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专利名称：一种检测苯乙醇胺a的酶联免疫试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及酶联免疫和兽药残留检测分析技术领域中的一种检测苯乙醇胺A的酶联免疫试剂盒。
背景技术：
在现代养殖业中，不法分子为了增加动物的瘦肉量、减少饲料使用以及降低成本，违禁使用克仑特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇等3 -受体兴奋剂物质。随着这类违禁药物成为政府监察打击的重点对象，个别不法分子选择了替代品，其中苯乙醇胺A是2011年最新发现的添加在饲料中的P -受体兴奋剂物质。苯乙醇胺A又称“克伦巴胺”，是一种人工合成的化学物质，分子式为C19H24N2O4，化学结构式为2-[4-(4-硝基苯基)丁基-2-氨基]-I-甲氧基苯乙醇，是福莫特罗的同分异构体。它具有同克仑特罗和莱克多巴胺相同的作用和效 果，有营养再分配作用。我国政府为加强饲料及养殖环节质量安全监管，保障饲料及畜产品质量安全，在2010年12月农业部第1519号公告中明确禁止了苯乙醇胺A在饲料和动物饮水中的使用。目前研究苯乙醇胺A检测方法的资料较少，其中包括2010年11月农业部第1486号公告一 1-2010《饲料中苯乙醇胺A的测定高效液相色谱-串联质谱法》的检测方法标准，也有检测猪肌肉组织中苯乙醇胺A残留液相色谱-串联质谱检测方法的报道。由于液相色谱-串联质谱仪器价格昂贵，操作复杂，对检验人员的要求高，不太适合大量样品的快速筛选。因此建立一种准确可靠又快速简便的检测苯乙醇胺A的方法非常必要。

发明内容
本发明的目的是提供一种检测苯乙醇胺A的酶联免疫试剂盒。本发明所提供的检测苯乙醇胺A的酶联免疫试剂盒，含有独立包装的苯乙醇胺A的特异性抗体；所述苯乙醇胺A的特异性抗体为以苯乙醇胺A与载体蛋白的偶联物为免疫原得到的多克隆抗体或单克隆抗体。所述多克隆抗体可为兔源抗体，也可为鼠源、马源、羊源、猪源或豚鼠源抗体。所述单克隆抗体可为鼠单克隆抗体，具体可为单克隆小鼠骨髓杂交瘤细胞株苯乙醇胺A-2C CGMCC No. 5799分泌产生的单克隆抗体。所述单克隆小鼠骨髓杂交瘤细胞株及由其产生的苯乙醇胺A单克隆抗体也属于本发明保护的范围，所述单克隆小鼠骨髓杂交瘤细胞株的细胞株号为苯乙醇胺A-2C，已于2012年2月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJi址中国北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏号为CGMCC No. 5799。所述载体蛋白可为人血清白蛋白(HSA)，也可为牛血清白蛋白(BSA)、兔血清白蛋白(RSA)、甲状腺球蛋白(TG)、卵清蛋白(OVA)或血兰蛋白(KLH)等常用载体蛋白。所述苯乙醇胺A与载体蛋白的偶联物具体可为苯乙醇胺A与人血清白蛋白通过重氮法进行偶联得到的苯乙醇胺A和人血清白蛋白的偶联物；所述苯乙醇胺A和人血清白蛋白的偶联物的偶联比为15 I。上述苯乙醇胺A和人血清白蛋白的偶联物具体可按照包括如下步骤的方法制备将苯乙醇胺A、HCl和锌按照30 73 10的质量比进行还原反应获得氨基苯乙醇胺A溶液，再向所述氨基苯乙醇胺A溶液按照每30mg初始苯乙醇胺A加20mg亚硝酸钠和200mg人血清白蛋白的量进行重氮偶联反应获得所述苯乙醇胺A和人血清白蛋白偶联物。为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒中还可含有独立包装的酶标苯乙醇胺A，所述酶标苯乙醇胺A所使用的标记酶可为辣根过氧化物酶，也可为碱性磷酸酯酶，所述辣根过氧化物酶可通过EDC法或高碘酸钠法与苯乙醇胺A交联。所述试剂盒还可含有独立包装的A、B、C、D、E、F试剂液，H试剂液、I试剂液、J试剂液和K试剂液；所述A、B、C、D、E、F试剂液为苯乙醇胺A系列浓度标准溶液，其溶剂为PBS缓冲液，溶质为苯乙醇胺A，溶质的浓度分别为0、0. 05,0. 15,0. 