专利名称：一种鲎试剂质量的监测方法
技术领域：
本发明涉及用于细菌内毒素检测的鲎试剂的检测方法，特别提供了一种鲎试剂质量的监测标准。
背景技术：
细菌内毒素(Bacterial Endotoxin)是革兰氏阴性细菌所产生的具有不同生物活性的大分子物质，其主要化学成分为脂多糖(LPS)。内毒素是注射剂药品(原料等)中的主要污染物质。
细菌内毒素的检测方法有家兔试验法、鲎试验法。鲎试验法(LimulusAmebocyte Lysate，LAL)是利用鲎试剂与内毒素发生凝集反应的原理，定性或定量检测药品或机体体液中细菌内毒素感染程度的一种体外检测方法。具体作法又分为凝胶法和定量法。
凝胶法是一种定性、限量测定内毒素的方法。其原理是在专用的试管中将内毒素样品与鲎试剂等量混合，保温反应，当内毒素与鲎试剂中的一系列因子发生反应后，激活凝固酶原，切断凝固蛋白原特定位置的精氨酸肽键，形成凝固蛋白从而产生凝胶。中国药典2000年版附录中对于细菌内毒素检查法的规定，就是依据此方法，来判定供试品中内毒素的限量是否符合规定，它需要实验者目测是否出现凝胶来判定阴、阳性结果，实验本身工作量较大，且容易出现人为误差。鲎试剂有不同灵敏度的规格，灵敏度不同的鲎试剂用来检测不同内毒素含量的样品。
定量法是利用动态比浊法的原理，即在内毒素与鲎试剂反应过程中，采用专用仪器检测记录其浊度变化，预设一个浊度值，当浊度值变化到该预设值时所需的时间作为特征反应时间，该特征反应时间的对数与内毒素浓度的对数呈线性关系。另外，当不同浓度的鲎试剂与同一个内毒素样品反应时，达到一定浊度值(例如浊度值0.02或浊度值0.077)所需的时间称为特征反应时间，特征反应时间越�。得黯资约劣肽诙舅囟呦嗷プ饔玫乃俣仍娇欤梅从μ逑档姆从π试礁�。其中，浊度值在0.077左右时，反应体系形成凝胶，因此，达到浊度值0.077的特征反应时间又定性反映了反应体系形成凝胶所需的时间。
内毒素测定仪中浊度值定义为A0’＝-lg(It/I0’)，其中I0’为检测初始时透射光强度，It为检测过程中的透射光强度，浊度值与入射光强度无关，因此消除了测定管尺寸、反应体系初始状态的影响。
目前鲎试剂的质量指标主要是灵敏度，它通过系列内毒素标准品溶液与鲎试剂反应形成凝胶与否来确定其灵敏度。方法是将细菌内毒素工作标准品稀释到2.0λ、1.0λ、0.5λ和0.25λ浓度，(λ是鲎试剂灵敏度值，单位是EU/ml，)每一稀释液作4管，分别与鲎试剂等比混合，轻轻振动上述试管混匀内容物，封闭管口，置37±1℃水浴中，保温60±2分钟待观察结果。另取内毒素检查用水与鲎试剂混合，做2支阴性对照管。结果判断最高浓度2.0λ的4管应均为凝胶阳性，最低浓度0.25λ的4管应均为凝胶阴性，且阴性对照管均为阴性时，则该鲎试剂的灵敏度为λ。灵敏度是鲎试剂的一个重要的指标，但是对鲎试剂的有效物质含量高低或浓度大小等质量指标尚没有检测和控制的方法。从而会引起鲎试剂质量的差异，影响其生产和检定工作。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鲎试剂质量的监测方法，准确、快速地测定被测鲎试剂样品中有效物质的含量。
本发明具体提供了一种鲎试剂质量的监测方法，其特征在于——将供试鲎试剂与标准内毒素溶液等体积混合，并放置于内毒素测定仪检测孔内；——检测浊度值，当平衡浊度值在0.08-0.27范围时为合格品，最佳范围为0.11-0.20。
