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专利名称：一种新型的检测铬离子的微生物传感器的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物微电极领域，具体涉及一种新型的检测铬离子的微生物传感器。
背景技术：
铬是自然界中广泛存在的一种元素，主要以三价铬和六价铬的形式存在。三价铬参与人和动物体内的糖与脂肪的代谢，是人体必需的微量元素；六价铬则是明确的有害元素，能使人体血液中某些蛋白质沉淀，引起贫血、肾炎、神经炎等疾�。て谟肓鄹踅哟セ够嵋鸷粑姥字⒉⒂辗⒎伟┗蛘咭鹎秩胄云し羲鸷Γ现氐牧鄹踔卸净够嶂氯怂劳�。因为铬是工业界广泛使用的物质之一，多应用于钢铁制造、金属腐蚀和电镀业等等。不
同产业所排放的含铬废水，如未谨慎处理将导致水体中残留大量毒性六价铬化合物进入环境。所以，铬污染一直是公共卫生与环境保护上重视的议题，美国环保署(USEPA)已将其列名为最�：θ死嗍咧治镏手�。我国规定工业废水中铬的最高排放浓度为O. 5mg/L (饮用水中铬含量上限为O. 05mg/L)。目前检测水中六价铬金属离子的方法主要是原子吸收光谱仪，此类设备价格昂贵，操作过程繁琐，检测也需耗费不少时间。因此，在检测的过程中，上万吨不合格的工业废水可能已流入河流。用简单的、快捷的传感技术来检测铬离子是目前最佳的、最廉价的、最及时的解决办法。而电势法离子选择性传感器更是因高灵敏度、低成本和快速响应而被广泛应用于检测技术领域。传感器分为电化学传感器和生物传感器两大类。高稳定性是电化学传感器的一大优点，但对被检物(例如铬离子)的选择性与生物传感器相比就稍逊一筹了。以往制备生物传感器是用活性微生物粘附固定在电极上，这样微生物的活性成了传感器使用寿命和稳定性的决定因素。另外，挑选对被检物具选择性的微生物，也是制备生物传感器的关键。有文献提到一些对铬具有抵抗力或可将其还原减毒的代表性细菌包括Pseudomonas aeruginosaA2Chr、Bacillus megaterium TKW3> Enterobavter cloacaeHOl 及 Bacillus firmus 等(Ganguli andTripathi, 2002;Cheung et al·，2006;Sau etal.，2008)，这类细菌可应用于去除六价铬污染，但是这些菌株的种类还是非常有限，特别缺少一些本土化的菌株。

发明内容
本发明的目的是提供一种简单易用、成本低廉、便于携带、探测响应快，灵敏度高，稳定性高，检测下限低和使用寿命长的新型的检测铬离子的微生物传感器。本发明的新型的检测铬离子的微生物传感器，其特征在于，包括PC检测底板，在PC检测底板表面具有一条合金涂层传导通道，合金涂层传导通道一端与引线相连，另外一端为检测涂层，在检测涂层上方覆盖有一层PC盖板，在PC盖板上，与检测涂层相对应的位置设有检测池，检测涂层成为检测池的底面，在检测池的检测涂层表面敷有一层铬离子感应层；
所述的铬离子感应层是由石墨粉、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)GIMT1. 002冻干粉和液体石蜡按照质量比45:45:10组成，将三者混合均匀后，平铺于检测
涂层表面。所述的检测涂层优选呈圆盘状，其直径为l(Tl5mm。这种直径的圆盘状检测涂层可使铬离子感应层有效地附着在电极的检测涂层上，避免电信号损失，又能保持其良好的灵敏性，且节省空间。所述的合金涂层传导通道优选是用合成黄金、钼金或银电镀而成，其起电信号传导作用。所述的PC检测底板和PC盖板指的是其材质为PC (聚碳酸酯)材质制成的检测底板和盖板。所述的铬离子感应层的厚度优选为< 1mm。 本发明的新型的检测铬离子的微生物传感器可以通过引线与多通道数据采集仪相连，实现对样品中铬离子的快速、有效分析检测。本发明结合电化学传感器(高稳定性)与生物传感器(高选择性)的优点，用“铬耐受性”本土菌株人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi) GIMTI. 002作为检测铬离子的感应元件，用冻干技术制备人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi) GIMTI. 002菌株冻干粉，并将冻干菌株混合碳粉固定在检测涂层上，以多通道数据收集器为信号输出显示装置，建立铬离子浓度与电极输出信号(电压值)的关系，成为检测含铬废水的新型的检测铬离子的微生物传感器。本发明实现了样品需要量少、检测时间短、灵敏度高、检测下限低等特点，极易携带，便于实时监测；最重要的是制作成本低廉，可大批量生产，还稳定性高，生物选择性也高。并且，本发明与相关的测试技术及数据处理软件相结合，将可进一步实现原位、在线的微全分析系统，给传统环境检测带来根本的变革。本发明的人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)GIMTI. 002,保藏于广东省微生物菌种保藏中心(地址广东省广州市越秀区先烈中路100号大院微生物所实验楼五楼)，其保藏编号是GMT1. 002，该菌种是对外销售的，任何人都可以从这里购买到该菌种。