45、I. 35,4. 05 u g/L ;所述？85缓冲液的溶剂为水，溶质为磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和氯化钠，所述磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和氯化钠在所述PBS缓冲液中的浓度为0. 01M、0. OlM和0. 1M，所述PBS缓冲液的pH值为7. 2 ；所述H试剂液为含0. 5%吐温20的磷酸盐缓冲液，具体可为如下溶液溶剂为PBS缓冲液，溶质为吐温20，所述吐温在所述H试剂液中的质量百分含量为0. 5% ；所述I试剂液为四甲基联苯胺溶液，具体可为如下溶液溶剂为水，溶质为四甲基联苯胺，所述四甲基联苯胺在所述I试剂液中的浓度可为0. 1-lmg/ml ；所述J试剂液为柠檬酸缓冲液，具体可为如下溶液溶剂为水，溶质为磷酸氢二钠和柠檬酸，所述磷酸氢二钠和柠檬酸在所述J试剂液中的浓度分别为0. 2M，所述J试剂液的pH值为5.0 ；所述K试剂液为终止液，具体可为l-2mol/L硫酸或盐酸溶液，如lmol/L硫酸溶液；所述PBS缓冲液的溶剂为水，溶质为磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和氯化钠，所述磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和氯化钠在所述PBS缓冲液中的浓度为0. 01M、0. OlM和0. 1M，所述PBS缓冲液的PH值为7.2。可作为固定所述苯乙醇胺A特异性抗体的载体的物质很多，如聚苯乙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等。该载体的形式可以是试管、微量反应板凹孔、小珠、小圆片等。本发明的检测原理为将苯乙醇胺A抗体作为包被原吸附于固相载体上，加入样品和所述酶标苯乙醇胺A，待测样品中残留的苯乙醇胺A和所述酶标苯乙醇胺A竞争固相载体上包被的苯乙醇胺A特异性抗体，显色后终止，测定样品吸光值，该值与样品中苯乙醇胺A残留物含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出苯乙醇胺A的含量。同时根据酶标板上的样品颜色的深浅，与系列浓度的苯乙醇胺A标准溶液颜色的比较可判断样品的浓度范围。本发明的检测苯乙醇胺A的酶联免疫试剂盒为单残留检测试剂盒；主要采用ELISA竞争方法定性或定量检测动物尿液、血清、组织(肌肉、肝脏及肾脏)及饲料等样品中苯乙醇胺A药物的残留量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，动物尿液和血清可直接测定，组织样品和饲料经样品液抽提后即可上样，可同时快速检测大批样品；测定方法简单省时，样品在I小时之内可得出测定结果；猪尿中的最低检测限为0. g/L，具有高特异性、高灵敏度、高精确度、高准确度等特点，可在动物性产品苯乙醇胺A残留检测中发挥重要作用。保藏说明细胞株名称小鼠骨髓杂交瘤细胞细胞株编号苯乙醇胺A-2C保藏机构中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称CGMCC地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号 保藏日期2012年2月28日保藏中心登记入册编号CGMCC No. 5799


图I为鉴定苯乙醇胺A和人血清白蛋白偶联物的紫外光谱图。其中，PEA为苯乙醇胺A，HSA为人血清白蛋白，PEA-HSA为苯乙醇胺A和人血清白蛋白的偶联物。图2为试剂盒I的标准曲线。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。PBS缓冲液溶剂为水，溶质为磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和氯化钠，各溶质的浓度为 0. 01M、0. OlM 和 0. 1M, pH 值为 7. 2。