专利名称：一种用于汞离子快速检测的纳米生物传感器方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物检测技术领域，涉及利用汞离子特异性寡核苷酸探针和纳米金构建一种快速比色检测水中汞离子的纳米生物传感器方法及其试剂盒。
背景技术：
汞离子的检测长期以来一直受到研究人员的高度关注。自工业革命起，汞被运用到生产生活中，环境里的汞含量日益增长，汞污染范围也逐年扩大。据统计，汞在全球水体中的含量比数年前已增加了三倍左右，工业区附近汞的含量则更高。由于汞污染具有高迁移性和持久性，可通过甲基化、生物富集以及食物链放大作用，会对环境以及人类健康造成极大的�：�。传统的汞离子检测方法包括原子吸收光谱、质谱法等，往往需要大型仪器，成本昂贵，操作复杂耗时，且需要熟练人员操作。近年来，国内外已发展了许多汞离子检测方法，其中利用汞离子可使胸腺嘧啶(Thymine，T)之间形成特异的错配结合(T-Hg2+-T)这一特性构建的一系列纳米金方法尤为突出。纳米金是指颗粒尺寸为纳米数量级的金微小颗粒，通常在水溶液中以胶体的形态存在，故又称胶体金。纳米金的最大吸收波长与纳米金的粒径和彼此间距离相关，纳米金粒径从小到大的变化过程中，其颜色由红色变为蓝色；同样地，纳米金的聚集会使吸收峰产生明显的红移而变为蓝色。此外，单链DNA能够以很高的亲和性自发吸附到未加修饰的带负电荷的纳米金颗粒上，而双链DNA的吸附则较弱。因此，在一定浓度的盐离子条件下，有单链DNA吸附的纳米金在单链DNA的保护下较为稳定，在盐溶液中保持良好的分散性而仍然呈红色，而双链DNA溶液中的纳米金粒子会因为聚集而呈现由红变紫的颜色变化。利用DNA-纳米金这种距离-颜色效应的光学性质，研究者们发展了很多基于纳米金的聚集、分散状态变化的Hg2+检测方法。2007 年初，Mirkin 课题组(Angewandte Chemie 2007，119，(22)，4171-4174)设计了两段寡核苷酸探针，序列分别为5’HS-C1Q-A1(I-T-A1(I3’和5’HS-C1Q-T1(I-T-T1(I3’。而当溶液中有Hg2+存在时，T-T错配之间因Hg2+而形成特异的键合，使得两探针之间的Tm值明显升高，从而定量分析Hg2+。但该方法需要严格的温度控制，不易于推广使用。Xuejia Xue等人 (Angewandte Chemie 2007,119, (22) ,4171-4174)通过改良组装到纳米金表面的寡核苷酸探针，并引入了第三段序列linker DNA,使linker DNA能与两个探针序列同时杂交。该检测方法在室温下即可进行，但需要三条寡核苷酸探针，其中两条仍需要经过巯基修饰，繁琐耗时且价格昂贵。Lihua Wang等(Gold Bulletin 2008，41，(I)，37-41)报道利用一条聚 T寡核苷酸探针，通过Hg2+特异性稳定T-T错配形成茎环结构，使与聚T寡核苷酸探针结合的纳米金失去保护而在高盐条件下聚集，并产生红色-蓝色的颜色变化，实现对Hg2+的快速便捷分析，但灵敏度有待提闻。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有的汞离子检测方法存在的不足，提供一种利
3用优化的汞离子特异性寡核苷酸探针和纳米金快速比色检测水中汞离子的纳米生物传感器方法及其试剂盒。本发明的第一个目的是公开一种新型的纳米生物传感器，以及利用此传感技术进行快速检测汞离子的方法。这种新方法可包括以下步骤(I)将待检测水溶液和汞离子寡核苷酸探针混合，室温反应；(2)将纳米金加入到上述溶液中，室温反应；(3)最后加入NaNO3,观察颜色变化，并进行可见光光谱检测。本发明的第二个目的是提供一种基于纳米生物传感器的汞离子快速检测试剂盒， 它含有(I)纳米金,其粒径约15nm,浓度约为2. 97nmol/L ；(2)两种汞离子寡核苷酸探针,最适浓度都为ΙΟμπιοΙ/L ；(3) NaNO3 溶液，最适浓度为 O. 5mol/L ；(4)阳性对照溶液和阴性对照溶液；(5)说明书。试剂盒中的纳米金、汞离子寡核苷酸探针和NaNO3溶液等可以是浓缩液。我们对已有汞离子寡核苷酸探针的进行了优化设计，去除非特异的环部分(4bp)， 截取两端的茎部分(9bp)，经试验成功获得信噪比更高的汞离子特异性核苷酸探针。原因可能是单链DNA吸附于纳米金的效率与序列的长度有关，即短序列比长序列吸附效率更高， 从而能使纳米金在高盐条件下更稳定，这与Huixiang Li等人报道一致。我们在此基础上成功构建了一种可以快速比色检测Hg2+的纳米生物传感器。该纳米生物传感器通过两条截短MSO吸附的纳米金颜色变化和A65tlA522的改变实现对Hg2+的初步检测。相对于现有技术，本发明提供的条两截短的汞离子特异性核苷酸探针(9bp)，寡核苷酸探针序列更短、无需标记；纳米生物传感器方法和试剂盒在不使用任何特殊仪器条件下就可以实现对Hg2+可视化便捷分析，操作简便，检测时间短，灵敏度较高，特异性强，对很多非特异性金属离子的响应都非常�。乇鹗屎弦巴庀殖〈笈垦炯觳狻�
下面结合附图对本发明做进一步说明。图IMSO优化设计图2NaN03浓度优化图3A65(i/A522值随时间变化曲线图4Hg2+检测灵敏度分析图5Hg2+检测特异性评价图6汞离子纳米生物传感器的TEM图(注a图为阴性对照(X 100000) ；b图为阳性对照(X 100000)。图7比色检测混合溶液图8比色检测河水模拟标本
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。以下是部分本发明实施例中所用的仪器和设备，其他未注明的实验条件按照常规或以其制造厂商所建议的条件Varioskan Flash多功能读数仪(美国Thermo Scientific 公司)；透射电子显微镜H-7500(日本日立株式会)；加热磁力搅拌器DF-IOlS(巩义予华仪器责任有限公司)；紫外-可见光光谱分光光度计U-3010 (日本日立株式会)；5417R小型台式高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司);PURELAB Classic超纯水仪(英国ELGA Labffater 公司)。实施例IMSO优化设计本研究选用的MSO序列见表1，其中MSO1为Lihua Wang等人报道的汞离子特异性寡核苷酸探针(茎环结构)。为了能够提高汞离子检测的灵敏度，并降低DNA的合成成本， 对MSO1进行优化设计，去除非特异的环部分(4bp)，截取两端的茎部分(9bp)，分别标记为 MSO2 和 MSO3。表I汞离子特异性寡核苷酸
权利要求
1.一种特异性检测汞离子的纳米生物传感方器法，其特征在于，依次包括以下步骤(1)将待检测水溶液和汞离子寡核苷酸探针混合,室温反应；(2)将纳米金加入到上述溶液中，室温反应；(3)最后加入NaNO3,观察颜色变化，并进行可见光光谱检测。
2.根据权利要求I所述的特异性检测汞离子的纳米生物传感方器法，其特征在于，将汞离子寡核苷酸探针通过范德华力吸附到纳米金表面，实现纳米生物传感器的组装。如果溶液中不存在汞离子，在高盐条件下，MSO可以稳定溶液中的纳米金而不会发生聚集；如果溶液中存在汞离子，MSO与汞离子特异性结合所形成的稳定的T-Hg2+-T配位化合物(类似双链的结构)，从而因静电斥力不能吸附到纳米金颗粒表面，导致纳米金颗粒相互聚集，表面等离子吸收峰发生红移，通过颜色变化和A65cZA522改变即可定性或定量检测溶液中的汞离子。
3.根据权利要求I所述的特异性检测汞离子的纳米生物传感方器法，其特征在于，步骤(I)所述的汞离子寡核苷酸探针碱基组成为5’ -TTCTTTCTT-3’和5’ -TTGTTTGTT-3’，室温反应时间为5分钟。
4.根据权利要求I所述的特异性检测汞离子的纳米生物传感方器法，其特征在于，步骤(2)所述纳米金的粒径为15 20nm，室温反应时间为5分钟。
5.根据权利要求I所述的特异性检测汞离子的纳米生物传感方器法，其特征在于，步骤⑵所述纳米金溶液配制方法将IOOmL的O. 01%的氯金酸水溶液加热至剧烈沸腾后， 剧烈搅拌下快速加入3. 5mL的I %柠檬酸三钠溶液，继续加热搅拌20min后，停止加热，继续搅拌30min后静置,室温自然冷却,用O. 22 μ m滤膜过滤。
6.根据权利要求I所述的特异性检测汞离子的纳米生物传感方器法，其特征在于，步骤(3)所述NaNO3的浓度为的O. 5mol/L。
7.根据权利要求I所述的特异性检测汞离子的纳米生物传感方器法，其特征在于，步骤(3)所述NaNO3加入后的最佳反应为15分钟。
8.根据权利要求2所述的定性检测溶液中的汞离子的判断方法，其特征在于，加入 NaNO3后纳米金颜色由红色转变为紫色或蓝色，提示待测溶液中含有汞离子。
9.一种纳米生物传感器试剂盒，其特征在于，适用于环境水中汞离子的快速检测，含有(1)纳米金，其粒径约15nm,浓度约为2.97nmol/L ；(2)两种汞离子寡核苷酸探针,最适浓度都为lOymol/L;(3)NaNO3溶液，最适浓度为O. 5mol/L ；(4)阳性对照溶液和阴性对照溶液。
全文摘要
本发明涉及一种能快速比色检测水中Hg2+的纳米生物传感器，该传感器基于汞离子特异性寡核苷酸探针和纳米金，对汞离子特异性核苷酸探针进行优化设计，并吸附到纳米金颗粒表面，实现生物传感器的组装；利用汞离子特异性稳定T-T错配和纳米金颗粒在高盐条件下的颜色变化，从而实现对Hg2+的定量分析。该纳米生物传感器不需要标记探针或者修饰纳米金，在不使用任何特殊条件下就可以实现对汞离子可视化便捷分析，具有操作简便、检测时间短、灵敏度较高、特异性强等优点，易于推广使用。
文档编号G01N21/31GK102608108SQ20121005263
公开日2012年7月25日 申请日期2012年2月21日 优先权日2012年2月21日
发明者吕建新, 吴文鹤 申请人:温州医学院
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