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专利名称：一种包含抗犬血红蛋白单克隆抗体的诊断试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种单克隆抗体，特别涉及一种抗犬血红蛋白的单克隆抗体。
背景技术：
犬是药物非临床安全性评价中最常用的实验动物之一，药物的胃肠道毒性、肝脏毒性是非临床安全性评价的常规指标，而检查犬粪便隐血是判定药物的胃肠道毒性、肝脏毒性的重要方法。目前犬粪便隐血的检测没有犬专用的检测试剂，只能采用人源性试剂。犬粪便隐血的检测是通过检测待检样本中是否存在犬血红蛋白实现的，但犬血红蛋白和人血红蛋白存在结构上的差异，导致绝大多数检测都出现假阴性结果，严重影响了药物毒性的科学评价。因此，制备犬血红蛋白特异性的检测试剂是一个亟待解决的问题。

发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种犬血红蛋白特异性的检测试剂。本发明提供了一株小鼠杂交瘤细胞株，它是保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No. 4619的细胞株。本发明还提供了一种单克隆抗体，它是由保藏号为CGMCC No. 4619的小鼠杂交瘤细胞株产生的。它属于IgGl型抗体，且轻链为kappa型。本发明的单克隆抗体是通过本发明的小鼠杂交瘤细胞株产生的，因此可以从培养本发明的小鼠杂交瘤细胞株的培养液中获得，或将小鼠杂交瘤细胞株细胞种植到实验动物腹腔产生腹水而获得。本发明还提供了上述单克隆抗体在制备犬血红蛋白检测试剂盒中的用途。本发明还提供了一种试剂盒，其包含上述单克隆抗体。该试剂盒还包括酶标记的抗犬血红蛋白多克隆抗体，所述的酶优选为辣根过氧化物酶。该试剂盒为ELISA试剂盒。本发明提供的试剂盒可用于检测犬血红蛋白。本发明又提供了一种检测犬血红蛋白的方法，该方法是利用前述试剂盒检测待检样本。本发明最后提供了前述试剂盒在检测待检样本是否含有犬血红蛋白中的用途。本发明提供的试剂盒灵敏度高、特异性强、准确度和精密度好、稳定性强，可以特异地、灵敏地检测待检样本中的犬血红蛋白，准确评价药物的胃肠道毒性、肝脏毒性，使药物的非临床安全性评价更加科学、准确。


图1抗犬血红蛋白单克隆抗体的制备流程2犬血红蛋白的SDS-PAGE电泳鉴定图，第2道分子量大的条带为犬血红蛋白β 亚基，分子量小的条带为犬血红蛋白α亚基
图3免疫小鼠产生的抗犬血红蛋白单抗的Western鉴定图，泳道1表示样品为200 倍稀释的M4血清；泳道2表示样品为1000倍稀释的M4血清；泳道3表示样品为5000倍稀释的M4血清；泳道4表示样品为200倍稀释的M5血清；泳道5表示样品为1000倍稀释的 M5血清；泳道6表示样品为5000倍稀释的M5血清图4使用本发明的试剂盒和方法检测5 320ng/mL的犬血红蛋白的标准曲线
具体实施例方式以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。缩写词汇表ELISA :Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，酶联免疫吸附试验；0D:0ptical Density，光密度；％ RE :Relative Error，相对误差百分率；％ CV coefficient ofvariation,变异系数百分率；QC :quality control,质量控制；R2 Coefficient of Correlation, t匿关系 ；SD Standard Deviation, f示 JiII 偏 H ；Hb hemoglobin,血红蛋白。实施例1单克隆抗体的制备抗犬血红蛋白单克隆抗体制备的流程图如图1所示。1、抗原制备分离犬血红细胞，并将其裂解，离心去除细胞碎片，收集上清；上清用Q柱进行分离纯化，盐浓度梯度洗脱，收集不同组分；电泳鉴定，结果如图2所示，收集SDS-PAGE检测犬血红蛋白(犬Hb)纯度大于85%的部分作为免疫用抗原。2、杂交瘤细胞制备免疫动物取六只Bal b/c小鼠(分别为M1-M6)，用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释免疫原，然后与相应的佐剂1 1混合，抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂进行腹腔注射，采用低剂量长程免疫法进行免疫，具体方法为第0星期一预采血完全弗氏佐剂(CFA)乳化的Img抗原免疫小鼠；第2星期不完全弗氏佐剂(IFA)乳化的Img抗原免疫小鼠；第4星期不完全弗氏佐剂(IFA)混合的Img抗原免疫小鼠；第6星期不完全弗氏佐剂(IFA)混合的Img抗原免疫小鼠；第7星期小鼠眼眶采血，分离血清，以步骤1得到的犬血红蛋白为抗原，通过 ELISA法(抗原为10μ g/mL，每孔100 μ 1)检测血清中抗犬血红蛋白抗体的效价，结果见表 1，通过Wfestern法(二抗为酶标驴抗鼠(1 2000)、发光底物为ECL-Plus，曝光时间为1 分钟)检测抗体浓度，检测结果见图3。表IELISA法检测抗小鼠血清抗犬血红蛋白的效价
权利要求
1.一株小鼠杂交瘤细胞株，其特征在于它是保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No. 4619的细胞株。
2.一种单克隆抗体，其特征在于它是由权利要求1所述的杂交瘤细胞株产生的。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于它属于IgGl型抗体，且轻链为 kappa Μ。
4.权利要求2或者3所述的单克隆抗体在制备犬血红蛋白检测试剂盒中的用途。
5.一种试剂盒，其特征在于包括权利要求2或者3所述的单克隆抗体。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于还包括酶标记的抗犬血红蛋白多克隆抗体。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述的酶为辣根过氧化物酶。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒为ELISA试剂盒。
9.一种检测犬血红蛋白的方法，其特征在于该方法是利用权利要求5-8所述的试剂盒检测待检样本。
10.权利要求5-8所述的试剂盒在检测待检样本是否含有犬血红蛋白中的用途。
全文摘要
一种包含抗犬血红蛋白单克隆抗体的诊断试剂盒及其应用，本发明涉及一种单克隆抗体，特别涉及一种抗犬血红蛋白单克隆抗体。本发明提供了一株小鼠杂交瘤细胞株，其是保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.4619的细胞株。本发明还提供了一种由保藏号为CGMCC No.4619的小鼠杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体以及包含该单克隆抗体的试剂盒。本发明提供的试剂盒灵敏度高、特异性强、准确度和精密度好、稳定性强，可以特异地、灵敏地检测待检样本中的犬血红蛋白，准确评价药物的胃肠道毒性、肝脏毒性、造血系统毒性等，使药物的非临床安全性评价更加科学、准确。
文档编号G01N33/577GK102226171SQ20111007645
公开日2011年10月26日 申请日期2011年3月29日 优先权日2011年3月29日
发明者刘斌, 岑小波, 王莉 申请人:成都华西海圻医药科技有限公司