专利名称：在植物叶片微观结构中定位观察而对叶片进行处理的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用大型精密仪器一透射电子显微镜在植物叶片微观、超微观结构中定位研究而对叶片进行处理的方法。
背景技术：
叶片是植物的重要器官，在植物研究中，对植物叶片的研究占有相当大的比重。利用透射电子显微镜研究叶片的微观、超微观结构，已经经历了几十 年，但是研究方法一直停顿在断面方向切片，由于在断面方向切片获取信息凌乱，对叶片的结构研究进展不大，直至2008年“一种用于研究植物叶片全息结构而对叶片进行处理的方法”采用了对叶片横向切片，才有了全面、系统获取大量叶片微观结构信息的方法。但是，由于我们对植物微观世界还很陌生，在研究中主要采用对照样品与处理样品比较观察的方法，不同生物体间的比较需要在相同的观察部位上进行，植物样品(器官、组织、细胞和细胞器)电子显微结构的比较需要采用定位观察方法，也就是说只有定位才能进行两个或更多个样品间的比较，否则难以判断其样品间的真实差异。由此可见，研究一种可以定位研究叶片组织、细胞及细胞器结构的方法，对于研究植物叶片微观结构具有重要意义。“一种用于研究植物叶片全息结构而对叶片进行处理的方法”虽然获取信息量大、全面，但在研究任何一个问题时，都必须通过“由上至下逐片观察”筛�。庵址椒ǹ梢越饩觫偈煜さ难罚虎谒凶橹峁咕冉霞虻ゲ煌肿橹峁怪洳钜旖洗蟮难返难芯俊＠绶岩镀橹浣峁共钜齑螅颐腔箍梢酝ü鄄焓銮衅菸颐且丫莆盏闹�、靠主观记忆判断辨认出四种结构(见附图1-1、1_2、1-3、1-4图):分别为表皮组织结构，栅栏组织，传导组织，海绵组织。虽然繁琐、费时，还可行。如果我们要研究一种陌生植物，要研究复杂结构的植物，要研究确认两种植物之间是否存在细小差异，我们要“由上至下逐片观察”数十片甚至数百片；在差异相近时，还要由数百倍放大到数千倍、万倍甚至更高率，分辨确认每片之间的共同点和差异点，其研究工作的量是难以想象的。现有的研究方法存在许多问题
I、组织结构的定位是靠人的感觉辨认确定，会受人能力和主观意志限制。2、要选择某一特征结构切片时，要通过观察、对比全部切片一要对数十甚至数百张切片、由数百倍放大到数万倍甚至更高倍率中筛选。3、不能研究陌生、复杂、不同组织结构在多层面出现相近的结构。
发明内容
发明目的①本发明提供一种用于在植物叶片微观结构中定位观察而对叶片进行处理的方法。②其目的是提出一种全新的利用透射电子显微镜定位观察叶片微观结构的样品处理、切片、定位、观察方法，以满足植物微观结构主要的研究方法一 “比较研究法”所必备的，对比双方处于相同结构中的条件。 ③此方法简单、实用，是将透射电镜专用定位断面切片观察方法、透射电镜横向切片观察方法和扫描电子显微镜二次电子像的观察方法有机的结构起来，在组织结构定位上获取了突破性的进展，在整个系统空间定位技术保障下，得以实现对叶片全部微观结构精准定位研究。技术方案本发明是通过以下技术方案实施的
在植物叶片微观结构中定位观察而对叶片进行处理的方法，其特征在于该方法包括①透射叶片样品前处理制作定位专用整体断面切片、观察照相制作横向切片；④横向切片垂直空间和组织结构定位检验横向切片、观察、照相；⑥保障整个系统的空间定位规范；⑦根据有序的定位层面构建微观立体结构；⑧扫描电镜样品制备、观察照相、检验立体结构八个部分； 在步骤①中，取相邻两块样品垂直包埋，分别作断面切片和横向切片的包埋块；作断面切片的样品块、在60°C聚合时、时间减半，刀刃沿叶片上下表面延长线的方向、作断面切片，能获取叶片完整断面结构 在步骤②中取断面定位专用样品包埋块，调整刀刃与断面上的双表皮延长线成为垂直方向，按厚度200nm作断面切片，每修掉样品约O. Imm厚，捞片，共取10个载网；采用常规醋酸双氧铀一梓檬酸铅双重染色；观察时增加加速高电到100万伏、光斑选I档，聚光镜光阑选I档；选择含上、下表皮，含维管束完整结构，照相；
在步骤③中，在切片机实体显微镜下，会观察到叶片表面是凸凹形成的条状，调整刀刃运动方向与条状结构延长线方向一致；切片面会含并行的三条以上结构，用两侧条状结构上部最高凸起处对刀，使刀刃的全部行程与叶片表面整体平行；去掉上表皮表面凸起部分，约表面积的3/4区域；开始正式切片、捞片，每去掉50片，用一个有标记的载网捞取10片，每个载网作一个计数，全叶片由上至下总计数为I 一N ;调整切片机按70nm进刀量切片；在步骤④中在步骤③中获取载网的计数I 一N，在步骤②中获取的定位专用叶片整体断面图，由上至下显示叶片各层组织结构，将图在垂直方向作N等份，每份与I-N序列号的横向切片一一对应，形成玉米叶片整体结构定位 在步骤⑤中，作横向切片定位时，先将叶片完整断面结构图由上至下等分N份，与横向切片对应，将横向切片标注在相应的组织结构和垂直的立体空间上；针对不同植物选定检验切片方向精度的标准切片，禾本科植物标准横向切片的确定方法为MX1 MX2^ I ；MX1 :被显示出传导组织木质部或韧皮部首端的宽度；MX2: MXl所在传导组织木质部或韧皮部尾端的宽度；
