专利名称：基于免疫磁酶的检测伏马毒素b1的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物检测工程技术领域的方法，具体是一种快速检测谷物类、谷物类相关产品、饲料中伏马毒素Bl的方法。
背景技术：
伏马毒素Bl (Fumonisin Bi, FBI)是串珠镰刀菌在一定湿度和温度条件下繁殖所产生的次级代谢产物，在全世界范围内分布广泛。1988年，Gelderblom等首次从串珠镰刀菌培养液中分离出伏马毒素。伏马毒素能够对玉米及其制品造成污染，而且在以谷物为原料的一些产品中如面条、啤酒、调味品，甚至在芦笋中也检测到了伏马毒素。据报道，伏马毒素与马脑白质软化症，猪的肺水肿症候群，大鼠肝癌等疾病有关。除上述疾病外，在南非的特兰斯凯地区和中国林县地区研究发现，食用伏马毒素污染的玉米制品与人类食道癌相关。串珠镰刀菌产生的毒素已经被国际癌症研究会(International Agency for Research on Cancer, IARC)划分到2B类一可能的人类致癌物。加入WTO之后，农产品及相关食品的国际贸易量日益增加，随之对进出口产品的生物安全性的要求也越来越高，为了保证这类产品的顺利上市和食用者的健康，出入境检疫、海关、生产企业、监督部门等部门迫切需要一种特异、快速、简便的伏马毒素检测方法。化学发光(Chemiluminescence，CL)早在19世纪80年代就得到证实，即在化学反应过程中瞬间以释放光子的形式放出能量。后发展出放射免疫分析技(Radioimmunoassay， RIA)，因其高灵敏度和高特异性而受到普遍应用。CLIA是在RIA基本理论的基础上，以标记发光剂为示踪物信号建立起来的一种非放射标记免疫分析法。近年来发展迅猛，是目前发展和推广应用最快的免疫分析方法，也是目前最先进的标记免疫测定技术，灵敏度和精确度比酶免法、荧光法高几个数量级，显著优于放射免疫分析和酶联免疫分析。化学发光酶免疫分析(Chemiluminescent Enzyme Immunoassay, CLEIA)属酶免疫分析，只是酶反应的底物是发光剂，操作步骤与酶免疫分析完全相同以酶标记生物活性物质(如酶标记的抗原或抗体)进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。在酶促化学发光免疫分析中可供标记的酶有很多，目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)。免疫磁酶技术是将IgG标记在标记有ftOtein A的磁珠上，进行酶联免疫方法的技术。其优势是利用磁珠的富集作用，检测较大体积溶液中的微量抗原。关于伏马毒素Bl毒素检测，国内外已建立了多种方法。目前检测FBl的方法主要为高效液相色谱法(HPLC)，气相色谱-质谱联用法(GC-MQ，液谱和质谱联用法(LC-MS)和 ELISA方法。然而，这些方法需要对检测样品进行严格的预处理，还需要高效液相色谱仪等贵重仪器，同时要求有专业的操作人员，不利于现场常规检测使用。已有的检测伏马毒素Bl 毒素的ELISA试剂盒，在检测灵敏度上不及本发明的化学发光ELISA方法，因此本方法对保障谷物类食品的安全具有更重要的作用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于免疫磁酶的检测伏马毒素 Bl的方法。本发明检测对象针对性强，准确率高，灵敏度较市售ELISA检测试剂盒高，并且由于本发明采用抗伏马毒素Bl单克隆抗体，与其他谷物中的真菌毒素无交叉反应，较市售的以多克隆抗体为基础的ELISA试剂盒有更强的特异性，减少了假阳性率。本发明是通过以下技术方案实现的一种基于免疫磁酶的检测伏马毒素Bl的方法，该方法包括以下步骤步骤一，将FBl半抗原与OVA偶联，得到FBl的偶联物FBl-OVA ；步骤二，将抗FBl单克隆抗体与免疫磁珠结合，得到抗体-磁珠结合物；步骤三，将所述抗体-磁珠结合物加入EP管中，使用洗涤液洗涤，将待侧样品进行萃�。玫捷腿∫海幂腿∫合∈秃蠹尤胨龉苤校鸬矗徊街杷模コ锨逡海褂孟吹右合吹樱鯫VA-FBl加入所述管中，震荡；步骤五，去除上清液，使用洗涤液洗涤，将抗FBl单克隆抗体加入所述管中，震荡；步骤六，去除上清液，使用洗涤液洗涤，将HRP标记羊抗鼠二抗加入所述管中，震荡；步骤六，去除上清液，使用洗涤液洗涤，加入发光底物，震荡，测定发光值；步骤七，根据已知不同浓度FBl与抗FBl单克隆抗体加入后得到的发光值，制作标准曲线，再根据待测样品的发光值，通过标准曲线得到对应的FBl浓度。优选地，在所述步骤一中，所述FBl半抗原与所述OVA的偶联通过活泼酯法完成。优选地，在所述步骤三中，所述洗涤液为pH为7. 