图I是人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi) GIMT1. 002在不同浓度的络离子环境下的生长曲线图；图2是本发明新型的检测铬离子的微生物传感器(冻干人苍白杆菌附着电极)的结构示意图；图3是本发明冻干人苍白杆菌附着电极的使用示意图；图4是本发明冻干人苍白杆菌附着电极对不同浓度铬离子溶液的响应曲线；图5是本发明冻干人苍白杆菌附着电极灵敏度测试(浓度/电压)标准曲线；图6是本发明冻干人苍白杆菌附着电极对不同浓度铬离子溶液的响应曲线；图7是本发明冻干人苍白杆菌附着电极的标准曲线；图8是本发明冻干人苍白杆菌附着电极对含铬水质标准样品的响应曲线。其中1、PC检测底板；11、铬离子合金涂层传导通道；111、铬离子检测涂层；112、银引线；2、PC盖板；3、铬离子检测池；4、多通道数据采集仪；5、银-氯化银参比电极。
具体实施例方式以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。一、新型的检测铬离子的微生物传感器的制备I.菌株的选择人苍白杆菌GIMT1. 002对铬离子的耐受性实验把人苍白杆菌GMT1. 002分别接种于含10_7mol/L 10_3mol/L硝酸铬的LB培养基中，以光密度0D_、30°C震荡48小时的状况下，测定人苍白杆菌GMT1. 002菌株的生长曲线。如图I所示，菌株无论在低浓度(l(r7mol/L)的硝酸铬溶液或在高浓度(l(T3mol/L)硝酸铬溶液中皆呈现持续生长的状态，大约30小时以后进入稳定期(图中实线是菌株在不含铬离子的培养基中的生长曲线)。因此证明人苍白杆菌GMT1. 002对铬离子具有耐受性。2.人苍白杆菌GMT1. 002的培养与冻干粉的制备方法I)将5mL人苍白杆菌GMT1. 002接种至500mL LB培养液内，置于30°C摇床内培养12 16小时；2)把培养好的菌株分装到50mL的离心管里，30°C 6000rpm离心10分钟，弃上清，
得菌体。3)将菌体冷冻抽干，得到人苍白杆菌GMT1. 002冻干粉，置于4°C保存待用。3.制备离子传导成金涂层如图2所示，以一块50X75Xlmm (长X宽X厚)的聚碳酸酯底板(PC板)作为PC检测底板1，用合金材料(主要的成分是铜和镍)在检测底板I上电镀一条用于传导电信号的“火柴型”通道，即铬离子合金涂层传导通道11。铬离子合金涂层传导通道11是由直径为10_的圆形涂层和7X60_ (长X宽)的矩形涂层连接而成，圆形涂层处作为检测涂层，即为铬离子检测涂层111，将此处定为检测位点，矩形涂层起传输信号作用；然后在PC检测底板I下部50X55mm (长X宽)的范围内均匀地涂一层约400 μ m厚度的环氧树脂，铬离子检测涂层111上不涂覆环氧树脂，接着，将一块50 X 55 X Imm (长X宽X厚)的PC盖板2覆盖于PC检测底板I下部的上面，使其粘附在环氧树脂上面，环氧树脂主要起粘附和绝缘的作用，并在此PC盖板2上对应铬离子检测涂层111的位置开出直径为IOmm的圆形孔洞，孔洞部分和铬离子检测涂层111就形成检测池，即为铬离子检测池3，铬离子检测涂层111位于铬离子检测池3的底面。4.制备铬离子感应层铬离子感应层的配制方法是铬离子感应层的原料是由石墨粉、人苍白杆菌GIMT1. 002冻干粉和液体石蜡按照质量比45:45:10组成的。按照上述质量比，称取石墨粉、人苍白杆菌GMT1. 002冻干粉和液体石蜡，将三者混合彻底搅拌均匀，得菌混合物。用纯水冲洗铬离子检测池3，再用氮气枪吹喷以去除残留水滴；然后将O. 5g菌混合物薄薄地、平整地、均匀地涂于铬离子检测涂层111上，涂于铬离子检测涂层111上的菌混合物即为铬离子感应层，其厚度大约为1_，整个检测装置称为人苍白杆菌石墨附着电极。在铬离子合金涂层传导通道11上端分别安上简易插头以及银引线112，由此而得到本发明的新型的检测铬离子的微生物传感器，最后保存在干净的玻璃器皿内。