实施例I、检测苯乙醇胺A药物的酶联免疫试剂盒的制备一、抗原及抗体的制备I、免疫(抗)原的合成将苯乙醇胺A (简称PEA，杭州迪恩科技有限公司)和人血清白蛋白(简称HSA，Sigma, A-1653)采用重氮法进行偶联得到苯乙醇胺A和人血清白蛋白偶联物(简称PEA-HSA )，作为免疫(抗)原。具体操作如下取30mg苯乙醇胺A加水溶解，依次加入2mL盐酸(HCl的浓度为lmol/L)和IOmg锌粉，缓慢搅拌1_5小时进行还原反应，获得氨基苯乙醇胺A溶液。在氨基苯乙醇胺A溶液中，加20mg亚硝酸钠，再加200mg人血清白蛋白，混匀，在2-8 V搅拌1-2小时进行重氮偶联反应，然后在PBS缓冲液中透析，得到苯乙醇胺A和人血清白蛋白偶联物的溶液，_20°C保存备用。上述苯乙醇胺A和人血清白蛋白偶联物的鉴定方法及结果如下将上述苯乙醇胺A和人血清白蛋白偶联物溶液用PBS缓冲液稀释至lmg/mL，作为溶液甲；将含lmg/mL苯乙醇胺A的PBS缓冲液作为溶液乙；将含lmg/mL人血清白蛋白的PBS缓冲液作为溶液丙。分别将溶液甲、溶液乙和溶液丙进行紫外(250-400nm)光谱扫描，结果如图I所示。与溶液丙相比溶液甲的紫外图谱发生了明显变化，说明苯乙醇胺A与人血清白蛋白成功偶联。溶液甲乙丙均在278nm处有最大吸收值,而在波长为305nm处溶液乙有明显吸收值且溶液丙的吸收值降为0，因此选择305nm波长测定偶联比。根据公式K=A/CL(A为305nm吸收波长值下的吸光度，C为溶液浓度，L为液层的厚度)计算各个化合物的消光系数(K)。根据已经计算出的该化合物的消光系数反向计算该化合物在溶液甲中的浓度，用浓度值除以分子量得到该化合物的摩尔浓度，计算偶联比，苯乙醇胺A和人血清白蛋白的偶联比为15 1，即15个苯乙醇胺A分子结合I个人血清白蛋白分子。
2、苯乙醇胺A兔多克隆抗体的制备采用新西兰大耳兔作为免疫动物，以步骤I中合成的苯乙醇胺A和人血清白蛋白偶联物为免疫原，首次免疫用乳液按照如下方法配制2mg/mL的免疫原水溶液2mL加2mL完全福氏佐剂乳化；带佐剂的加强免疫用乳液按照如下方法配制2mg/mL的免疫抗原水溶液2mL加2mL不完全福氏佐剂乳化。首次免疫采用背部皮下多点注射以及后脚掌趾间注射，剂量为Img/只；加强免疫采用大腿肌肉注射，剂量为0. 5mg/只，每次免疫间隔2周，共加强免疫5-10次，最后一次不加免疫佐剂直接肌肉注射，7天后采血检测，采用间接竞争ELISA法测定血清抗体效价达I : 5000且对苯乙醇胺A有明显抑制后，颈动脉放血，提取血清，经硫酸铵分级沉淀得到纯化的苯乙醇胺A兔多克隆抗体。3、苯乙醇胺A鼠单克隆抗体的制备采用BALB/C小鼠(北京实验动物中心提供)作为免疫动物，以步骤I中合成的苯乙醇胺A和人血清白蛋白偶联物为免疫原，剂量为50ii g/只(体积为0. lmL，溶剂为水)免疫原加0. ImL完全福氏佐剂乳化，进行首次皮下多点注射免疫。一月后，取同样量免疫抗原加不完全福氏佐剂乳化，进行加强免疫，再过一月后，取免疫抗原不加佐剂腹腔注射进行加强免疫，5天之后采血，间接竞争ELISA法测定血清抗体效价达I : 5000且对苯乙醇胺A有明显抑制后，取其脾细胞按4 I比例与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合。采用有限稀释或软琼脂平板法筛选杂交瘤细胞，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆小鼠骨髓杂交瘤细胞株，命名为苯乙醇胺A-2C，该小鼠骨髓杂交瘤细胞株已于2012年2月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，邮编100101)，保藏号为CGMCC No. 5799。细胞冻存和复苏取处于对数生长期的单克隆小鼠骨髓杂交瘤细胞株苯乙醇胺A-2C CGMCC No. 5799，用冻存液制成I X 106_5 X IO6个/mL的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37°C水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。