在步骤⑥中，为完成最终的精准定位，在每一个步骤中含有空间定位分项操作规范，其集合保证最终结构精准定位；
在步骤⑦中，通过观察、分析可确定一些复杂的微观立体结构；
在步骤⑧中，对固定好的叶片作脱水、临界点干燥、断裂、钼金镀膜常规处理，采用扫描电镜二次电子图像，观察叶片断面及特定部位的立体结构，检验定位观察结论。在步骤⑥中的具体操作为
①前处理选择相邻的两块样品，垂直包埋，可最大程度消除结构之间的误差；
②横向切片时，先去掉上表面凸出的高度，保留凹处的1/4的面积位；在对定位专用断面组织结构分区时，去掉凸出部分从表皮最低点向上1/4高开始划分；
③采用等分断面结构图与横向切片对应的方法，抵消断面切片伸缩对高度变化的影响；这种做法基准点在中心，最大限度减少了横向切片与断面切片在操作过程中出现的误差;
④采用有标记的载网获取立体空间定位和平面空间定位，采用切片面为梯形和载网上特定标记作辅助定位等方法来作切片内结构的定位；
⑤切片时采用压片捞片法，观察时确定载片面、面向电子束，定位样品朝向。优点及效果本发明提供一种用于在植物叶片微观结构中定位观察而对叶片进行处理的方法。本发明将透射电镜断面切片观察方法、透射电镜横向切片观察方法、和扫描电子显微镜观察二次电子像的方法有机的结构起来，在叶片组织结构定位上获取了突破性的进展，结合整个系统定位技术，实现对叶片全部微观结构精准定位研究。可获取一套精确的组织结构、细 胞结构、细胞器结构和空间定位结构图，还适用于复杂结构的叶片的简便精准定位研究。为了植物叶片微观结构主要研究方法一 “比较研究法”的创造了研究必备的前提条件。具有以下优点
(I)通过新的样品前处理制作工艺和切片工艺，在研究允许的低分辨率区域克服了叶片与树脂脱离、叶片卷曲的问题，获取定位专用的叶片整幅断面结构图。玉米叶片专用定位断面结构图(见附图3-1);番茄叶片专用定位断面结构图(见附图3-3)。在常规断面切片时不能获取叶片完整的断面结构图，尤其是表皮坚硬，叶肉松软的禾本科玉米等植物，很难获取两种以上组织共存在一张切片上的结构。(2)在定位专用断面结构图上作叶片组织结构分区，玉米叶片(见附图3-2)，番茄叶片(见附图3-4)，将一组横向切片精准定位到各种组织结构或特定结构层面，玉米叶片结构定位图(见附图4)。(3)通过组织、细胞、细胞器结构定位和空间定位技术结合，实现叶片微观结构整体精准定位，玉米叶片一部分细胞、细胞器、亚细胞器定位结构(见附图5、6、7)，番茄特定部位定位结构(见附图8)。(4)定位范围达到全部组织结构(见附图4)，定位精度达到单细胞结构层面(见附图 8-8、8-9)。(5)通过对有序的定位结构分析可构建叶片中一些细胞、细胞器的微观立体结构，可更有效的确定微观结构研究中的定位点。
附图I靠人主观判断能确认的番茄叶片的四种组织结构；
1-1番茄叶片表皮组织结构TEMX I. 4K，
1-2番茄叶片栅栏组织结构TEMXO. 2K，
1-3番茄叶片传导组织结构TEMXO. 4K，
1-4番茄叶片海绵组织结构TEMXO. 4K;
附图2检验玉米叶片切片方向精确度的特征切片结构图TEMXO. 2K ；
附图3叶片横向切片定位专用叶片断面结构及定位结构 3-1玉米叶片组织结构定位专用断面结构图，
3-2在定位专用断面结构图上作叶片组织结构分区线和等分线，图中代号含义
A上表皮组织部分，
B上叶肉组织部分，
C维管束的上维管束鞘结构部分，
D维管束的导管部分，
E维管束的韧皮部部分，
F维管束的下维管束鞘部分，
G下叶肉组织部分，
H下表皮组织部分；
3-3番茄叶片组织结构定位专用断面结构图TEMXO. 2K ；，
3-4在定位专用断面结构图上作叶片组织结构分区线和等分线；图中代号含义
A上表皮组织部分，
B栅栏组织上部，
C栅栏组织中部，
D栅栏组织下部，
E维管束的上维管束鞘部分，
F维管束的导管部分，
G维管束的韧皮部部分，
H维管束的下维管束鞘部分，
I海绵组织部分，
J下表皮组织部分，
附图4玉米叶片组织结构定位4-1上表皮组织结构图TEMXO. 4K，
4-2 4-1 图延伸 TEMX O. 4K,
4-3上部叶肉组织中间层面结构图TEMXO. 4K，
4-4上部叶肉组织靠上维管束鞘顶端结构图TEMXO. 4K，
4-5上单列维管束鞘层面及叶肉组织结构图TEMXO. 4K，
4-6上三列维管束鞘层面及叶肉组织结构图TEMX0.4K，
4-7导管与维管束鞘交界层面及叶肉组织结构图TEMX0.4K，
4-8导管中心层面结构图(与4-9图并行)TEMX O. 4K，
4-9导管中心层面结构图(与4-8图并行)TEMX O. 4K，
4-10韧皮部中心层面结构图TEMXO. 4K，
4-11下双列维管束鞘层面结构图TEMXO. 4K，
4-12下表皮组织结构图TEMXO.6 ；