二、新型的冻干人苍白杆菌附着电极的性能检测在电极性能测试实验前，用氮气通入50mL IO^moI/L Tris-HCl溶液(pH=6. 7)中去除氧气；然后，滴加IOuL lO-W/L Cr (NO3)3溶液至Tris-HCl溶液内，搅匀；再将新型的检测铬离子的微生物传感器浸入含有微量铬离子(浓度约为10_5mol/L)的Tris-HCl溶液里，浸泡15分钟(浸泡过程需磁力转子搅拌)以激活电极。浸泡过后用纯水彻底清洗干净铬离子感应层。如图3所示，铬离子合金涂层传导通道11通过银引线112与多通道数据采集仪4 (Keithly 2700型)的高端电势接口(H)连接，银-氯化银参比电极5 (上海雷磁218型)与多通道数据采集仪4的低端电势接口(L)连接，并与传感器一同浸入IOOmL硝酸钾底液(浓度0. lmol/L，pH=6)中。随后，依次添加 10 μ L、100 μ L、1000 μ L l(T3mol/L Cr (NO3) 3溶液(pH=5)和IOOyLUOOOyL lO—W/L Cr (NO3)3溶液(pH=5);最后，得出铬离子的浓度范围是10_7mol/L 10_3mol/L。该传感器根据对不同浓度的铬离子溶液的检测，得出与之相对应的电势差值，如图4所示，电势差值随着浓度的升高而升高，并呈现出有规律性的、阶梯状的上升趋势；而图5则是浓度/电压的标准曲线，反映传感器测出的电势差值与铬离子·浓度的线性关系。传感器灵敏度是21mV/pCr (理论值30mV/deC);对铬离子的最低检测限为O. 14 μ mol/L，可用于检测饮用水和工业污水的铬离子浓度(世界卫生组织和我国规定饮用水中含铬最高上限标准0. 96 μ mol/L，我国工业含铬废水最高排放浓度9. 6 μ mol/L)。另外，该传感器对铬离子的响应时间小于60s。因此，本发明实现了探测响应快，灵敏度高，检测下限低等优点。三、新型的检测铬离子的微生物传感器对含铬水质标准样品的检测首先，按照上述的实验方法，用本次发明的新型的检测铬离子的微生物传感器分别对 I (T7mo I/L、I (T6mo I/L、l(T5mol/L、l(T4mol/L 和 l(T3mol/L 浓度的含铬溶液进行检测，根据其测出的电压值，画出浓度/电压的标准曲线(图6、7)。然后，将新型的检测铬离子的微生物传感器浸入含铬样品(批号201619,标准值1. 98±0. 09mg/L,相对浓度38±2ymol/L)中，测出电压值在19. 5至22. 5mV之间(图8)。根据标准曲线图7所示，38±2ymol/L铬离子浓度所对应的电压值为26± lmV，与该新型的检测铬离子的微生物传感器检测含铬标准样品时所得的电压值相近(误差在15至25%之间)。由此证明本发明的新型的检测铬离子的微生物传感器是可靠的，可用于监测工业含铬废水。并且，可根据浓度/电压标准曲线得知检测所得电势差值与之对应的离子浓度是否达到或超过国家规定工业污水的安全标准，有效地、有针对性地开展必要的更深层次的安全性分析，以及采取适当的措施；也可以根据检测结果，初步确定污水污染的状况和污染源，避免盲目投入，造成过多人力物力的浪费，这是符合我国国情的水源安全性评估发展趋势。
权利要求
1.一种新型的检测铬离子的微生物传感器，其特征在于，包括PC检测底板，在PC检测底板表面具有一条合金涂层传导通道，合金涂层传导通道一端与引线相连，另外一端为检测涂层，在检测涂层上方覆盖有一层PC盖板，在PC盖板上，与检测涂层相对应的位置设有检测池，检测涂层成为检测池的底面，在检测池的检测涂层表面敷有一层铬离子感应层； 所述的铬离子感应层是由石墨粉、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)GIMT1. 002冻干粉和液体石蜡按照质量比45:45:10组成，将三者混合均匀后，平铺于检测涂层表面。
2.根据权利要求I所述的新型的检测铬离子的微生物传感器，其特征在于，所述的检测涂层呈圆盘状，其直径为l(Tl5mm。
3.根据权利要求I所述的新型的检测铬离子的微生物传感器，其特征在于，所述的合金涂层传导通道是用合成黄金、钼金或银电镀而成。
4.根据权利要求I所述的新型的检测铬离子的微生物传感器，其特征在于，所述的铬离子感应层的厚度+. 1mm。
全文摘要
本发明公开了一种新型的检测铬离子的微生物传感器。它包括PC检测底板，在PC检测底板表面具有一条合金涂层传导通道，合金涂层传导通道一端与引线相连，另外一端为检测涂层，在检测涂层上方覆盖有一层PC盖板，在PC盖板上，与检测涂层相对应的位置设有检测池，检测涂层成为检测池的底面，在检测池的检测涂层表面敷有一层铬离子感应层；所述的铬离子感应层是由石墨粉、人苍白杆菌冻干粉和液体石蜡按照质量比45:45:10组成，将三者混合均匀后，平铺于检测涂层表面。本发明实现了样品需要量少、检测时间短、灵敏度高、检测下限低等特点，极易携带，便于实时监测；最重要的是制作成本低廉，可大批量生产，还稳定性高，生物选择性也高。
文档编号G01N27/26GK102944591SQ201210472840
公开日2013年2月27日 申请日期2012年11月20日 优先权日2012年11月20日
发明者郭诗韵, 许玫英, 张国霞, 陈杏娟, 孙国萍, 郭俊, 曾国驱 申请人:广东省微生物研究所, 佛山市环境健康与安全评价研究中心