miRNA-546, miRNA-666,miRNA-680和miRNA-346(SEQ ID NO: 1_29)以相对较高的浓度存在于微泡中。根据本发明鉴定的其他微小RNA列于表3-13。表I列出了每一个所关注的miRNA的示例性miRNA序列；其他物种中相应的miRNA序列已公开并可获得(例如，参见http://diana.cslab.ece.ntua.gr/mirgen/),所述物种包括但不限于智人(Homo sapiens)、褐鼠(Rattus norvegicus)、小鼠(Mus musculus)、斑马鱼(Danio rerio)和原鸡(Gallus gallus)。如表 I 和表 7-13 所示，一些miRNA序列在物种间是非常保守的，并且一些miRNA序列变体甚至在相同物种中存在。表7-13显示了可根据本发明使用的示例性微小RNA。表1:微小RNA序列
权利要求
1.一种治疗疾病、疾患或病症的方法，该方法包括给需要治疗的患者施用治疗有效量的微泡。
2.权利要求1所述的方法，其中所述疾病、疾患或病症是糖尿病。
3.权利要求1所述的方法，其中所述疾病、疾患或病症是心肌梗死。
4.权利要求1所述的方法，其中所述疾病、疾患或病症是肾病。
5.权利要求1所述的方法，其中所述疾病、疾患或病症是创伤愈合。
6.权利要求1所述的方法，其中所述疾病、疾患或病症是瘘管再生。
7.权利要求1所述的方法，其中所述疾病、疾患或病症是神经再生。
8.权利要求7所述的方法，其中所述神经再生包括CNS再生。
9.权利要求7所述的方法，其中所述神经再生包括外周神经系统再生。
10.权利要求1所述的方法，其中所述疾病、疾患或病症是乳房切除术之后的隆胸。
11.权利要求1所述的方法，其中所述疾病、疾患或病症与美容外科手术有关。
12.—种在体内诱导组织修复、重塑或分化的方法，该方法包括给需要治疗的患者施用治疗有效量的微泡。
13.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述微泡来源于与患病组织相同的组织。
14.权利要求1-12任一项所述的方法，其中所述微泡来源于与患病组织不同的组织。
15.权利要求1-12任一项所述的方法，其中所述微泡来源于胰脏细胞、肾细胞、肝细胞、脾细胞、淋巴结、子宫肌层细胞、外周血细胞、脐带血细胞、骨髓细胞、血清、间充质干细胞或其组合。
16.权利要求15所述的方法，其中所述微泡来源于胰腺衍生的探路者(pathfinder)细胞。
17.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述微泡来源于自体细胞。
18.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述微泡来源于非自体细胞。
19.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述微泡来源于非织造基底上生长的细胞。
20.权利要求19所述的方法，其中所述非织造基底含有脂肪族聚酯纤维。
21.权利要求20所述的方法，其中所述脂肪族聚酯纤维选自:丙交酯(其包括乳酸D-、L-和内消旋丙交酯)、乙交酯(包括乙醇酸)、己内酯、对二氧环己酮(1，4-二氧杂环己烷-2-酮)、三亚甲基碳酸酯(1，3- 二氧杂环己烷-2-酮)的同聚物或共聚物及其组合。
22.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述微泡来源于在氧压小于或等于5%的培养条件下生长的细胞。
23.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述微泡来源于在室内空气氧条件下生长的细胞。
24.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述微泡来源于生长至大约80-99%汇合的细胞。
25.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述微泡来源于在血清饥饿条件下生长的细胞。
26.权利要求25所述的方法，其中所述细胞在血清饥饿条件下生长约24小时。
27.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述微泡来源于在血清充足条件下生长的细胞。
28.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述微泡来源于在无血清培养基中生长的细胞。
29.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述微泡通过差速超速离心分离或纯化。