附图5玉米叶片维管束鞘细胞及叶绿体定位结构5-1(来源4-5图)上维管束鞘层面结构定位图，
5-2 (5-1为其定位图)上维管束鞘细胞结构，
5-3 (5-2为其定位图)上维管束鞘细胞内叶绿体结构，5-4 (5-3为其定位图)上维管束鞘细胞内叶绿体间质片层结构TEMX48K，5-5 (来源4-11图)下维管束鞘层面结构定位图，
5-6 (5-5为其定位图)下维管束鞘细胞结构，
5-7 (5-6为其定位图)下维管束鞘细胞内叶绿体结构，
5-8 (5-7为其定位图)下维管束鞘细胞内叶绿体间质片层结构TEMX48K，5-9 (来源4-8图)大框内为导管层面维管束鞘细胞结构，
5-10 (5-9为其定位图、小框内)导管层面维管束鞘细胞内叶绿体结构，5-11 (来源4-6)上三列维管束鞘层面，细胞结构图，
5-12 (来源4-7)上维管束鞘与导管交界面，细胞结构图， 5-13 (来源4-10)韧皮部中心层面结构定位图，
5-14 (5-13为其定位图)韧皮部层面维管束鞘细胞结构，
5-15 (5-14为其定位图)韧皮部层面维管束鞘细胞内叶绿体结构，
5-16 (5-15为其定位图)横剖叶绿体内间质片层走向，
5-17 (5-15为其定位图)横剖叶绿体中、间质片层的空白区TEMX48K，
5-18(5-16图放大)与常规观察方向垂直时间质片层结构TEMX48K ；
附图6玉米叶片叶肉细胞及叶绿体定位结构6-1(来源4-2图)上叶肉细胞顶端靠上表皮细胞处的结构，
6-2 (来源4-3图)上叶肉细胞中部结构，
6-3 (来源4-4图)上叶肉细胞下端结构，
6-4 (6-2为其定位图)上叶肉细胞定位结构，
6-5 (6-4为其定位图)上叶肉细胞的长叶绿体结构，
6-6 (6-5为其定位图)上叶肉细胞中长叶绿体内片层结构TEMX48K，
6-7 (6-4为其定位图)上叶肉细胞的圆形叶绿体结构，
6-8 (来源2-1图)玉米叶片断面结构，
6-9 (来源4-5图)中部叶肉细胞、在单列维管束鞘层面定位图，
6-10 (来源4-9图)中部叶肉细胞、在导管层面定位图，
6-11 (来源4-10图)中部叶肉细胞、在维管束鞘层面定位图，
6-12 (6-9为其定位图)长叶肉细胞为中部细胞顶端结构，
6-13 (6-10为其定位图)中部细胞最大结构图，
6-14 (6-11为其定位图)中部细胞在韧皮部层面结构图，
6-15 (6-13为其定位图)中部叶肉细胞、最大结构处长叶绿体结构，
6-16 (6-13为其定位图)中部叶肉细胞、最大结构处圆叶绿体结构，
6-17 (6-15为其定位图)长叶绿体内片层结构TEMX48K，
6-18 (6-14为其定位图)韧皮部层面叶肉细胞中圆形叶绿体结构，
6-19 (来源4-12图)表皮细胞轮廓内叶肉细胞结构，
6-20 (6-19为其定位图)靠表皮的叶肉细胞内叶绿体结构，
6-21(6-20为其定位图)靠表皮的叶肉细胞内叶绿体片层结构TEMX48K ；附图7玉米叶片有机物质传输系统的结构特点及传输物质的形态；
7-1(来源4-10图)筛管及筛管中输送物质结构定位图，7-2 (7-1为其定位图)筛管中输送的物质结构及定位，
7-3 (7-1为其定位图)筛板、筛管与伴胞之间通道定位，
7-4 (7-2为其定位图)高倍下输送物质为晶格结构TEMX48K，
7-5 (7-3为其定位图)筛板结构、筛板附近有两种形态物质，
7-6(7-3为其定位图)筛管与伴胞之间通道结构TEMX48K ；
附图8番茄传导组织定位结构；
8-1完整梯形切片为平面结构定位切片TEMXO.2K，
8-2第64号载网，番爺导管层面结构，
8-3第68号载网，导管与韧皮部之间的薄壁细胞结构，
8-4第70号载网,韧皮部最上层面结构，
8-5第72号载网,韧皮部中间层面结构，
8-6 (8-4为其定位图)筛板定位图，
8-7 (8-6为其定位图)筛板及筛板附近 物质结构，
8-8 (8-5为其定位图)筛管与两侧细胞结构及输送物质结构，
8-9 (8-8为其定位图、8-8上层面结构)筛管与两侧细胞结构及筛管与伴胞间通道定
位，
8-10 (8-8为其定位图)筛管中丝状物质，
8-11(8-9为其定位图)筛管与伴胞间通道的通孔结构TEMX48K ；
附图9用扫描电镜二次电子像观察玉米维管束鞘细胞及叶绿体结构；
9-1(9-2为其定位图)在五个维管束鞘细胞部位叶片断面结构，
9-2两相邻维管束结构图，
9-3 (9-1为其定位图)维管束结构，
9-4 (9-2为其定位图)在六个维管束鞘细胞部位叶片断面结构，
9-5 (9-3为其定位图)小维管束鞘细胞结构中的叶绿体形态，
9-6 (9-4为其定位图)大维管束鞘细胞结构中的叶绿体形态。
具体实施例方式 本发明将透射电镜观察叶片断面切片的方法、透射电镜观察叶片横向切片的方法、扫描电子显微镜观察二次电子图像的方法有机的结构起来，提供了一种用于在植物叶片微观结构中定位研究而对叶片进行处理的方法，通过本发明可获取一套精准定位的组织、细胞、细胞器结构图；还可简单方便的对复杂结构类型叶片的特定部位精准定位研究。其具体方法主要包括以下八个部分①透射叶片样品前处理部分，②制作定位专用整体断面结构图部分，③制作横向切片部分，④横向切片垂直空间和组织结构定位部分，