本发明鲎试剂质量的监测方法中，所述供试鲎试剂与标准内毒素溶液的反应在试管中进行，反应液的总体积为0.2毫升至0.7毫升，反应温度为37±1℃。
本发明鲎试剂质量的监测方法中，所采用的试管，其内径为5.4毫米至10.2毫米。
本发明鲎试剂质量的监测方法中，检测浊度值的检测波长范围在400至700nm之间，最好为660nm。
本发明的发明人在内毒素测定仪上，通过测定含内毒素样品溶液与鲎试剂溶液混合后，反应体系的平衡浊度值和形成凝胶所需的时间的关系，发现鲎试剂中有效物质含量的高低决定了平衡浊度值的高低，鲎试剂有效物质含量高则平衡浊度值也高；平衡浊度值的高低又与形成凝胶所需的时间有关。当平衡浊度值范围为0.08-0.27时，反应体系形成凝胶所需的时间较短。
通常情况下，使用常规内毒素检查法进行内毒素限量检查，需要人工记录反应时间，人工目测判断结果，单个人不能完成大量样品检测。本发明利用仪器本身的特点，可以自动记录多个实验样品的反应时间，自动读取浊度值，根据浊度值来判断实验结果，单人实验可同时进行30个以上的样品测定，工作效率高。总之，本发明通过仪器测定浊度值来判断凝胶与否，提高结果的准确性，减少了人工目测判断凝胶与否的误差；检测时间可缩短至15分钟；并且检测结果便于保存、查找和比较。本发明与常规凝胶法联合使用，适用于鲎试剂的生产过程和复核监控等。
图1为不同用量鲎试剂反应的浊度变化图，浊度曲线右边的数字表示不同的鲎试剂用量，曲线为S形，纵坐标为浊度值，当某曲线的浊度值不再增加时，称为平衡浊度值。
具体实施例方式常规凝胶法的操作步骤是将供试品与鲎试剂等比混合于专用试管中，体积为0.2ml，混匀，封闭管口，置37±1℃水浴中，保温60±2分钟，取出试管缓缓倒转180度，观察结果。当试管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性结果；凝胶不能保持完整，并从管壁滑脱者为阴性结果。
实施例1取灵敏度为0.125EU/ml、标示溶解体积为0.5ml的鲎试剂干粉样品，加入0.5ml无热源水溶解，将标准内毒素溶液与溶解的鲎试剂等比混合于7mm内径平底试管中，放置于内毒素测定仪检测孔内，反应温度为37.1℃，反应总体积为0.3ml，标准内毒素溶液浓度为0.133EU/ml，检测时间为60分钟。反应结束后，得到反应的平衡浊度值为0.20，凝胶的结果为阳性。浊度值达到0.02时的特征反应时间为1260秒，浊度值达到0.077时的特征反应时间为2120秒。
实施例2.
取灵敏度为0.125EU/ml、标示溶解体积为0.5ml的鲎试剂干粉样品，加入1.5ml无热源水溶解，将标准内毒素溶液与溶解的鲎试剂等比混合于7mm内径平底试管中，放置于内毒素测定仪检测孔内，反应温度为37.1℃，反应总体积为0.3ml，标准内毒素溶液浓度为0.133EU/ml，检测时间为140分钟。反应结束后，得到反应的平衡浊度值为0.08，凝胶的结果为阳性。浊度值达到0.02时的特征反应时间为1120秒，浊度值达到0.077时的特征反应时间为3070秒。
实施例3.
取灵敏度为0.125EU/ml、标示溶解体积为0.5ml的鲎试剂干粉样品，加入0.15ml无热源水溶解，将标准内毒素溶液与溶解的鲎试剂等比混合于7mm内径平底试管中，放置于内毒素测定仪检测孔内，反应温度为37.1℃，反应总体积为0.3ml，标准内毒素溶液浓度为0.133EU/ml，检测时间为140分钟。反应结束后，得到反应的平衡浊度值为0.26，凝胶的结果为阳性。浊度值达到0.077时的特征反应时间为4190秒。
实施例4.