30.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述微泡通过沉淀分离或纯化。
31.前述权利要求任一项所述的方法，其中大部分微泡具有大于约IOOnm的尺寸。
32.前述权利要求任一项所述的方法，其中大部分微泡具有大于约Iμ m的尺寸。
33.前述权利要求任一项所述的方法，其中大部分微泡具有大约IOOnm至Iμπι范围的尺寸。
34.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述微泡包含一种或多种微小RNA(miRNA)，所述一种或多种微小 RNA 选自 miRNA-122、miRNA-127、miRNA_133b、miRNA-323、miRNA-433、miRNA-451、miRNA_466h、miRNA_467c、miRNA_467e、miRNA-468、miRNA-491、miRNA-495、miRNA-546、miRNA-666、miRNA-680、miRNA-346、miRNA-136、miRNA-202、miRNA-369、 miRNA-370、 miRNA-375、 miRNA_376b、 miRNA-381、 miRNA-434、 miRNA-452、miRNA-465a、miRNA_465b、miRNA-470、miRNA_487b、miRNA-543、miRNA-547、miRNA-590、miRNA-741、miRNA-881、miRNA-206、miRNA-224、miRNA-327、miRNA-347，及其组合。
35.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述微泡包含一种或多种微小RNA，所述一种或多种微小 RNA 选自 miRNA-122、miRNA-127、miRNA_133b、miRNA-323、miRNA-433,miRNA-451、miRNA_466h、miRNA_467c、miRNA_467e、miRNA-468, miRNA-491、miRNA-495,miRNA-546、miRNA-666、miRNA-680、miRNA-346，及其组合。
36.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述微泡不含有miRNA-129-5p、miRNA-190, miRNA-203、miRNA-32、miRNA_34c、miRNA_376c、miRNA-384_3p、miRNA_499b、miRNA-455、miRNA-582_5p、miRNA-615_3p、miRNA-615_5p、miRNA_7b、miRNA-17_3p、miRNA-381 和 miRNA-505。
37.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述治疗有效量的微泡的范围是Ifg-1mg/kg体重。
38.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述微泡通过静脉内、动脉内、肌肉内、皮下、经皮、皮内、颅内、鞘内、胸膜内、眼窝内、鼻内、口服、消化道内、结肠直肠和/或脑脊髓内施用。
39.前述权利要求任一项所述的方法，所述微泡每天施用。
40.权利要求1-38任一项所述的方法,所述微泡每周施用。
41.权利要求1-38任一项所述的方法,所述微泡每两周施用。
42.权利要求1-29任一项所述的方法，所述微泡每月施用。
43.一种通过施用从微泡获得、分离或纯化的一种或多种微小RNA，来治疗疾病、疾患或病症的方法。
44.权利要求43所述的方法，其中所述微泡来源于在血清饥饿条件下生长的细胞。
45.权利要求44所述的方法，其中所述细胞在血清饥饿条件下生长约24小时。
46.权利要求43所述的方法，其中所述微泡来源于在血清充足条件下生长的细胞。
47.权利要求43所述的方法，其中所述微泡来源于在无血清培养基中生长的细胞。
48.权利要求43所述的方法，其中从微泡获得、分离或纯化的所述微小RNA包括在微泡中差异表达的微小RNA。
49.权利要求48所述的方法，其中从微泡获得、分离或纯化的所述微小RNA包括在微泡中差异表达的微小RNA，所述微泡来源于应激条件下生长的细胞。
50.权利要求49所述的方法，其中所述应激条件选自氧压、细胞培养汇合、细胞培养基中的血清耗竭,及其组合。
51.一种治疗疾病的方法，该方法包括给需要治疗的患者施用治疗有效量的一种或多种微小RNA，所述微小RNA具有与SEQ ID NO: 1-587的任何一个至少80%相同的序列。
52.权利要求51所述的方法，其中所述疾病是糖尿病。
53.权利要求51所述 的方法，其中所述疾病是心肌梗死。
54.权利要求51所述的方法，其中所述疾病是肾病。