⑤检验横向切片方向的精度、样品观察部分，⑥整个系统空间定位保障规程执行部分，⑦断面像与有序的定位层面、构建微观立体结构部分，⑧扫描电镜二次电子像检验相应立体结构部分。在本研究中使用的主要仪器瑞士产LKB-1800型超薄切片机；日本日立S-450型扫描电子显微镜；日本电子JEM-100CX II型透射电子显微镜。I、透射叶片样品前处理技术供试材料准备禾本科植物玉米叶片；双子叶植物番茄叶片。取叶柄与叶稍、叶中脉与叶缘中间叶肉部分，玉米在最小叶脉处取三条以上，番茄取样避开可见叶脉。透射制备观察样品取样用锋利刀片取叶片样品ImmX IOmm小块；扫描制备观察样品取样与透射样品并行取3_X5mm小块，固定在2. 5%的戊二醛固定液中备用。将已固定好的透射电镜样品，按透射电子显微镜技术中常规处理样品方法处理叶片样品。常规处理方法取ImmX IOmm叶片样品，用2. 5%戊二醛和1%锇酸双固定，乙醇30% — 50% — 70%丙酮70% — 80% — 90% — 100%系列脱水，树脂Epon812渗透、包埋前用锋利刀片将样品边缘O. 2mm部分去掉备用。在实体显微镜下观察玉米叶片，选小脉处、沿脉方向切成约O. 5X0. 5mm的小块，
连续取两块样品，一块上表皮靠在包埋模具的前端，另一块脉的断面靠在包埋模具的前端，分别加入包埋剂备聚合。在实体显微镜下观察番茄叶片，取表面无脉平整部位，切成约O. 5X0. 5mm的小 块，连续取两块样品，一块上表皮靠在包埋模具的前端，另一块断面靠在包埋模具的前端，分别加入包埋剂备聚合。上表皮靠包埋模具前端的样品块按常规37°C、45°C、60°C聚合。断面靠包埋模具前端的样品块，60°C聚合时间减半。此项操作获取横向切片样品包埋块，断面定位专用样品包埋块。2、制作定位专用整体断面切片、观察照相技术取断面定位专用样品包埋块，调整刀刃与断面双表皮垂直、沿双表皮延长线方向运行，按厚度200nm (紫色)作断面切片，每修掉样品约O. Imm厚，捞片，共取10个载网；采用常规醋酸双氧铀一梓檬酸铅双重染色；观察时增加加速高电到100万伏、光斑选I档，聚光镜光阑选I档；选择含上、下表皮，含维管束的完整结构，照相(X200倍率)。此项操作获�。ㄎ蛔ㄓ谜逡镀厦嫱肌�3、制作横向切片技术
修样品块取横向切片样品包埋块，在实体显微镜下，用双面刀将样品块修成上表面为梯形；样品立体部分上部小、下部大的台形；还有上表皮四周及样品总高为3/4以上的部分裸露，样品下1/4部分及下表皮镶嵌在树脂内。切面要平滑。修完块后，用夹取载网的鹰嘴镊子揭掉叶片上表皮上面的树脂膜。横向切片①在切片机实体显微镜下，会观察到玉米叶片表面是凸凹形成的条状，调整刀刃运动方向与条状结构延长线方向一致；切片面会含并行的三条以上结构，用两侧条状结构上部最高凸起处对刀，使刀刃的全部行程与叶片表面整体平行；去掉上表皮表面凸起部分，约表面积的3/4区域；开始正式切片、捞片，每去掉50片，用一个有标记的载网捞取10片，每个载网作一个计数，全叶片由上至下总计数为I 一N。调整切片机按70nm(浅黄)进刀量切片。捞片全部采用压片捞片的方式。②在切片机实体显微镜下，会观察到番茄叶片表面还有凸、凹不平，用最高点处的茸毛的基部对刀，使刀刃的全部行程与上表皮整体平行后，去掉上表皮表面凸起部分，约表面积的3/4区域，开始正式切片、捞片，每去掉50片，用一个有标记的载网捞取10片，每个载网作一个计数，全叶片由上至下总计数为I 一N。调整切片机按70nm(浅黄)进刀量切片。捞片全部采压片捞片的方式。切片染色采用常规醋酸双氧铀一朽1檬酸铅双重染色。此项操作获取一套横向切片。
4、横向切片垂直空间和组织结构定位技术在3小节制作横向切片中，获取载网的计数I 一N，本实验中玉米叶片N为53 ;在2小节获取的定位专用叶片整体断面图(见附图
3-1)，图由上至下显示叶片各层组织结构，将图在垂直方向作N(53)等份，和组织结构层面区域线(见附图3-2)，每份与I-N(53)序列号的横向切片一一对应，形成玉米整体结构定位图；番茄整体结构定位方法同上(见附图3-3、3-4)。横向切片被准确定位为各组织类型及空间的特定部位。5、检验横向切片、观察、照相技术采用特征切片验证全套切片方向的精确度，玉米选用木质部或韧皮部层面(见附图2);番茄选用栅栏组织中部切片作为检验切片；
和本科植物标准横向切片的确定方法为MX1 MX2 1，
MXl :被显示出传导组织木质部(或韧皮部)首端的宽度，
MX2: MXl所在传导组织木质部(或韧皮部)尾端的宽度，
双子叶植物标准横向切片的确定方法为Σ ΦΧ : Σ ΦΥ 1，
ΦX:叶片横向切片时，栅栏组织细胞X方向上的直径；