定期检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性。单克隆抗体的制备与纯化采用体内诱生法，将BALB/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油0. 5ml/只，7-14天后腹腔注射单克隆杂交瘤细胞株苯乙醇胺A-2C CGMCCNo. 5799细胞5X IO5-IO6个/只，7-10天后采集腹水。经辛酸一硫酸铵沉淀法进行腹水纯化，小瓶分装，-20°C保存。4、酶标抗原的制备用高碘酸钠法合成辣根过氧化物酶-氨基苯乙醇胺A标记物。二、检测苯乙醇胺A药物的酶联免疫试剂盒I、检测苯乙醇胺A药物的酶联免疫试剂盒的结构
该试剂盒主要由盒体，酶标板,苯乙醇胺A的特异性抗体(苯乙醇胺A兔多克隆抗体或苯乙醇胺A鼠单克隆抗体)，A试剂瓶(标准溶液I)，B试剂瓶(标准溶液2 )，C试剂瓶(标准溶液3)，D试剂瓶(标准溶液4)，E试剂瓶(标准溶液5)，F试剂瓶(标准溶液6)，G试剂瓶(酶标抗原)，H试剂瓶(含吐温-20磷酸盐缓冲液)，I试剂瓶(四甲基联苯胺溶液)，J试剂瓶(柠檬酸缓冲液)，K试剂瓶(终止液)，盖板膜，托架所组成。托架内装有上述A，B，C，D，E，F，G，H试剂瓶。泡沫托架，酶标板，I试剂瓶(含吐温20磷酸盐缓冲液)，J试剂瓶(柠檬酸缓冲液)，K试剂瓶(终止液)和盖板膜均安装在盒体内。酶标板由塑料支架和各自分开的带孔的塑料条组成。
2、所用试剂的配制A，B，C，D，E，F试剂液为苯乙醇胺A系列浓度标准溶液，其浓度分别为0、0. 05、0. 15,0. 45、I. 35,4. 05y g/L，溶剂为 PBS 缓冲液。H试剂液溶剂为PBS缓冲液，溶质为吐温20，吐温20在H试剂液中的质量百分含量为0. 5%。I试剂液溶剂为水，溶质为四甲基联苯胺，四甲基联苯胺在I试剂液中的浓度为
0.1-lmg/ml。J试剂液溶剂为水，溶质为磷酸氢二钠和柠檬酸，所述溶质磷酸氢二钠和柠檬酸在J试剂液中的浓度分别为0. 2M，pH值为5. O。K试剂液lmol/L硫酸溶液。3、酶标板的制备用包被缓冲液(0. 05M碳酸盐缓冲液，pH9. 6)将步骤一中2和3制备的苯乙醇胺A兔多克隆抗体或苯乙醇胺A鼠单克隆抗体稀释成0. Iy g/ml，每孔加入150iU，37°C温育2h，4°C过夜，倾去包被缓冲液，用10倍稀释的H试剂液洗涤3次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入含5%脱脂牛奶的0. OlM磷酸盐缓冲液250iU，37°C温育l_2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存，获得试剂盒I (以苯乙醇胺A兔多克隆抗体为一抗)和试剂盒II (以苯乙醇胺A鼠单克隆抗体为一抗)。实施例2、试剂盒灵敏度、特异性、精密度和准确度试验一、样品的前处理及检测方法I、尿样的前处理取新鲜或冻融的尿样，5000g离心5min后，取上清作为供试样品。2、检测方法检测前将实施例I的试剂盒恢复至室温(18°C -30°C)，将H试剂液加水配制成洗液(0. 05%吐温20的磷酸盐缓冲液)，用G试剂液与洗液配制酶标抗原溶液(0. lmg/L,当G试剂液的蛋白浓度为0. lmg/L时，不需用洗液稀释)。在实施例I步骤二的3中制备的酶标板中每孔中加入50 u I样品溶液或苯乙醇胺A系列浓度标准溶液，再加入100 ill酶标抗原溶液，覆上盖板膜于18°C -30°C放置30min，用洗液洗酶标板3次,用吸水纸拍干,用I试剂液与J试剂液配制酶底物混合液(0. lmg/ml,当I试剂液为0. lmg/ml四甲基联苯胺溶液时，I试剂液不需用J试剂液稀释)，取100 ill加入酶标板小孔后混匀，避光显色约15min，最后每孔加入K终止液100 u 1，用酶标仪测定450nm处吸光值(A45tl值)。按下式计算百分吸光度值
权利要求
1.一种检测或辅助检测苯乙醇胺A的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述试剂盒中含有独立包装的苯乙醇胺A的特异性抗体；所述苯乙醇胺A的特异性抗体为以苯乙醇胺A与载体蛋白的偶联物为免疫原得到的多克隆抗体或单克隆抗体。