55.权利要求51所述的方法，其中所述疾病、疾患或病症是创伤愈合。
56.权利要求51所述的方法，其中所述疾病、疾患或病症是瘘管再生。
57.权利要求51所述的方法，其中所述疾病、疾患或病症是神经再生。
58.权利要求57所述的方法，其中所述神经再生包括CNS再生。
59.权利要求57所述的方法，其中所述神经再生包括外周神经系统再生。
60.权利要求51所述的方法，其中所述疾病、疾患或病症是乳房切除术之后的隆胸。
61.权利要求51所述的方法，其中所述疾病、疾患或病症与美容外科手术有关。
62.一种在体内诱导组织修复、重塑或分化的方法，该方法包括给需要治疗的患者施用治疗有效量的一种或多种微小RNA，所述微小RNA具有与SEQ ID NO: 1-587的任何一个至少80%相同的序列。
63.权利要求51-62任一项所述的方法，其中所述一种或多种微小RNA具有与SEQIDNO: 1-29的任何一个至少80%相同的序列。
64.权利要求51-62任一项所述的方法，其中所述一种或多种微小RNA选自SEQIDNO:1-587。
65.权利要求51-64任一项所述的方法,其中所述治疗有效量的一种或多种微小RNA的范围是lfg-lmg/kg体重。
66.权利要求51-65任一项所述的方法,其中所述一种或多种miRNA通过静脉内、动脉内、肌肉内、皮下、经皮、皮内、颅内、鞘内、胸膜内、眼窝内、鼻内、口服、消化道内、结肠直肠和/或脑脊髓内施用。
67.权利要求51-62任一项所述的方法，其中所述一种或多种miRNA每天施用。
68.权利要求51-62任一项所述的方法，其中所述一种或多种miRNA每周施用。
69.权利要求51-62任一项所述的方法，其中所述一种或多种miRNA每两周施用。
70.权利要求51-62任一项所述的方法，其中所述一种或多种miRNA每月施用。
71.—种药物组合物，其包含治疗有效量的微泡，用于治疗糖尿病、心肌梗死、肾病、创伤愈合、瘘管再生、神经再生、乳房切除术之后的隆胸，和/或与美容外科手术有关的病症。
72.—种药物组合物，其包含一种或多种微小RNA以及药学可接受的载体，所述一种或多种微小RNA具有与SEQ ID NO: 1-587的任何一个至少80%相同的序列。
73.权利要求72所述的药物组合物，其中所述一种或多种微小RNA包括与SEQIDNO: 1-29的任何一个至少80%相同的序列。
74.权利要求72所述的药物组合物，其中所述一种或多种微小RNA选自SEQIDNO:1-587。
75.权利要求71-74任一项所述的药物组合物，其中所述一种或多种微小RNA以用于治疗糖尿病、心肌梗死或肾病的治疗有效量存在。
76.一种用于鉴定诱导细胞生长和/或再生的miRNA的方法，该方法包括 提供细胞，所述细胞在除去微泡的培养基中生长； 向所述培养基添加miRNA ； 确定与对照相比，所述miRNA的添加是否增加了细胞增殖速率，从而鉴定所述miRNA是否诱导细胞生长和/或再生。
77.权利要求76所述的方法，其中所述细胞是胰腺衍生的探路者细胞。
78.权利要求76或77所述的方法，其中所述细胞增殖速率通过倍增时间来确定。
79.权利要求76-78任一项所述的方法，其中所述miRNA分离自微泡。
80.一种用于鉴定诱导细胞生长和/或再生的miRNA的方法，该方法包括: 在生长至汇合的细胞中产生创伤区； 用miRNA治疗所述细胞； 确定与对照相比，在所述创伤区的被治疗的细胞的再生速率，从而鉴定所述miRNA是否诱导细胞生长和/或再生 。
81.权利要求80所述的方法，其中所述细胞是成纤维细胞或心肌细胞。
82.权利要求80或81所述的方法，其中所述再生速率被定量确定。
83.权利要求80-82任一项所述的方法，其中所述对照是未经治疗、但在相同条件下生长的细胞。
84.权利要求80-83任一项所述的方法，其中所述miRNA分离自微泡。
85.一种使用根据权利要求76-84任一项所述方法鉴定的、诱导细胞生长和/或再生的miRNA。
全文摘要
本发明提供了用于治疗各种疾病、疾患和病症的基于微泡的改良的方法和组合物。具体地，本发明涵盖以下发现微泡含有特定的微小RNA，所述微小RNA可以发挥参与细胞或组织再生、重塑、重建、重编程或转分化的细胞间调节子的功能。因此，特别地，本发明提供了基于微泡和/或相关的微小RNA的方法和组合物，提供了更可预测且有效的治疗结果。
文档编号G01N33/50GK103210089SQ201180049758
公开日2013年7月17日 申请日期2011年8月12日 优先权日2010年8月13日
发明者保罗·希尔斯, 韦恩·戴维斯 申请人:格拉斯哥大学大学行政评议会
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