Φ Y:叶片横向切片时，栅栏组织细胞Y方向上的直径。观察、照相根据研究需要，选出定位的组织结构切片，同时还要按空间和平面定位规程操作，对细胞、细胞器以及亚细胞器作定位照相；无特殊要求时玉米照相取中间脉。6、整个系统空间定位保障方法为完成最终的精准定位，在本发明的许多步骤中含有空间定位分项操作规范，其集合保证最终结构精准定位，操作中要注意
①前处理选择相邻的两块样品，垂直包埋，可最大程度消除结构之间的误差。②横向切片时，先去掉上表面凸出的高度，保留凹处的1/4的面积位；在对定位专用断面组织结构分区时，去掉凸出部分从表皮最低点向上1/4高开始划分。③采用等分断面结构图与横向切片对应的方法，抵消断面切片伸缩对高度变化的影响；这种做法基准点在中心，最大限度减少了横向切片与断面切片在操作过程中出现的误差。④采用有标记的载网获取立体空间定位和平面空间定位，采用切片面为梯形和载网上特定标记作辅助定位等方法，作切片内结构的定位。⑤切片时采用压片捞片法，观察时确定载片面、面向电子束，定位样品朝向。7、通过断面切片结构和有序的定位层面结构结合，构建微观立体结构通过观察、分析可确定一些复杂的微观立体结构，例如玉米叶片维管束鞘细胞的立体形态；维管束鞘中叶绿体立体形态；叶肉细胞的立体形态及在立体结构和在功能上为将叶肉细胞分为两类。8、扫描电镜样品制备、观察照相对固定好的叶片作脱水、临界点干燥、断裂、钼金镀膜等常规处理，观察叶片断面及特定部位的立体结构，检验本发明获取的结构结果。下面通过图片介绍植物叶片微观结构定位研究法，在复杂微观结构植物叶片研究中的应用，本发明以类型不同、复杂程度较高的C4植物玉米，双子叶植物番茄，来介绍具体特点
第一部分玉米叶片横向切片定位的专用断面结构图及整体结构定位在玉米叶片定位专用断面切片上我们观察到的叶片结构，见附图3-1，传导组织由并行排列的维管束构成；维管束的上部是木质部、下部是韧皮部；维管束外围被维管束鞘环绕；叶肉细胞包裹在维管束鞘外、填充在维管束与上下表皮之间的所有空间。按定位专用断面结构图玉米叶片组织结构分区，见附图3-2，各种组织结构的切片层面，如下分布(我们按层面的主要结构来称呼各个层面)
A上表皮组织切片在I 7号载网，
B上叶肉组织切片在8 19号载网，
C维管束的上维管束鞘结构切片在20 25号载网，
D维管束的木质部切片在26 31号载网，
E维管束的韧皮部切片在31 35号载网，
F维管束的下维管束鞘切片在36 40号载网， G下叶肉组织切片在40 47号载网，
H下表皮组织切片在48 53载网。在没特殊标注时，我们是选同一种组织结构的中间载网观察，选择维管束的中间列位置照相。第二部分玉米叶片微观定位结构及特征
玉米叶片的组织结构、尤其是维管束鞘和叶肉组织是复杂的立体结构，要由多个层面的结构共同构建才能完整的描述其特点；玉米叶片维管束鞘细胞和叶肉细胞是有多重方向性的复杂形体；玉米是C4植物，叶绿体有两种结构类型、每种类型都有多重方向。我们通过在玉米叶片上选定的10个层面、12幅图为主图，及在主图中对叶片组织、细胞、细胞器结构逐级定位放大图，来描述玉米叶片微观整体结构，对一些主要结构还通过有序的定位层面、构建出微观立体结构。我们选用的12幅主图，由上至下排列见附图4 :上表皮组织定位结构(见附图4-1、
4-2);上部叶肉组织、中部层面定位结构(见附图4-3);靠上维管束鞘层面上叶肉组织定位结构(见附图4-4);上单列维管束鞘层面及叶肉组织定位结构(见附图4-5);上三列维管束鞘层面及叶肉组织定位结构(见附图4-6);导管与维管束鞘交界层面及叶肉组织定位结构(见附图4-7);导管中心层面定位结构(见附图4-8、4-9两图为相互并行结构)；韧皮部中心层面定位结构(见附图4-10);下双列维管束鞘层面定位结构(见附图4-11);下表皮细胞外轮廓定位结构(见附图4-12)。(—)、玉米叶片组织定位结构、细胞定位结构及特征
I、表皮组织结构上表皮组织结构见附图4-1、4_2，下表皮组织结构见4-12。表皮长细胞轮廓沿脉的方向排列；两列之间，相邻细胞错位排列；表皮长细胞内含物质很少，但表皮细胞内壁上有大量的毛刺结构，细胞的上、下壁被同时切割形成两个大轮廓结构(内轮廓中的叶绿体及细胞结构是叶肉细胞结构)，说明表皮细胞内侧壁向外侧壁方向凹，电子束轰击使气孔开口增大，也使部分细胞之间裂痕形成孔洞。2、维管束组织结构见附图4-5至4-11及由4_5至4_11图定位组合的维管束鞘细胞定位结构图(见附图5)
玉米叶片的脉是并列延伸形结构，每根脉中心是维管束，维管束鞘环绕维管束外围，叶肉细胞又环绕在维管束鞘外部，在不同层面上会出现由维管束、维管束鞘、叶肉组织不同组合的条状相间的结构。I)、维管束的木质部在上部，见附图4-8、4_9，导管长而粗、与维管束宽度相近，两侧是单列维管束鞘细胞，维管束鞘外侧是叶肉细胞。
