专利名称：丙型肝炎病毒IgM抗体快速检测试纸的制作方法
技术领域：
本实用新型是涉及生物应用技术领域，特别是涉及一种以胶体金免疫 层析法快速检测丙型肝炎病毒IgM抗体快速检测试纸。
背景技术：
HCV是1989年由美国Choo等从受感染的黑猩猩血液标本中最初发现， 主要由血液、体液传播，占输血后肝炎的70%。据世界卫生组织统计，全球 估计约1. 7亿人感染HCV。丙型肝炎慢性化率为50%—85%，其中又有20% 可发展为肝纤维化，�：κ盅现�。我国HCV抗体携带者达4千万左右。 到目前为止丙型肝炎既无有效疫苗，亦无有效的治疗方法，预防感染是唯 一有效的方法。HCV抗体检査和乙肝表面抗原(HBsAg)、人类免疫缺陷病毒 (HIV)抗体及梅毒(TP)抗体检查是我国法定的四个血源性筛查项目，意义十 分重要。
目前HCV抗体检测试剂主要检测HCV IgG。 IgM检测只有为数不多的研 究报道，集中于用酶联免疫吸附分析法(ELISA)进行检测。对IgG检测不能 说明患者是现症感染或既往感染，虽然IgM的检出率为IgG的50%—80%， 但IgM检测阳性基本说明患者是现症感染。除此之外，IgM抗体和体内病毒 复制即HCV RNA检出率相关；和体内体内肝炎发展程度、肝细胞坏死相关； 在对HCV病人治疗过程中，IgM的变化亦提示治疗效果的好坏；另外IgM的 出现和HCV的不同亚型感染相关，因而对HCV IgM检测具有积极的参考意 义。
运用免疫层析胶体金技术检测HCV IgM尚无报道。免疫层析胶体金技 术是新型的诊断技术，已得到较为广泛运用，基本原理如下利用胶体金 标记一种抗原或抗体，在试剂的NC膜上包被相应的配对抗原或抗体，检测 时当样品中含相应的特异性抗体或抗原时，胶体金标记颗�：脱分信涮� 相结合形成复合物，然后在NC膜上层析，再被包被抗原或抗体捕获，形成 肉眼可见的检测(T)线，通过检测线的有无实现对结果的判定。具有操作简 便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。
发明内容
本实用新型的目的是提供一种HCVIgM抗体快速检测试纸，具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现场检测和经济实用等 优点。
本实用新型提供一种HCV IgM抗体快速检测试纸。包括上样垫(l)、紧 密连接于上样垫一端的含有标记HCV混合抗原的胶体金垫(2)、与胶体金垫 的另一端紧密连接的硝酸纤维素(NC)膜(3)和紧密连接于NC膜另一端的吸 样垫(4)， NC膜包被有相互分离的检测(T)线(5)和质控(C)线(6)，上样垫、 胶体金垫、NC膜和吸样垫粘贴到塑料支撑板(7)上形成试纸条，试纸条亦可 以装入塑料卡中形成卡式包装，其特征在于T线为包被在NC膜上的抗人IgM 抗体，胶体金垫为标记的HCV混合抗原构成。
所述的HCV IgM抗体快速检测试纸，其特征在于所述的HCV混合抗原 为重组表达HCV的核心抗原(Core)和非结构蛋白(NS)3抗原，亦可选择性再 加入HCV的NS4、 NS5、 E1和E2区抗原。
所述的HCV IgM抗体快速检测试纸，其特征在于所述的上样垫为玻璃 纤维膜或无纺布，吸样垫由吸水滤纸构成。
所述的HCV IgM抗体快速检测试纸，其特征在于，所述的抗原的包被 方法为以0. 01M pH 7. 2磷酸盐缓冲液(PBS)将抗人IgM抗体配制成lmg/ml 的溶液，用喷膜仪在NC膜下部以lul/cm的参数进行划线，包被T线，同 时在NC膜上部包被抗HCV抗体作为C线。划线后将NC膜在干燥间(温度 20-25。C，湿度小于30%)干燥8-IO小时。
所述的HCV IgM抗体快速检测试纸，其特征在于，所述的混合抗原标 记胶体金颗粒的方法为以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为30 — 50nm 的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金液放在烧杯内，用0.2M K2C03 调至pH8. 0，按100ml胶体金溶液加入lmg HCV重组混合抗原，室温搅拌2 小时，加入1%牛血清白蛋白(BSA) ， 0. 1%聚乙二醇(PEG)20000封闭20min， 12000r/m离心30分钟，弃上清，用胶体金工作液复溶至100ml，按lml溶 液铺22cm2的比例均匀地铺在玻璃纤维膜或无纺布上，再置干燥间(温度 20-25。C，湿度小于30%)干燥2-4小时，制成胶体金垫。