2.根据权利要求I所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述多克隆抗体为兔源抗体。
3.根据权利要求I所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述单克隆抗体为鼠单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述单克隆抗体为单克隆小鼠骨髓杂交瘤细胞株苯乙醇胺A-2C CGMCC No. 5799分泌的单克隆抗体。
5.根据权利要求1-4中任一所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述载体蛋白为人血清白蛋白。
6.根据权利要求1-5中任一所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述试剂盒还含有独立包装的酶标苯乙醇胺A。
7.根据权利要求6所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述酶标苯乙醇胺A所使用的标记酶为辣根过氧化物酶。
8.根据权利要求1-7中任一所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述试剂盒还含有独立包装的A、B、C、D、E、F试剂液，H试剂液、I试剂液、J试剂液和K试剂液； 所述A、B、C、D、E、F试剂液为苯乙醇胺A系列浓度标准溶液，其溶剂为PBS缓冲液，溶质为苯乙醇胺A，溶质的浓度分别为0、0. 05,0. 15,0. 45、I. 35,4. 05 μ g/L ； 所述H试剂液的溶剂为PBS缓冲液，溶质为吐温20，所述吐温在所述H试剂液中的质量百分含量为O. 5% ; 所述I试剂液的溶剂为水，溶质为四甲基联苯胺，所述四甲基联苯胺在所述I试剂液中的浓度为O. 1-lmg/ml ； 所述J试剂液的溶剂为水，溶质为磷酸氢二钠和柠檬酸，所述溶质磷酸氢二钠和柠檬酸在所述J试剂液中的浓度均为O. 2M,所述J试剂液的pH值为5. O ; 所述K试剂液为l-2mol/L硫酸或盐酸溶液； 所述PBS缓冲液的溶剂为水，溶质为磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和氯化钠，所述磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和氯化钠在所述PBS缓冲液中的浓度为O. 01M、0. OlM和O. 1M，所述PBS缓冲液的PH值为7.2。
9.产生苯乙醇胺A单克隆抗体的小鼠骨髓杂交瘤细胞株，其细胞株号为苯乙醇胺A-2C，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No. 5799。
10.苯乙醇胺A的单克隆抗体，由保藏号为CGMCCNo. 5799的小鼠骨髓杂交瘤细胞株苯乙醇胺A-2C产生。
全文摘要
本发明公开了一种检测苯乙醇胺A的酶联免疫试剂盒。该试剂盒中含有独立包装的苯乙醇胺A的特异性抗体；所述苯乙醇胺A的特异性抗体为以苯乙醇胺A与载体蛋白的偶联物为免疫原得到的多克隆抗体或单克隆抗体。本发明采用ELISA竞争方法定性或定量检测动物尿液、血清、组织(肌肉、肝脏及肾脏)及饲料等样品中苯乙醇胺A药物的残留量；对样品的前处理要求低，动物尿液和血清可直接测定，组织样品和饲料经样品液抽提后即可上样，可同时快速检测大批样品；测定方法简单省时，1小时之内即可得出结果；猪尿中最低检测限为0.5μg/L。本发明具有高特异性、高灵敏度、高精确度、高准确度特点，可在动物性产品苯乙醇胺A药物残留检测中发挥重要作用。
文档编号G01N33/544GK102735834SQ201210146490
公开日2012年10月17日 申请日期2012年5月11日 优先权日2012年5月11日
发明者刘智宏, 张聪敏, 徐士新, 毕言锋, 汪霞, 王旻子, 王鹤佳, 白玉惠, 金银珍 申请人:中国兽医药品监察所