2)、维管束的韧皮部在下部，见附图4-10，韧皮部由数根细长的筛管、伴胞等紧密相间构成；筛管中有少量的传输物质；筛管旁有两类细胞，一类是电子反差较深、有丰富内含物的伴胞，另一类电子反差较浅的细胞、内含物质较少；其外侧是单列维管束鞘细胞，再外侧是叶肉细胞。3)、维管束鞘的结构及特点，维管束鞘环绕在维管束外围，在维管束的所有层面都能观察到维管束鞘列。①维管束鞘的上部层面(见附图5-1)，下部层面(见附图5-5)，都是维管束鞘细胞列与叶肉细胞列条状相间的结构；维管束鞘细胞为四边形结构(见附图5-2，5-6)，鞘细胞两列之间、相邻细胞错位排列；在维管束鞘的最上部和最下部层面上，维管束鞘细胞内部布满细胞器的结构。下维管束鞘细胞较上维管束鞘细胞规整度略差。②在叶片中间，导管层面(见附图5-9)，维管束鞘整齐排列在维管 束两侧，是与叶肉细胞列条状相间的结构；维管束鞘细胞为四边形(见附图5-9中大框内);维管束鞘细胞内部的细胞器是紧密拥挤在背离导管侧的鞘细胞内壁上，靠导管侧的另一半维管束鞘细胞、是细胞器空白的结构。③在维管束的中上部和中下部，维管束鞘结构变化有下面规律在中上部，三列维管束鞘(见附图5-11)由中间列开始出现空腔，到下层(见附图5-12)，中间列出现木质部结构、两侧列开始出现空腔。在中下部，韧皮部下层面(见附图5-13，右上部)，韧皮部旁的维管束鞘细胞中间出现空白、两侧出现细胞器。二级传导结构，在两维管束之间还可见横向小的传导结构见附图2-1
3、叶肉组织结构见附图4-1至4-12及4-1至4-12图定位组合的叶肉细胞定位结构图(见附图6)
叶肉组织细胞填充在叶片所有结构之间，在叶片的所有层面都能观察到叶肉组织的细胞及细胞器。I)、上叶肉细胞结构
①叶肉细胞最小的结构在紧靠上维管束鞘顶端(见附图6-3)，叶肉细胞以小圆结构在维管束鞘上、延维管束延伸线紧密排列，其它类型的结构在这个层面上以距离维管束鞘近时小、圆、密，远时大、长、疏的特点分布，见附图4-4，小细胞结构内含物饱满、圆形叶绿体结构较多。②在上叶肉组织中部定位层面结构(见附图6-2)，叶肉细胞沿维管束延伸线紧密排列，长形状细胞增多，细胞结构增大，椭圆叶绿体增多。③上叶肉细胞的顶端终结在上表皮细胞下壁，(见附图6-1)，可观察到叶肉细胞为中等圆形结构，其内部叶绿体多为长形结构。2)、下叶肉细胞与上叶肉细胞结构基本相同、方向相反、规整度略差。3)、中间叶肉细胞结构在断面结构的中间部位(见附图6-8)。①叶肉细胞最大结构在叶片中部导管层面(见附图6-10)，在这个层面上，是两列叶肉组织细胞、维管束鞘、导管相间的结构。叶肉细最大结构(见附图6-13)外轮廓为四边形；在叶肉细胞与维管束鞘相邻侧、细胞壁向细胞内深度凹进、紧靠维管束鞘处形成2个(或更多)小结构、这些小结构与1-3个维管束鞘细胞接壤；两叶肉细胞相邻侧有略浅的内凹；叶绿体松散分布在细胞内壁，叶绿体多为长椭圆形。
②叶肉细胞最大结构的下或上层面(见附图6-11)，相同位置上，叶肉细胞结构减小(见附图6-14)，向细胞内凹减�。谇氏赴灾鸾バ纬啥懒⑿∫度庀赴峁梗酵�
4-6、4-7。③在叶片中上部，在单列维管束鞘层面(见附图6-9)，在导管层面大叶肉细胞结构竖直的上方(见附图6-12)，我们可观察到长形叶肉细胞内部尤其是细胞中间有许多圆形叶绿体结构。(二 )、玉米叶片叶绿体结构定位及特征
I、玉米维管束鞘细胞的叶绿体定位结构及特征
I)、维管束鞘上部层面的单列细胞中叶绿体结构，见附图5-2，维管束鞘下部双列细胞中叶绿体结构，见附图5-6，叶绿体为长椭圆形(见附图5-3、5-7);外轮廓清晰、长短轴比 为4-5倍、无方向紧密拥挤在一起；叶绿体内淀粉粒为两头尖的长形、方向与叶绿体基本一致；间质片层沿叶绿体外膜有二一三层大环绕结构、其余与叶绿体长轴方向一致、将淀粉粒夹在中间，淀粉粒过大时叶绿体有被挤胀变形的现象、间质片层方向被改变；在上、下维管束鞘细胞的叶绿体结构中间质片层为双层膜结构(见附图5-4、5-8)定位图见5-3、5-7。2)、叶片中部维管束鞘细胞内叶绿体的结构，在导管层面(见附图5-10)定位图见
5-9、韧皮部层面(见附图5-15)定位图见5-14，叶绿体长短轴相近，淀粉粒长短轴相近；当准确切片在叶绿体长宽面上，可观察到间质片层另外一面即与间质片层双层膜间面相垂直面的结构(见附图5-16)定位见5-15，间质片层靠背离维管束侧的维管束鞘细胞壁内侧大环绕，再放大观察(见附图5-18)间质片层没有双层膜、为棱状结构；靠维管束的内侧的叶绿体上间质片层很少见(见附图5-17)定位见5-15。通过统计，维管束鞘细胞中叶绿体内部结构与外轮廓形态显著相关；内部结构和外轮廓与叶绿体被切片位置显著相关。通过统计，维管束鞘细胞内叶绿体外轮廓与细胞被切片位置角度显著相关。2、玉米叶肉细胞的叶绿体定位结构及特征
我们观察到的叶肉细胞中叶绿体结构有如下规律外轮廓为长形的叶绿体、内部基粒为片层结构；外轮廓为接近圆形叶绿体的基粒为圆形结构。上叶肉细胞中部长形叶绿体结构(见附图6-5、6-6)定位见6-4，中部叶肉细胞最大结构中长形叶绿体结构(见附图6-15、