所述的HCV IgM抗体快速检测试纸，其特征在于所述的试纸的装配方 法为在干燥室内(温度20-25。C，湿度小于30%)，取塑料支撑板板，将 已包被的NC膜放置在塑料支撑板的中部粘贴，在NC膜T线一侧搭接胶体 金垫(搭胶体金垫的1/3)粘贴，在胶体金垫另一侧搭接粘贴上样垫(搭胶体金垫的1/5);在NC膜C线一侧搭接吸样垫(搭吸样垫的1/10); 最后用裁剪机将贴好塑料板切成3mm或4mm宽的试纸条。切好的试纸条可 以再装入塑料卡内，形成检测卡。
所述的HCV IgM抗体快速检测试纸，其特征在于，检测方法为将被 检血清或血浆平衡至温室，将试纸条或试剂卡平放，在上样垫上加入50 — 100ul被检样品，样品溶解胶体金并在NC膜上层析，然后用肉眼直接观察 在30分钟内C、 T线的出现情况，并判定检测结果
本实用新型的有益效果是提供一种利用免疫层析胶体金技术检测HCV IgM的新型试纸。采用胶体金标记HCV抗原，包被抗人IgM实现对样品中 HCVIgM的检测。具有操作简便、反应快速、敏感性高、特异性强、适合现 场检测和经济实用等优点。
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图l HCV抗体快速检测试纸结构示意图。 附图符号说明
1:上样垫 2:胶体金垫
3: NC膜 4:吸样垫
5:检测(T)线 6:质控(C)线
7:塑料支撑板具体实施方式
实施例制备HCV IgM抗体快速检测试纸
1主要材料
1.1 HCV的CORE、 NS3融合抗原:美国Biotech Atlantic Inc(BAI.)产品, 用于胶体金标记；鼠抗人IgM，抗HCV抗体军事医学科学院产品，用于 NC膜包被；氯金酸Sigma公司产品；硝酸纤维素(NC)膜Millipore公 司产品；牛血清白蛋白(BSA)，聚乙二醇(PEG)20000，水解酪蛋白Sigma 产品。其它常用试剂均为分析纯试剂。
1.2临床血清由公司在相关医院或血站获得，HCV IgG抗体阳性血清80 份，HCV抗体阴性血清300份。
1.3 HCV IgM抗体检测ELISA试剂盒，美国Abbott产品。 2方法
2.1 HCV重组抗原的胶体金标记氯金酸一柠檬酸三钠还原法制备直径
为40nm的胶体金溶液，制备完成后取三份胶体金，分别用0.2M 1(20)3将溶 液调到pH7.0、 pH8.0和pH9.0。然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌， 按每100ml溶液加入0. 5mg、 lmg、 1. 5mg将重组抗原将蛋白缓慢滴加到胶 体金溶液中，继续搅拌2小时，再滴加入到终浓度为0. 1%的PEG2000和1% 的BSA进行封闭20min，标记结束后以12000 r/m离心，弃上清，沉淀按原 体积复溶至不同配比的胶体金工作液(硼酸盐缓冲液，pH8.0，含BSA、羊血 清，蔗糖和表面活性剂)中。然后将标记胶体金溶液按lml溶液铺22cm'2的 比例加样于无纺布上，在温度20-25°C，相对湿度在<30%的干燥间干燥2-4 小时，制成胶体金垫。
2. 2 鼠抗人IgM的包被用0. 01M pH7. 2 PBS将鼠抗人IgM分别稀释成 0. 5mg/ml、 lmg/ml、 2mg/ml，然后用喷膜仪在NC膜下部按lul/cm进行划 线包被，同时在NC膜上部包被抗HCV抗体，用于产品的质控，包被完成后 将NC膜在在温度20_25°C ，相对湿度在<30%的干燥间干燥8-10小时。 2.3 HCV IgM抗体快速检测试纸的组装在干燥室内(温度20-25°C，相 对湿度<30%)取塑料支撑板，将已包被的NC膜放置在塑料支撑板的中部 粘贴，在NC膜T线一侧搭接胶体金垫(搭胶体金垫的1/3)粘贴，在胶体 金垫另一侧搭接粘贴上样垫(搭胶体金垫的1/5);在NC膜C线一侧搭接 吸样垫(搭吸样垫的1/10);然后用裁剪机将贴好塑料板切成3mm或4mm 宽的试纸条。切好的试纸条可以再装入塑料卡内，形成HCV IgM抗体检测 试剂卡。