4的0. OlM磷酸盐缓冲液。优选地，在所述步骤三中，所述萃取液的稀释倍数为5倍。优选地，在所述步骤三中，所述萃取的方法为取样品，按照重量体积比1 10的比例加入70%甲醇-PBS溶液，剧烈震荡15min，静置30min，将上清液通过快速定性滤纸过滤，即得萃取液。进一步优选地，所述稀释液为pH 8. 2的0. IM磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液含有体积比为 0. 01% ^ Tween-20。优选地，在所述步骤三中，所述震荡步骤为室温震荡30分钟。优选地，在所述步骤六中，所述震荡步骤为室温震荡1分钟。优选地，在所述步骤四中，所述上清液的去除使用磁力架完成。优选地，在所述步骤七中，所述标准曲线的做法为=WWAFBl浓度的对数值为横坐标，以加入不同浓度FBl所得到的不同发光值除以不加入FBl所得到的发光值为纵坐标， 通过Microsoft Excel软件，做出散点图并添加趋势线公式和R2。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果本发明是鉴于待测样品若有FBl 毒素，由于FBl和免疫磁珠上的抗FBl单克隆抗体特异性结合，而卵清蛋白(OVA)与FBl和的偶联物OVA-FBl加入反应体系中后，可以和未被FBl结合的单克隆抗体结合。再次加入抗FBl单克隆抗体后，抗体可以和OVA-FBl结合。而且在加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠二抗后，HRP再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。由于待测样品中含有的FBl的量与发光检测结果有线性关系，因此可以通过标准曲线算出待测样品中含有的FBl的量。本发明检测对象针对性强，准确率高，灵敏度较市售ELISA检测试剂盒高。并且由于本发明采用抗伏马毒素Bl单克隆抗体，与其他谷物中的真菌毒素无交叉反应，较市售的以多克隆抗体为基础的ELISA试剂盒有更强的特异性，减少了假阳性率。
图1为本发明实施例原理的示意图；图2为本发明实施例检测的示意图。
具体实施例方式下面结合附图对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下面实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例步骤一，伏马毒素Bl完全抗原(OVA-FBl)的制备将2.5mg卵清白蛋白(OVA)溶于0. Iml 0. OlM的PB缓冲液中，加入10 μ 150% (V/ V)戊二醛(GA)，室温搅拌过夜。4°C条件下用PBS透析过夜，除去多余GA。0. 5mg FBI溶于 0.2ml 25% (V/V)乙醇，将其加入到激活的OVA透析物(约0. 15ml)中，加入0. ImllM碳酸缓冲液(pH 9.5)，4°C搅拌过夜。加入0.05ml IM赖氨酸(pH 7)，4°〇反应池。最后用PBS 透析72h，2次换液，-20°C保存。步骤二，抗FBl单克隆抗体与免疫磁珠结合取免疫磁珠50μ1，使用洗涤液(0.01M磷酸盐缓冲液，pH 7. 4)洗涤3次后， 加入含5yg抗FBl单克隆抗体的结合缓冲液(0. IM磷酸缓冲液，pH 8. 2，含0. 01 % Tween-20)200y 1，室温震荡反应30分钟。再使用洗涤缓冲液洗涤3次，最后加入结合缓冲液，_4°C保存。步骤三，化学发光ELISA检测待测样品萃取液(1)将抗体-磁珠结合物稀释至一定浓度后取50 μ 1加入EP管中，使用洗涤液洗涤3次。取0. 3g样品，加入:3ml 70%甲醇-PBS溶液，剧烈震荡15min，静置30min。上清液通过快速定性滤纸过滤，使用结合缓冲液(0. IM磷酸缓冲液，pH 8. 2，含0. 01% Tween-20) 稀释5倍后，取Iml加入含有抗体-磁珠的管中，室温震荡反应30分钟，其中在标准曲线孔中依次加入10、5、1、0· 5,0. 1,0. 0U0ng/ml的FBI纯品1ml，并做3次重复；在待测孔中加制备的待测样品萃取液1ml，并做3次重复，空白孔中不加入抗体-磁珠结合物，如图2所示。(2)使用磁力架将溶液上清去除，使用洗涤液洗涤3次后，将OVA-FBl使用结合缓冲液稀释至一定浓度后，取200 μ 1加入EP管中，室温震荡反应30分钟。(3)使用磁力架将溶液上清去除，使用洗涤液洗涤3次后，将抗FBl单克隆抗体使用结合缓冲液稀释至一定浓度后，取200ul加入EP管中，室温震荡反应30分钟。(4)使用磁力架将溶液上清去除，使用洗涤液洗涤3次后，将HRP标记羊抗鼠二抗使用结合缓冲液稀释至一定浓度后，取200 μ 1加入EP管中，室温震荡反应30分钟。(5)使用磁力架将溶液上清去除，使用洗涤液洗涤后加入发光底物(鲁米诺+对