6-17)定位见6-13，下表皮细胞壁附近叶肉细胞内的长形叶绿体(见附图6-20、6-21)定位见6-19，叶绿体内部基粒均为片层结构；与上面长形叶绿体相同位置上的外轮廓为接近圆形的叶绿体(见附图6-7)定位见6-4，(见附图6-16)定位见6-13、(见附图6_18)定位见
6-14,基粒均为圆形。通过统计叶绿体内部结构与外轮廓显著相关；叶绿体外轮廓与被切片的位置显著相关，也与叶绿体坐落的细胞壁被切片角度显著相关。(三)、构建玉米叶片微观立体结构和检验
本发明将断面切片结构和有序的定位层面结构起来，对玉米微观结构分析，构建微观立体结构
I、表皮组织立体结构表皮细胞内有大量的毛刺结构，表皮细胞壁向细胞内凹，凹处有叶肉细胞填充，见附图3-1、4-1、4-2、4-12。2、维管束鞘的立体结构维管束鞘是环绕维管束的细胞，维管束鞘细胞是断面为花瓣形的柱形结构，细胞器类似花瓣的颜色分布在维管束鞘细胞内，维管束鞘细胞沿维管束延伸方向整齐排列，小维管束被5-7个维管束鞘细胞列环绕，相邻列维管束鞘细胞错位排列，见附图3-1、4-5、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、4-11及定位结构图5 ;维管束鞘内细胞器以叶绿体为主、叶绿体以长短轴相近的饼状为主，叶绿体无序紧密拥挤在一起，尽量以一个边镶挂在背离维管束的维管束鞘细胞壁内，下维管束鞘内部结构规整程度差；叶绿体内淀粉粒为铁饼形状，与叶绿体方向一致；间质片层为丝状，两层膜面面向叶绿体的断面方向上，间质片层尽量沿着叶绿体外轮廓大环绕、尽量靠近背离维管束的维管束鞘细胞壁的叶绿体膜内侧，受淀粉粒影响改变方向。3、叶肉细胞最少有两种立体结构第一种、类似横王字形状，连接在表皮细胞和维管束鞘细胞之间，见附图3-1、4-2、4-3、4-4及定位图6-1、6-2、6-3 ;第二种连接在维管束鞘与相邻叶肉细胞之，横向中间结构最大、向上、向下逐渐缩�。刂乖谏�、下维管束鞘的极限 层面附近，见附图3-1、4-5、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10、4-11及定位图6。叶肉细胞的叶绿体外轮廓为厚饼形态，以大表面坐落在叶肉细胞壁内，内部淀粉粒很少，基粒叠与叶绿体方向一致，分布没有趋向。(四)通过扫描电镜二次电子图像可检验观察对象立体外轮廓结构
以玉米维管束鞘细胞中叶绿体为例，通过扫描电镜二次电子像观察玉米维管束鞘细胞内叶绿体(见附图9)两相邻、大小略有差异的维管束、分别在5和6个维管束鞘细胞部位(见附图9-1、9-4)，逐级定位放大观察其内部叶绿体以饼状为主(见附图9-5、9-6)，虽然所处维管束和维管束鞘细胞大小有差别，但叶绿体大小、形态基本一至(见照片原标尺)，本发明定位观察玉米叶片维管束鞘叶绿体外形结果与扫描电镜观察结构相吻合。实施例
设施环境中同样生长条件下，双子叶植物番茄与禾本科植物玉米对有机物质转运差异的研究
I、在微观结构方面，可通过对筛管中传输物质形态和筛管结构形态差异来研究。2、操作
第一步按技术方案①、②、③、④、⑤、⑥操作；
第二步总体按技术方案①、②、③、④、⑤、⑥操作不同点是番茄和玉米要分别观察，照相后比较。第三步在电镜下观察、照相，执行第⑤项 玉米叶片有关结构
本研究对玉米结构已经有比较深入的了解，我们选择33号载网韧皮部(见附图7-1)，对其特征结构逐级定位观察、放大照相筛板及通过筛板水滴状物质I、筛板远处水滴状外有浅色的圆形包层的物质2 (见附图7-5);筛管中的长条物质3 (见附图7-2)，放大才能观察到的晶格状结构物质4(见附图7-4);筛管与伴胞之间有大量的通路结构(见附图7-3)、对其放大可见通路为多分枝管状(见附图7-6)。番茄叶片有关结构
根据番茄叶片断面定位图见附图3-4，我们获取维管束部分切片在57-76号载网(见附图8)，我们需要找出与研究有关的所有特征点。首先，在低倍率下选完整梯形切片(见附图8-1)、观察维管束整体分布维管束有一长枝与上下底平行、位于中间，长枝中下部有一个分枝指向长边，分枝的两侧各有一个晶体球结构。我们选择短分枝以上的一段长枝作为观察对象，用维管束走向，叉间的晶体球作为辅助标记，放大观察研究。首先，选择韧皮部附近结构分界层面，细分各层面结构，不遗漏任何结构特征选择出相关结构观察照相。第64号载网，番茄导管层面结构(见附图8-2);第68号载网，靠导管侧薄壁细胞层面结构(见附图8-3);到第69、70号载网，细胞结构没有显著变化，第70号载网，进入韧皮部最上层面结构(见附图8-4);第72号载网，韧皮部中心层面结构(见附图