取灵敏度为0.125EU/ml、标示溶解体积为0.5ml的鲎试剂干粉样品，加入0.75ml无热源水溶解，将标准内毒素溶液与溶解的鲎试剂等比混合于7mm内径平底试管中，放置于内毒素测定仪检测孔内，反应温度为37.1℃，反应总体积为0.3ml，标准内毒素溶液浓度为0.133EU/ml，检测时间为10分钟。反应结束后，得到反应的平衡浊度值为0.11，凝胶的结果为阳性。浊度值达到0.02时的特征反应时间为1080秒，浊度值达到0.077时的特征反应时间为1830秒。
实施例5.
取灵敏度为0.125EU/ml、标示溶解体积为0.5ml的鲎试剂干粉样品，加入0.60ml无热源水溶解，将标准内毒素溶液与溶解的鲎试剂等比混合于7mm内径平底试管中，放置于内毒素测定仪检测孔内，反应温度为37.1℃，反应总体积为0.3ml，标准内毒素溶液浓度为0.133EU/ml，检测时间为140分钟。反应结束后，得到反应的平衡浊度值为0.12，凝胶的结果为阳性。浊度值达到0.02时的特征反应时间为1120秒，浊度值达到0.077时的特征反应时间为1870秒。
实施例6.
取灵敏度为0.03、0.06、0.125、0.25、0.5EU/ml，标示溶解体积为0.5ml的鲎试剂干粉样品，分别加入0.5ml无热源水溶解，将标准内毒素溶液分别与溶解的鲎试剂等比混合于7mm内径平底试管中，放置于内毒素测定仪检测孔内，反应温度为37.1℃，反应总体积为0.3ml，标准内毒素溶液浓度为0.1EU/ml，检测时间为100分钟。反应结束后，得到反应的平衡浊度值分别为0.19、0.165、0.27、0.087、0.107，凝胶的结果皆为阳性。
权利要求
1.一种鲎试剂质量的监测方法，其特征在于——将供试鲎试剂与标准内毒素溶液等体积混合，并放置于内毒素测定仪检测孔内；——检测浊度值，当平衡浊度值在0.08-0.27范围时为合格品。
2.按照权利要求1所述鲎试剂质量的监测方法，其特征在于平衡浊度值范围为0.11-0.20。
3.按照权利要求1所述鲎试剂质量的监测方法，其特征在于所述供试鲎试剂与标准内毒素溶液的反应在试管中进行，反应液的总体积为0.2毫升至0.7毫升，反应温度为37±1℃，检测时间为10-140分钟。
4.按照权利要求3所述鲎试剂质量的监测方法，其特征在于所采用的试管，其内径为5.4毫米至10.2毫米。
5.按照权利要求1所述鲎试剂质量的监测方法，其特征在于检测浊度值的检测波长范围在400至700nm之间。
6.按照权利要求5所述鲎试剂质量的监测方法，其特征在于检测浊度值的检测波长为660nm。
全文摘要
一种鲎试剂质量的监测方法，其特征在于将供试鲎试剂与标准内毒素溶液等体积混合，并放置于内毒素测定仪检测孔内；检测浊度值，当平衡浊度值在0.08－0.27范围时为合格品。本发明利用仪器本身的特点，可以自动记录多个实验样品的反应时间，自动读取浊度值，根据浊度值来判断实验结果，单人实验可同时进行30个以上的样品测定，工作效率高。总之，本发明通过仪器测定浊度值来判断凝胶与否，提高结果的准确性，减少了人工目测判断凝胶与否的误差；检测时间可缩短至15分钟；并且检测结果便于保存、查找和比较。本发明与常规凝胶法联合使用，适用于鲎试剂的生产过程和复核监控等。
文档编号G01N21/00GK1763535SQ200410050608
公开日2006年4月26日 申请日期2004年10月18日 优先权日2004年10月18日
发明者李京华, 邵英光, 岳丽娜, 王俊德 申请人:中国科学院大连化学物理研究所
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