5碘酚)200 μ 1，室温震荡反应1分钟后吸出，加入96孔板中，用发光信号测定仪进行发光测定，得到结果。如图1所示，磁珠1与ftOtein A 2结合，抗FBl单克隆抗体3分别与ftx)tein A2 和0VA-FB14结合，抗FBl单克隆抗体5分别与0VA-FB14和HRP标记的羊抗鼠二抗6结合。步骤四，检测FBl的标准曲线的制作与结果判定(1)根据已知不同浓度FBl与抗FBl单克隆抗体加入后，得到的发光值，绘制标准曲线，具体做法为=WWAFBl浓度的对数值为横坐标，以加入不同浓度FBl所得到的不同发光值的平均数，除以不加入FBl (空白)所得到的发光值为纵坐标，通过Microsoft Excel 软件，绘制散点图并添加趋势线公式和R2 ；(2)根据待测样品的发光值的平均值，通过标准曲线所得到的趋势线公式计算，得到对应的FBl浓度。
权利要求
1.一种基于免疫磁酶检测伏马毒素Bl的方法，其特征在于，包括以下步骤 步骤一，将FBl半抗原与OVA偶联，得到FBl的偶联物FBl-OVA ；步骤二，将抗FBl单克隆抗体与免疫磁珠结合，得到抗体-磁珠结合物； 步骤三，将所述抗体-磁珠结合物加入EP管中，使用洗涤液洗涤，将待侧样品进行萃�。玫捷腿∫海幂腿∫合∈秃蠹尤胨龉苤校鸬矗徊街杷模コ锨逡海褂孟吹右合吹樱鯫VA-FBl加入所述管中，震荡； 步骤五，去除上清液，使用洗涤液洗涤，将抗FBl单克隆抗体加入所述管中，震荡； 步骤六，去除上清液，使用洗涤液洗涤，将HRP标记羊抗鼠二抗加入所述管中，震荡； 步骤六，去除上清液，使用洗涤液洗涤，加入发光底物，震荡，测定发光值； 步骤七，根据已知不同浓度FBl与抗FBl单克隆抗体加入后得到的发光值，制作标准曲线，再根据待测样品的发光值，通过标准曲线得到对应的FBl浓度。
2.如权利要求1所述的检测伏马毒素Bl的方法，其特征在于，在所述步骤一中，所述 FBl半抗原与所述OVA的偶联通过活泼酯法完成。
3.如权利要求1所述的检测伏马毒素Bl的方法，其特征在于，在所述步骤三中，所述洗涤液为pH为7. 4的0. OlM磷酸盐缓冲液。
4.如权利要求1所述的检测伏马毒素Bl的方法，其特征在于，在所述步骤三中，所述萃取液的稀释倍数为5倍。
5.如权利要求1所述的检测伏马毒素Bl的方法，其特征在于，在所述步骤三中，所述萃取的方法为取样品，按照重量体积比1 10的比例加入70%甲醇-PBS溶液，剧烈震荡 15min，静置30min，将上清液通过快速定性滤纸过滤，即得萃取液。
6.如权利要求5所述的检测伏马毒素Bl的方法，其特征在于，其特征在于，所述稀释液为pH 8. 2的0. IM磷酸缓冲液，所述磷酸缓冲液含有体积比为0. 01%的Tween-20。
7.如权利要求1所述的检测伏马毒素Bl的方法，其特征在于，在所述步骤三中，所述震荡步骤为室温震荡30分钟。
8.如权利要求1所述的检测伏马毒素Bl的方法，其特征在于，在所述步骤六中，所述震荡步骤为室温震荡1分钟。
9.如权利要求1所述的检测伏马毒素Bl的方法，其特征在于，在所述步骤四中，所述上清液的去除使用磁力架完成。
10.如权利要求1至9任一项所述的检测伏马毒素Bl的方法，其特征在于，在所述步骤七中，所述标准曲线的做法为=WWAFBl浓度的对数值为横坐标，以加入不同浓度FBl所得到的不同发光值除以不加入FBl所得到的发光值为纵坐标，通过Microsoft Excel软件， 做出散点图并添加趋势线公式和R2。
全文摘要
本发明涉及一种检测伏马毒素B1的方法，包括以下步骤将FB1半抗原与OVA偶联，得到偶联物FB1-OVA；将抗FB1单克隆抗体与免疫磁珠结合；将抗体-磁珠结合物加入EP管中，洗涤，将待侧样品的萃取液加入上述管中，震荡；去除上清液，洗涤，将OVA-FB1加入上述管中，震荡；去除上清液，洗涤，将抗FB1单克隆抗体加入上述管中，震荡；去除上清液，洗涤，将HRP标记羊抗鼠二抗加入上述管中，震荡；去除上清液，洗涤，加入发光底物，震荡，测定发光值；制作标准曲线，再根据待测样品的发光值，通过标准曲线得到对应的FB1浓度。本发明采用抗FB1单克隆抗体，与其他谷物中的真菌毒素无交叉反应，特异性强，减少了假阳性率。
文档编号G01N33/577GK102539772SQ20121000240
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月6日 优先权日2012年1月6日
发明者严亚贤, 孙建和, 王元凯 申请人:上海交通大学
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