8-5)。我们观察到番茄叶片中与有机物质传输有关的结构筛板及筛管中第I种颗粒状物质(见附图8-7及逐级定位图见8-6、8-4);在韧皮部中心层面上见附图8-5我们定位观察筛管周围(见附图8-8)，筛管中有大量丝状物质放大(见附图8-10)、筛管与伴胞之间壁 有许多肿胀结构；我们选8-8图上层面的边丑(见附图8-9)，我们观察到筛管与伴胞之间在肿胀的壁上出现单通道。通过对照片观察分析、差异较大的结构有玉米的筛管中有四种物质结构，筛管与伴胞的通道为多分枝管状类型；番茄的筛管中有两种物质结构，筛管与伴胞间的通道、是单通道卧于肿胀壁中的类型。玉米和番茄在传输的有机物质结构上和有关传输细胞结构上有显著差异，各自有其显著特征，这些特征可以说明传输物质成分上可能存在差异。我们还可以利用电子显微镜细胞化学技术、免疫电子显微镜技术、生物大分子电子显微镜制备技术将特异蛋白质、酶、糖、无机物等物质，转变成可调整电子散射能力的重金属化合物质、可对营养成分作定性研究。
权利要求
1.在植物叶片微观结构中定位观察而对叶片进行处理的方法，其特征在于该方法包括①透射叶片样品前处理制作定位专用整体断面切片、观察照相制作横向切片；④横向切片垂直空间和组织结构定位检验横向切片、观察、照相；⑥保障整个系统的空间定位规范；⑦根据有序的定位层面构建微观立体结构；⑧扫描电镜样品制备、观察照相、检验立体结构八个部分； 在步骤①中，取相邻两块样品垂直包埋，分别作断面切片和横向切片的包埋块；作断面切片的样品块、在60°C聚合时、时间减半，刀刃沿叶片上下表面延长线的方向、作断面切片，能获取叶片完整断面结构图； 在步骤②中取断面定位专用样品包埋块，调整刀刃与断面上的双表皮延长线成为垂直方向，按厚度200nm作断面切片，每修掉样品约0. Imm厚，捞片，共取10个载网；采用常规醋酸双氧铀一梓檬酸铅双重染色；观察时增加加速高电到100万伏、光斑选I档，聚光镜光 阑选I档；选择含上、下表皮，含维管束完整结构，照相； 在步骤③中，在切片机实体显微镜下，会观察到叶片表面是凸凹形成的条状，调整刀刃运动方向与条状结构延长线方向一致；切片面会含并行的三条以上结构，用两侧条状结构上部最高凸起处对刀，使刀刃的全部行程与叶片表面整体平行；去掉上表皮表面凸起部分，约表面积的3/4区域；开始正式切片、捞片，每去掉50片，用一个有标记的载网捞取10片，每个载网作一个计数，全叶片由上至下总计数为I 一N ;调整切片机按70nm进刀量切片；在步骤④中在步骤③中获取载网的计数I 一N，在步骤②中获取的定位专用叶片整体断面图，由上至下显示叶片各层组织结构，将图在垂直方向作N等份，每份与I-N序列号的横向切片一一对应，形成玉米叶片整体结构定位图； 在步骤⑤中，作横向切片定位时，先将叶片完整断面结构图由上至下等分N份，与横向切片对应，将横向切片标注在相应的组织结构和垂直的立体空间上；针对不同植物选定检验切片方向精度的标准切片，禾本科植物标准横向切片的确定方法为MX1 MX2^ I ；MX1 :被显示出传导组织木质部或韧皮部首端的宽度；MX2: MXl所在传导组织木质部或韧皮部尾端的宽度； 在步骤⑥中，为完成最终的精准定位，在每一个步骤中含有空间定位分项操作规范，其集合保证最终结构精准定位； 在步骤⑦中，通过观察、分析可确定一些复杂的微观立体结构； 在步骤⑧中，对固定好的叶片作脱水、临界点干燥、断裂、钼金镀膜常规处理，采用扫描电镜二次电子图像，观察叶片断面及特定部位的立体结构，检验定位观察结论。
2.根据权利要求I所述的在植物叶片微观结构中定位观察而对叶片进行处理的方法，其特征在于在步骤⑥中的具体操作为 ①前处理选择相邻的两块样品，垂直包埋，可最大程度消除结构之间的误差； ②横向切片时，先去掉上表面凸出的高度，保留凹处的1/4的面积位；在对定位专用断面组织结构分区时，去掉凸出部分从表皮最低点向上1/4高开始划分； ③采用等分断面结构图与横向切片对应的方法，抵消断面切片伸缩对高度变化的影响；这种做法基准点在中心，最大限度减少了横向切片与断面切片在操作过程中出现的误差; ④采用有标记的载网获取立体空间定位和平面空间定位，采用切片面为梯形和载网上特定标记作辅助定位等方法来作切片内结构的定位； ⑤切片时采用压片捞片法，观察时确定载片面、面向电子束，定位样品朝向。
全文摘要
本发明涉及一种利用大型精密仪器——透射电子显微镜在植物叶片微观结构中定位观察而对叶片进行处理的方法。其特征在于通过新工艺制作一幅与横向切片有关联的叶片断面结构图，实现横向切片在叶片组织结构和空间结构上定位，用一套空间定位规程保障、可获取复杂微观结构叶片的全套精准定位结构图、或对某一特定部位精准定位的结构图；叶片断面结构图与横向有序定位结构图结合、还可构建微观立体结构。本发明的目的是以横向切片为基�。岢鲆恢秩碌睦猛干涞缱酉晕⒕倒鄄煲镀峁沟难反�、切片、定位、观察方法。此方法操作简单，可实现对叶片全部微观结构精准定位的研究，同时通过有序定位结构，探知真实微观立体结构。
文档编号G01N1/06GK102967497SQ201210513518
公开日2013年3月13日 申请日期2012年12月5日 优先权日2012年12月5日
发明者李天来, 陈伟之 申请人:沈阳农业大学
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