2.4检测方法将被检血清或血浆平衡至温室，将制备好的试纸条或试剂 卡平放，在上样垫上加入50 — 100ul被检样品，若样品中含抗HCV IgM抗 体，则和样品垫上的标记HCV抗原的胶体金结合，形成复合物，并扩散到 NC膜上进一步层析，当遇到包被在NC膜上T线处的鼠抗人IgM时，复合物 则又和包被抗IgM抗体结合，被捕获在包被处，当被捕获的胶体金复合物 达到一定数量时，则形成一条肉眼可见的T线；若血清中不含特异性抗体， 则不能形成免疫复合物，亦不能形成T线，C线作为试剂的质控标准，阳性 和阴性样品检测时均会出现。用肉眼直接观察在15、 20、 30和45分钟内C、 T线的出现情况，并判定检测结果。
2.5试纸工艺参数调试将浓度不同标记、包被的试剂进行组合配对，制备小样，利用质控血清对试剂进行测试，发现最佳组合。
2.6临床血清检测用本试剂按检测方法对所有HCV IgG阳性血清、阴性血清进行检测，阳性血清同时用Abbott IgM抗体检测ELISA试剂进行对照检测。3结果
3.1试纸参数确定根据小样的检测结果，确定了试纸的最佳标记pH值为8.0;重组混合抗原的最佳标记量为lmg/100ml胶体金溶液；最佳的胶体金工作液为lOmM硼酸酸盐缓冲液，pH8. 0，含0. 5%BSA、 10%羊血清，2%蔗糖，0. 2% Tween 20;最佳包鼠抗人IgM包被浓度为lmg/ml。检测结果的最佳判定时间为5-30分钟。
3.2临床血清检测以ELISA试剂为对照，80份HCV IgG阳性血清中ELISA检测出IgM阳性血清54份，本试剂检测出阳性为52份，灵敏度=52/54=96.3%;本试剂对300份阴性血清检出假阳性5份，特异性=295/300=98. 3%。分析试剂性能和ELISA试剂相比无显著性差异。
权利要求1、一种丙型肝炎病毒IgM抗体快速检测试纸，包括上样垫(1)、紧密连接于上样垫一端的含有标记HCV混合抗原的胶体金垫(2)、与胶体金垫的另一端紧密连接的硝酸纤维素(NC)膜(3)和紧密连接于NC膜另一端的吸样垫(4)，NC膜包被有相互分离的检测(T)线(5)和质控(C)线(6)，上样垫、胶体金垫、NC膜和吸样垫粘贴到塑料支撑板(7)上形成试纸条，试纸条亦可以装入塑料卡中形成卡式包装，其特征在于T线为包被在NC膜上的抗人IgM抗体，C线为包被在NC膜上的HCV混合抗原构成。
2、 根据权利要求l所述的丙型肝炎病毒IgM抗体快速检测试纸，其特 征在于所述的HCV混合抗原为重组表达HCV的核心抗原(Core)和非结构蛋 白(NS) 3抗原，亦可选择性再加入HCV的NS4、 NS5、 El和E2区抗原。
3、 根据权利要求l所述的丙型肝炎病毒IgM抗体快速检测试纸，其特 征在于所述的上样垫为玻璃纤维膜或无纺布，吸样垫由吸水滤纸构成。
专利摘要本实用新型是涉及生物应用技术领域，特别涉及一种丙型肝炎病毒IgM抗体快速检测试纸。包括上样垫(1)、紧密连接于上样垫一端的含有标记HCV混合抗原的胶体金垫(2)、与胶体金垫的另一端紧密连接的硝酸纤维素(NC)膜(3)和紧密连接于NC膜另一端的吸样垫(4)。NC膜包被有相互分离的检测(T)线(5)和质控(C)线(6)，T线为包被在NC膜上的抗人IgM抗体，C线为包被在NC膜上的抗HCV抗体。检测时将被检样品加在试纸条(卡)上样垫上，然后直接观察免疫反应结果，完成检测。具有操作简便、反应快速、灵敏度高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。
文档编号G01N33/532GK201331529SQ20082007459
公开日2009年10月21日 申请日期2008年4月30日 优先权日2008年4月30日
发明者洲 李, 杨发青 申请人:天津中新科炬生物制药有限公司
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